MODUL 4 - ISOLASI DNA

Pendahuluan
...

Cara Kerja:

Penting sebelum digunakan:

- Tambahkan isopropanol (liat pada label botol untuk volumenya) ke GP3 Buffer sesegera
mungkin terlebih dahulu sebelum digunakan pada penggunaan pertama (ketika akan
digunakan).
- Tambahkan ethanol murni untuk mencuci buffer sebelum penggunaan pertama
- Kebutuhan tambahan: tube microsentrifuse, isopropanol dan ethanol murni.

Tahap 1 (​​Tissue Discociation​)

1. Digunting 0,05 mg (sampai maksimal 0,1 g) daun kedelai,
2. Digerus daun pada mortar bersama dengan nitrogen cair secara perlahan-lahan,
3. Digerus sampel daun hingga menjadi bubuk dan dipindahkan sampel bubuk ke
microsentrifuse tube berkapasitas 1,5 mL.

Tahap 2 (​​Lysis)​
1. Campurkan Buffer GP1 atau buffer GPX1 dan RNAse sesegera mungkin (jangan
dicampurkan dahulu bila waktu penggunaan masih lama),
2. Tambahkan 400µl buffer GP1 atau Buffer GPX1 dan 5 µl RNAse A kedalam tube sampel
dan divortex,
3. Diinkubasi pada 60°C selama 10 menit. Selama diinkubasi, dibalikkan tube setiap 5 menit
· ​Pada waktu yang sama, mulai dipanaskan Buffer elution yang dibutuhkan (200 µl
per sampel) pada 60°C (untuk tahap 5: DNA elution),
4. Tambahkan 100 µl Buffer GP2 dan divortex, lalu diinkubasi pada es selama 3 menit
5. Tempatkan filter column pada collection tube lalu ditransfer ke campuran filter column
6. Sentrifuse selama 1 menit pada 1000 x g kemudian ​discard​​ filter column
7. Hati -hati memindahkan supernatant dari collection tube ke tube mikrosentrifuse yang baru

Tahap 3 (​​DNA Binding​)

1. Ditambahkan 1,5 dari volume GP3 Buffer (pastikan isopropanol sudah ditambahkan),
kemudian divortex dengan segera selama 5 detik e.g. tambahkan 750 µl Buffer GP3 ke 500
µl ​of lysate
catatan: jika muncul endapan, hancurkan sesegera mungkin dengan pipet
2. Tempatkan GD Column pada 2 ml Collection tube
3. Ditransfer 700 µl campuran (dan jika ada endapan) pada GD Column
4. Sentrifuse pada 14-16.000 x g selama 2 menit
5. Pindahkan supernatantnya dan tempatkan pada GD column kembali pada 2 ml collection
tube
6. Tambahkan campuran sisa pada GD Column kemudian sentrifuse pada 14-16.000 x g
selama 2 menit
7. Dipindahkan supernatannya dan kemudian tempatkan pada GD column kembali di 2 ml
collection tube

Tahap 4 (​​Wash)​
1. Tambahkan 400 µl W1 Buffer ke GD Column, kemudian sentrifuse pada 14-16.000 x g
selama 30 detik
2. Dipindahkan supernatannya dan kemudian ditempatkan pada GD Column kembali pada 2
ml Collection tube
3. Ditambahkan 600 µl Buffer yang sudah dicuci (pastikan ethanol sudah ditambahkan) ke GD
column
4. Sentrifuse pada 14-16.000 x g selama 30 detik
5. Dipindahkan supernatannya dan ditempatkan GD column kembali pada 3 ml collection tube
6. Sentrifuse selama 3 menit pada 14-16.000 x g untuk mengeringkan matriks column
● Pilihan lain dalam tahapan menghilangkan residu pigmen
- Jika terdapat sisa pigment pada kolum, lalu ikuti langkah berikut:
- Ikuti langkah penambahan pencucian buffer, kemudian ditambahkan 400 µl ethanol
murni pada GD column
- Sentrifuse pada 14-16.000 x g selama 30 detik
- Dipindahkan supernatannya dan kemudian tempatkan GD column kembali ke 2 ml
Collection tube
- Sentrifuse selama 3 menit pada 14-16.000 x g untuk mengeringkan matriks kolum

