INSTRUMEN II

ALAT THERMAL CYCLER

dan
ELEKTROFORESIS

DISUSUN OLEH :
1. YULI FITRYA RAHAYU
2. YULIANI
3. YUNITA R.I
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR
(kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction)
merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA
secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.

Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan
waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang
menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun
1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat
temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang
biokimia dan biologi molekular karena hanya memerlukan jumlah
sampel yang kecil.
Prinsip dasar PCR

DNA sample diamplifikasi dengan metode PCR agar diperoleh DNA dalam
jumlah besar melalui siklus yang berulang-ulang.

Proses PCR terdiri dari 3 tahapan besar, yaitu:

a.Denaturasi adalah proses penguraian materi genetik (DNA/RNA)
dari bentuk heliksnya yang dipisahkan dengan suhu 90-96ºC.
b.Annealing (pelekatan) atau hibridisasi adalah suatu proses
penempelan primer ke DNA template yang sekarang hanya
dalam satu untai.
c.Polimerisasi (sintesis) adalah suatu proses pemanjangan rantai
DNA baru yang dimulai dari primer.
Proses PCR menggunakan beberapa larutan

1. Enzim taq polymeraseberfungsi untuk mengkatalis reaksi polimerisasi

DNA. Enzim polimerase termostabil yang diisolasi dari Thermus
aquaticus (Taq polymerase) merupakan polimerase termostabil yang
pertama kali ditemukan dan saat ini banyak digunakan.
2. dNTP berfungsi dalam eksistensi DNA
3. Buffer PCR berfungsi sebagai penjaga keseimbangan pH medium
4. MgCl2 berfungsi sebagai indicator pewarna saat proses PCR, dan juga
sebagai kofaktor untuk menstimulasi aktivitas DNA polimerase.
prosedur kerja thermal cycler :
1. Tabung apendrof yang steril ukuran 0,2 ml disiapkan
2. Setelah itu aquades yang telah disterilkan sebanyak 11 µl, buffer 1×
sebanyak 2 µl, dNTP sebanyak 2 µl, primer forward dan reserve
masing-masing 2µl, dan template DNA sebanyak 1 µl dimasukan.
3. Kemudian dicampur dengan cara diketuk-ketuk atau di vortex.
4. Setelah bahan tercampur dimasukan enzim taq polymerase sebanyak
0,1 µl dan dicampurkan menggunakan pipet secara perlahan, jangan
sampai terbentuk gelembung udara.
5. Setelah itu mesin thermal cycler yang telah disesuaikan dengan program
yang telah ditentukan, tabung yang sudah siap dimasukan kedalam
thermal cycler saat suhu mesin 80℃, mesin dijalankan sesuai program
yang diinginkan
Pengaturan waktu dan suhu pada mesin thermal cycler untuk 30 siklus adalah
sebagai berikut :
-Sampel PCR dimasukan saat suhu ±80℃.
-Tahapan pertama “hot start” menggunakan suhu 95℃, selama 2 menit.
-Tahapan denaturasi menggunakan suhu 95℃, selama 30 detik.
-Tahapan annealing menggunakan suhu sesuai dengan TM dari primer selama 15
detik (suhu meleleh dari primer tergantung dari banyaknya G &C).
-Tahapan extension I menggunakan suhu 72℃ selama 1,5 menit.
-Tahapan extension II menggunakan suhu 72℃ selama 10 menit.
-Tahap akhir saat suhu sampai 4℃, sampel dikeluarkan dan dimasukan kedalam
freezer kemudian untuk dilanjutkan ke tahap elektroforesis
Elektroforesis

Elekroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas

ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium
yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein.
Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk manganalisis fragmen - fragmen DNA
hasil pemotongan dengan enzim restriksi
Cara kerja elektroforesis :
1. Larutan TEA diambil sebanyak 10 ml dicampur dengan akuades sebanyak 490 ml.
setelah itu buatlah agarose dengan menimbang agar :
- konsentrasi gel 0,8% : - Larutan TAE 1x sebanyak 80 ml
- Agar yang ditimbang 0,64 gr
- Konsentrasi gel 1% : - Larutan TAE 1x sebanyak 80 ml
- Agar yang ditimbang 0,8 gr.
2. Kemudian masing-masing kedua larutan tersebut diaduk dengan menggunakan
magnetic stirrer yg steril
3. Lalu kedua larutan tersebut dipanaskan kedalam hot plate sampai berubah jernih
4. Kemudian setelah jernih agar diangkat dan ditunggu hingga suam-suam kuku lalu
di cetak di aparatus elektroforesis dengan memberikan sisiran pencetak sumur
terlebih dahulu, dan tunggu hingga agar mengeras kemudian pencetak sumur
diangkat dengan perlahan agar agar tidak rusak
4. Setelah itu siapkan sampel DNA yang telah di PCR sebelumnya dalam box ice serta
siapkan juga yellowtip beserta alat lainnya. DNA marker yang digunakan sebanyak
5 µl.
5. Untuk sampel DNA yang digunakan sebanyak 10 µl maka loading dye sebanyak 2
µl, jika sampel DNA sebanyak 5 µl maka loading dye sebanyak 1 µl.
6. Loading dye diambil dan ditempatkan pada kertas parafilm, lalu sampel DNA
diambil sebanyak 10 µl dan campurkan dengan loading dye sampai tercampur lalu
masukan dalam tiap sumuran sampai semua sampel selesai.
7. Setelah semua sampel telah siap dalam sumuran maka siap di-running dengan volt
sebesar ± 40-40, current 90-100, dan dalam waktu running ±1 ½ jam
8. Setelah di-running 1 ½ jam, agar diambil dan direndam dalam larutan E-TBR
dilemari asam selama 15-20 menit, lalu agar dimasukan kedalam gel doc untuk
proses visualisasi dengan bantuan sinar UV.
9. Agar yang sudah digunakan lalu dimasukan dalam beaker glass lalu diencerkan
dengan cara dipanaskan diatas hot plate, kemudian dibuang kedalam botol limbah
yang sudah diberi label.
Hasil pengamatan

Hasil elektroforesis yang telah di PCR

Berikut beberapa kelemahan dan kelebihan teknik PCR ;

1. Kelebihan
a.Memiliki spesifisitas tinggi
b.Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
c.Dapat membedakan varian mikroorganisme
d.Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
e.Mudah di set up

2. Kelemahan
a.Sangat mudah terkontaminasi
b.Biaya peralatan dan reagen mahal
c.Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit
infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten)
d.Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus
untuk melakukannya.