TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER

Isolasi & Pemurnian DNA

Kompetensi yang akan dicapai
Mahasiswa memahami prinsip-prinsip isolasi dan pemurnian DNA bakteri
Bentuk dan fungsi sel ditentukan oleh protein penyusunannya. Sintesis protein sepenuhnya
diatur oleh DNA yang berperan dalam membuat informasi yang diperlukan untuk spesifikasi
setiap struktur protein yang dibentuk oleh sel. Dan memegang peran penting dalam smua
aktivitas sel. Oleh karenanya selain mengandung DNA, ekstrak sel juga mengandung protein
dan RNA
Dalam memurnikan DNA, maka protein dan RNA perlu dihilangkan. Dengan menambahkan
campuran fenol-kloroform (1;1). Organil ini akan mengumpulkan protein dan meninggalkan
DNA dan RNA pada fase air. Setelah pelarut organic ditambakan, kemudian campuran
dikocok perlahan-lahan dan disentrifungsi, sehingga campuran mengandung fenol dan
kloroform, dengan bagian atasnya fase air yang mengandung asam nukleat, sedangkan
gumpalan protein berada pada fase antara.
Tahap paling dalam mengisolasi DNA adalah tahap pemecahan dinding sel untuk
mengeluarkan DNA.
Experiment
1. Sampel : bakteri gram negative (salmonella sp, E. coli)
2. Lysis buffer (0,32 M sukrosa, 1% Triton X-100, 5 mH MgCI2, 10 Mm tris HCL pH 7,4)
3. Rinse Buffer (75 mM NaCI, 50 mM EDTA, pH 8)
4. Digestion buffer (Larutan STES + 0,5 mg/ml Proteinase K)
5. Phenol
6. CIAA (Chloroform : Isoamil-alkohol = 24:1)
7. Alcohol 70 %
8. Larutan TE (10 mM trisHCI); 1 mM EDTA pH 8)
9. Gel agarose 1% dalam TBE 1 x
10. Ethanol absolute
11. Sybr Safe DNA gel stain
12. Apparatus elektroforesis

Cara Kerja
1. Suspense bakteri sebnayak 500 ul ditambah 1 x volume lysis buffer ke dalam eppendorf.
Organel sel dalam larutan diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm
selama 1 menit pada suhu 40 C
2. Supernatant dibuang kemudian pellt ditambah dengan 1 x volume rinse buffer
3. Dilakukan homogenisasi dengan cara spin-up dan spin-down menggunakan micropipette
4. Sentrifugasi pada kecatan 7.000 rpm selama 5 menit pada suhu 40 C
5. Selanjutnya pellet ditambah dengan digestion buffr sebanyak 500 ul, kemudian
diinkubasi dalam waterbath suhu 550 C selama 60 menit. Lakukan homogenisasi dengan
cara digoyang setiap 5 menit
6. Tambahkan larutan fenol 500 ul, dicampur dan digoyang (dengan tangan/jangan
divortex) selama 20 menit. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 13.0000
rpm selama 3 menit pada suhu 40 C
7. Fase bagian atas yang mengandung DNA (terlihat seperti lender) dipindahkan ke tabung
baru kemudian ditambah CIAA, dicampur dan digoyang dengan tangan selama 20 mneit,
sisentrifus 13.000 rpm selama 3 menit 40 C
8. Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambah etanol absolute 2 x
(300-600 ul)
9. Gumpalan DNA diendapkan dengan sentrifus 13.000 rpm selama 30 menit, suhu 40 C
10. Tuang etanol absolute pelan-pelan kemudian endapan dicuci dengan alcohol 70% (1x
volume), disentrifus 13.000 rpm selama 5 menit. DNA yang diperoleh dikeringkan
11. DNA dilarutkan dalam 50 ul buffer TE, dan disimpan pada suhu 20 0 C
12. DNA dilihat kualitasnya dengan dimigrasikan pada gel agarose 1% dengan mengunakan
bifer TBE 1 x pewarnaan Sybr Safe Green
13. Gambaran hasil isolasi DNA yang diperoleh dari pengamatan gel elektroresis (dapat
berupa sketsa foto) dan beri keterangan pada setiap lane.