Tahap 5 (​​DNA elution)​

Volume standar elusi adalah 100 µl. Jika sampel yang digunakan kurang, kurangi
volume elusi (30-50 µl) untuk meningkatkan konsentrasi DNA. Jika dibutuhkan yield DNA yang
tinggi, maka ulangi tahap DNA elution untuk meningkatkan pengembalian DNA dan total volume
elusi nya mencapai 200 µl.
1. Transfer GD column kering untuk membersihkan 1,5 ml tube mikrosentrifuse
2. Tambahkan 100 µl Elution buffer yang sudah dipanaskan atau TE ke bagian tengah
matriks kolum
3. Biarkan selama 3-5 menit untuk meningkatkan elution buffer atau TE sepenuhnya
diserap
4. Sentrifuse pada 14-16.000 x g selama 30 detik untuk mengelusi DNA yang telah
dimurnikan.
 Elektroforesis

Elektroforesis merupakan suatu metode untuk memisahkan molekul berdasarkan tingkat

migrasi molekul oleh aliran listrik. Alat elektroforesis menginjeksikan aliran listrik ke dalam suatu
medium mengandung sampel yang akan dipisahkan. ​Secara umum, elektroforesis digunakan
untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Perlengkapan elektrolisis terdiri dari :

1. Cetakan gel yang digunakan untuk membuat gel agarosa
2. Alat pencetak sumur yang digunakan untuk membuat sumur sumur pada sisi atas dari
gel agarosa
3. Tangki elektroforesis
4. Sumber listrik

Alat dan Bahan (Elektroforesis)

1. Sampel/ Template DNA

2. TAE Buffer 1x
3. Agarose
4. Loading dye
5. DNA Ladder 1 kb
6. Gel Red
7. Es Batu
8​. Deion Water ​Steril
9​. ​Rangkaian alat elektroforesis
10. Vortex
11. ​Cool Box
12. Micropipet 10 mikroliter
13. Pipet tip putih steril
14. Erlenmeyer
15. Gloves
16. Kertas Tissue
Cara Kerja:

1. Pengenceran TAE Buffer 50 x menjadi 1x

Untuk 500 ml = 10 ml TAE 50 x + 490 mL deion steril

2. Pembuatan Gel Agarose 2%

- Larutkan 2 g agarose ke dalam 100 mL TAE 1x di dalam erlenmeyer
- Panaskan di atas ​hot plate magnetic,​ diaduk hingga larut sempurna (bening)
- Angkat dan turunkan suhu sampai hangat
- Masukkan ke dalam sumur elektroforesis
- Ditunggu hingga dingin dan beku
- Tempatkan pada alat elektroforesis

3. Running elektroforesis
-Tempatkan gel pada alat elektroforesis
- Masukkan TAE Buffer 1x sebanyak 400 mL
- Siapkan plastik bening bersih, tempatkan pada meja di depan alat elektroforesis. Rekat
pinggirannya dengan selotip
- Pipet 1 mikroliter loading dye, teteskan di atas plastik
- Pipet 1 mikroliter gel red, teteskan di atas loading dye
- Teteskan 5 mikroliter sampel DNA pada campuran kedua larutan di atas
- Diresuspensi/campur menggunakan mikropipet

4. Menggunakan alat elektroforesis

- Tekan tombol power
- Atur voltase 50V, waktu 25 menit, tekan start
- Biarkan sampai loading dye berada di tengah gel agarose. Jika waktu habis dan belum
sampai, tambahkan waktu 5 menit
- Setelah sampai di tengah, matikan alat
- Angkat dan tempatkan di atas fluoresensi sinar UV
- Potret dan amati

