Polymerase Chain Reactions (PCR) dan Elektroforesis

Prinsip PCR:
PCR digunakan untuk keberadaan material genetik dari sel, bakteri, atau virus. Metode
biologi molecular ini digunakan untuk secara cepat membuat jutaan hingga miliaran
salinan dari sampel DNA target. Salinan DNA ini akan meningkat jumlahnya secara
eksponensial melalui serangkaian siklus perubahan suhu. Pada langkah pertama PCR,
dua untai heliks ganda DNA dipisahkan secara fisik pada suhu tinggi dalam proses yang
disebut denaturasi asam nukleat. Pada langkah kedua, suhu diturunkan dan primer
mengikat urutan komplementer DNA. Kedua untai DNA kemudian menjadi cetakan untuk
DNA polimerase untuk secara enzimatik merakit untai DNA baru dari nukleotida bebas,
bahan penyusun DNA.

Berikut adalah contoh amplifikasi SMN Exon 7 gene, yang digunakan mengkonfirmasi
diagnosa klinis autosomal recessive spinal muscular atrophy (Lancet (London,
England) vol. 345,8955 (1995): 985-6.)

Primer:
Forward: R111 = 5’ – AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA – 3’
Reverse: X7-Dra = 5’ –CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTTT– 3’
Amplicon size: 187 bp

Konsentrasi primer: 20 pmol / µL

Reaction mixture:
1. Master Mix (Go tag green) : 15 µL
2. Forward primer : 1 µL
3. Reverse primer : 1 µL
4. dH2O : 11 µL
5. Sample (gDNA in 100ng/ µL) : 2 µL
-------------- +
TOTAL : 30 µL
PCR Condition:

1. Initial denaturation : 94˚C....................... 5 minutes

2. Denaturation : 94˚C....................... 1 minutes
3. Annealing : 56˚C....................... 1 minutes 35x
4. Elongation : 72˚C....................... 1 minutes
5. Final elongation : 72˚C....................... 5 minutes
6. Storage : 4˚C....................... ̴ 99:99
Prinsip elektroforesis:
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi (proses PCR) DNA. Melalui
elektroforesis, fragmen DNA hasil amplifikasi terlihat sebagai potongan pita/band dengan
panjang basa sesuai target PCR.
Elektroforesis DNA mempergunakan medium yang terbuat dari gel agarose. Konsentrasi
agarose yang digunakan dalam pemisahan fragmen DNA sangat mempengaruhi
mobilitas fragmen DNA, semakin besar konsentrasi agarose yang digunakan maka
semakin kecil pori-pori gel, dan semakin kecil konsentrasi agarose maka semakin besar
pori-pori gel.
Molekul DNA yang bermuatan negatif karena adanya gugus fosfat akan bergerak menuju
anode (elektrode bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis.
Pada praktikum ini, hasil elektroforesis dapat divisualisasi dengan menggunakan
pewarna fluoresensi floroview. Secara teknis, setelah agarose 2% dipanaskan dengan
microwave, ditambahkan pewarna floroview yang akan berdifusi ke dalam gel dan
berasosiasi dengan DNA. Floroview mampu berinterkalasi diantara pasang basa
nukleotida pada struktur double heliks dan saat gel hasil elektroforesis disinari dengan
ultraviolet maka fragmen-fragmen DNA yang telah terpisah tampak sebagai band-band
berwarna oranye.

Bahan
1. Agarose
2. Pewarna floresens
3. TBE 1X

V.2 Alat
1. Cetakan gel agarose dan sisirnya
2. Power supply dan elektrodanya
3. Chamber/tangki elektroforesis
4. Mikropipet
5. Gelas erlenmeyer
6. Timbangan
7. Mikrowave
8. Gel doc (UV Transiluminator)

V.3 Prosedur
1. Timbang agarose 2gram masukkan ke dalam Erlenmeyer
2. Tambahkan TBE 1X sebanyak 100ml
3. Panaskan dengan microwave lebih kurang 2 menit
4. Tunggu hingga larut dan suhu ±40°C
5. Tambahkan pewarna fluoresens 5µL
6. Cetak agar pada cetakan
7. Tunggu ± 30 menit
8. Masukkan agar ke dalam chamber elektroforesis
9. Genangi agar dengan larutan TBE 1X hingga agar tercelup semua
10. Masukkan sampel hasil produk PCR, Marker DNA yang akan diperiksa dalam
sumuran
11. . Atur Waktu dan Voltase. Waktu: 30 menit dan Voltase: 100V.
12. Tekan tombol START dan elektroforesis akan berjalan,
13. Angkat agar dan lihat hasil elektroforesis dibawah geldoc (UV
transilluminator).