TEKNIK BIOLOGI MOLEKULAR

Elektroforesis Gel Anggarosa
Kompetensi yang akan dicapai
Mahasiswa mengoperasikan elektroforesis gel agarosa dan memahami prinsip-prinsip yang
mendasari kerja elektroforesis gel agarosa
Elektroforesis digunakan untuk memisahkan molekul atau partikel dalam suatu medan listrik
berdasarkan ukuran dan struktur fisik molekul, terutama protein atau DNA. Pada umumnya
gel yang digunakan adalah agarosa. Keuntungan penggunaan elaktroforesis gel agarosa
adalah mudah penangananya, sederhana dan memerlukan sampel yang relative sedikit (1 ng
DNA). Melalui teknik elektroforesis, lokasi framen DNA dalam gel gel dapat diamati
langsung secara in situ dengan mengunakan pewarba DNA.
Asam nukleat terdiri dari gula-fosfat yang berfungsi structural, dan basa aromatis yang terkait
pada gula. Molekul gula RNA adalah ribose, sedangkan pada DNA berupa deoksiribosa,
dengan basa guanine, adenine dan timin (DNA) atau urasil (RNA). Adanya gugus OH pada
fosfat menyebabkan asam nukleat bermuatan negative pada larutan dengan pH 8,0. Hal ini
memungkinkan pemisahan fragmen asam nukleat mengunakan medan listrik. Agarosa adalah
polimer yang dihasilkan Gracillaria sp, merupakan molekul yang paling sering digunakan
sebagai matriks pembuatan gel karena pada kosentrasi antara 0,7 2% (w/v) memungkinkan
pemisahan fragma DNA untai ganda dengan ukuran antara 100 bp 10 kb. Jarak pemisahan /
gerak DNA tersebut berbanding terbaik dengan log ukuran fragmen DNA. Semakin besar
ukuran molekul, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen fragmen
molekul DNA standar (DNA marke) yang telah diketahui ukurannya.
Untuk memisahkan fragmen DNA atau RNA, agarosa dilarutkan dalam larutan buffer 1%
TAE atau TBE pada suhu 100C, selanjutnya dituang kedalam apparatus elektroforesis.
Dibiarkan hingga memadat sempurna, selanjutnya apparatus diisi dengan buffer TAE atau
TBE . sampai DNA diwarnai dengan 6x loading dye dengan kosentrasi akhir 1x pewarna,
dimasukan ked alam sample wells. Pemisahan fragmen dilakukan selama 30-60 menit
tergantung besarnya arus listrik yang digunakan. Setelah running, visualisasi gel dapat
dilakukan dengan menggunakan pewarna tertentu dan diamati dibawah sinar UV.

Alat dan Bahan :

a. Sampel DNA
b. Gel agarose 1,2% TBE 10 x
c. sybr@ Safe DNA gel stain
d. Loading dye
e. Marker DNA
f. Apparatus elektroforesis
Cara Kerja :
1. Larutkan agarosa sesuai dengan kosentrasi yang dikehendaki dalam buffer TBE,
kemudian dipanaskan hingga mendidih sehingga tampak homogen.
2. Pasangkan penutup rubber casting dams untuk menutup pembukaan pada cetakan gel
ray dengan posisi cetak tegak.
3. Larutan dibiarkan dingin sampai mendekati suhu 50-55C. kemudian ditambahkan cat
pewarna DNA (Sybr@ safe) sebanyak 10%, dan tuangkan larutan gel pada vetakan
gel apparatus.
4. Pasangkan sisir untuk tempat menuang sampel. Kemudian gel dibiarkan mengeras
(sekitar 12-45 menit). Perhatikan, dalam menuang gel harus rata dan tidak terjadi
pembentukan gelembung.
5. Setelah mengeras sisir dilepas dari gel tray, dan tempatkan gel beserta cetakan ke
dalam chamber.
6. Tuangkan buffer TBE sampai gel terendam.
7. Pipet sampel DNA dan loading dye (1:1) dan masukan ke dalam sumur
8. Hubungkan elektroda dengan power supply dan elektroforesis dijalankan pada 90 mv
dalam waktu 1 jam
9. Setelah selesai running, elektroforesis dihentikan. Gel diambil dan lakukan
pengamatan serta dokumentasi hasil menggunakan. Gel-imaging untuk analisis
kualitas dan kuatintas DNAnya.

TEKNIK BIOLOGI MOLEKULAR

PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kompetensi yang akan dicapai :
Terampil mengoperasikan mesin PCR dan memahami teknik dasar amplikasi DNA
Pengantar
Reaksi berantai polymerase yang dikenal dengan sevutan PCR (Polymerase Chain
Reaction) merupakan suatu proses melipatgandakan secara eksponesial suatu gen (atau
sekuen nukkleoida) tertentu melalui proses sintesis enzimatis in vitro. Melalui penggunaan
PCR dapat meningkatkan jumlah gen / urutan DNA berlipat ganda. Untuk setiap gen / urutan
DNA yang diamplikasikan akan meningkat menjadi dua kali lipat jumlahnya, sehingga pada
setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali DNA target.
Reaksi PCR berlangsung secara otomatis dalam suatu mesin yang disebut thermocycter.
Proses PCR merupakan siklus berulang yang meliputi tahapan danaturasi DNA sehingga
rantai DNA beruntai ganda akan terpisah menjadi rantai tunggal, annealing atau proses
penempelan primer pada DNA cetakan, dan ekstensi yaitu proses polimerasi rantai DNA
yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan.
Kunci sukses penemuan teknologi PCR diawali dengan ditemukannya DNA polymerase heatstabile dari bakteri Thermus aquaticus (Taq). Komponen lain yang diperlukan untuk
berlangsungnya reaksi adalah DNA target atau framen DNA yang akan dilipatgandakan, satu
set deoksinukelotida trifosfat (dNTPs), dan oligonukleotida primer spesifik yang
berkomplementer dengan DNA target yang akan mengawali sintesis rantai DNA.

PUSTAKA
Sambrook J. Fritscg EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY
Amarantini C, Sembring L, Kushadiwijaya H, Asmara W, 2011. Identification and
characterization of Salmonella typhi isolates from Siuthwest Sumba District East
Nusa Tenggara based on 165 rRNA gene sequences. Biodiversitas 12:1-6.