Perhatian:
Jangan menyentuh gel/buffer dalain tangki elektrotoresis bila sumber arus sedang menyala.
---------------------------------------------------Elektroforesis----------------------------------------------------------
 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik untuk memperbanyak urutan DNA tertentu
secara ​in vitro dengan cara pemanjangan primer sebagai prekursor menggunakan DNA
polymerase. Metoda PCR pertama kali diperkenalkan oleh Mullis dkk dari Cetus Corporation
(Williams et al., 1988). Penggunaan PCR sangat terbatas sampai pada akhirnya DNA
polymerase yang stabil pada suhu tinggi ditemukan.
Reaksi PCR memerlukan komponen-komponen sebagai berikut:
1. DNA target
2. Primer
3. Enzim DNA Polymerase
4. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)
5. Bufer reaksi
Reaksi ini dimulai dengan DNA rantai ganda sebagai sumber cetakan (Gambar 2.1). Reaksi
awal berupa reaksi denaturasi (“denaturation”) pada suhu tinggi yang memisahkan DNA rantai
ganda. Dua primer berbeda kemudian menempel pada reaksi yang disebut penempelan primer
(“annealing”). Primer menempel pada daerah ujung 5’ dari masing-masing rantai tunggal
sedemikian rupa sehingga berada pada posisi yang berlawanan. DNA polymerase kemudian
berperan dalam reaksi pemanjangan primer (“extention”) ke arah yang berlawanan. Reaksi
pemanjangan ini memerlukan deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) sebagai sumber
nukleotida untuk pemanjangan rantai. Reaksi terjadi dengan penambahan bufer reaksi yang
sesuai dengan DNA polymerase yang digunakan.

Suatu reaksi PCR biasanya terdiri dari beberapa siklus dengan suhu yang berbeda-beda.
Umumnya satu reaksi PCR didahului oleh satu reaksi denaturasi (90-95​o​C). Reaksi awal
tersebut diikuti oleh beberapa siklus yang terdiri dari reaksi denaturasi, reaksi penempelan
primer (tergantung Tm primer) dan pemanjangan primer (biasanya 72​o​C) kemudian ditutup
kembali oleh satu reaksi pemanjangan (72​o​C). Hasil PCR dapat dianalisis lebih lanjut dengan
metoda elektroforesis.
Bahan dan Alat
Bahan
1. Gotag Master Onix for PCR
2. Primer Forward
3. Primer Reverse
4. Template DNA
5. Air deion steril

Alat
1. Thermal Cycler
2. PCR Tube
3. Mikropipet 10 mL
4. Pipet Tip putih

Cara kerja
1. Pembuatan ​working solution
- Primer = pengenceran 10x, 10 mikroliter primer + 90 mikroliter deion water
- Template DNA = Sampel DNA yang digunakan bergantung pada hasil
pembacaan spektro. Hasil spektro 448.2 mikroliter/mg, sampel DNA 1 mikroliter
2. Pembuatan ​PCR Mix
- Gotag Master Mix 1x, 12.5 mikroliter
- Primer Forward 1x, 1.25 mikroliter
- Primer Reverse 1x, 1.25 mikroliter
- Template DNA 1-5 mikroliter
- Deion Water tergantung DNA
3. Pengoperasian ​Thermal Cycle
- Masukkan tabung eppendorf ke dalam mesin PCR. Mulailah reaksi sesuai
dengan siklus yang diinginkan (Denaturasi awal pada suhu 94​o​C 2 menit, Diikuti
30 siklus: denaturasi selama 15 detik pada suhu 95​o​C, penempelan primer 30
detik pada 55​o​C dan pemanjangan primer pada suhu 72​o​C selama 2 menit; siklus
ini diikuti pemanjangan primer pada suhu 72​o​C selama 7menit
- Setelah selesai, pindahkan ke freezer pada suhu -20​o​C
 - Dilakukan elektroforesis untuk melihat hasil PCR

Daftar Pustaka
Williams, C., Williamson, R., Coulette, C., Loeffler, F., Smith, J., and Ivinson, A. (1988).
Lancet, i, 102.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.