LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

“AMPLIFIKASI DNA DENGAN TEKNIK PCR”

Tahun Ajaran 2020/2021

Pembimbing :

1. Dewi Inderiati, S.Si., M.Biomed.

2. Ahmad Fahrurrozi, S.Si., M.Sc
3. Indra Lesmana, S.Si., M.Biotech.

Disusun Oleh :
Maulina Afifah
P3.73.34.2.19.023

POLTEKKES KEMENKES JAKARTA III

PRODI D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
Jl. Melati 2 No.15, Jatiwarna, Kec. Pd. Melati, Kota Bks, Jawa Barat 1741

1
DAFTAR ISI
A. JUDUL KEGIATAN................................................................................................3
B. TEMPAT DAN WAKTU PELAKSANAAN..........................................................3
C. TUJUAN...................................................................................................................3
D. METODE..................................................................................................................3
E. PRINSIP KERJA.....................................................................................................3
F. ALAT DAN BAHAN................................................................................................4
1. Alat........................................................................................................................4
2. Reagen...................................................................................................................5
3. Sampel...................................................................................................................5
G. PROSEDUR KERJA...........................................................................................5
H. HASIL PRAKTIKUM.........................................................................................7
I. PEMBAHASAN.......................................................................................................8
J. KESIMPULAN.........................................................................................................8

2
A. JUDUL KEGIATAN
Melakukan Prosedur Pembuatan Mix PCR dan Amplifikasi DNA
serta Pembacaan pada Alat Elektroforesis

B. TEMPAT DAN WAKTU PELAKSANAAN

Hari : Rabu
Tanggal : 8 September 2020
Waktu : 08.30 – 11.50
Tempat : Laboratorium Biologi Molekuler, Gedung TLM
Lantai 5 Poltekkes Jakarta III

C. TUJUAN
Agar mahasiswa/i dapat melakukan prosedur amplifikasi DNA
menggunakan PCR mulai dari melakukan mix PCR hingga pembacaan
pada alat elektroforesis dengan sampel bakteri yang sudah dikultur pada
media agar.
Mahasiswa/i juga dapat mengetahui fungsi dari setiap reagen mix
PCR yang digunakan serta dapat melakukan perhitungan untuk setiap
volume reagen. Mahasiswa/i dapat mengetahui prinsip dari alat PCR
sehingga dapat mengatur waktu dan suhu yang tepat untuk proses
amplifikasi.

D. METODE
Metode yang dilakukan untuk amplifikasi DNA adalah
menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

E. PENDAHULUAN
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah penggandaan strain
DNA secara in vitro (luar sel) dengan prinsip yang sama seperti di dalam
sel. Penambahan DNA berupa kelipatan. PCR pertama kali ditemukan
oleh Kary Mullis 1983, pada Old PCR pertamakali dilakukan

3
menggunakan waterbath, sedangakn Baby blue adalah mesin PCR
automatic pertama.
Replikasi DNA adalah enggandaan DNA yang terjadi di dalam
tubuh dengan bantuan enzim, yaitu: Enzim helikase yang berfungsi untuk
memutuskan ikatan hidrogen pada DNA, enzim primase adalah enzim
yang membentuk RNA pendek sebagai primer untuk proses replikasi dan
enzim polimerase yang akan membantu menggandakan DNA dengan cara
menempelkan dNTP’s berupa nukleutida yang masih terpisah-pisah
menjadi untain strain.
Bahan untuk PCR pertama ada DNA template yaitu sampel yang
akan dilakukan amplifikasi. Kemurnian, kuantitas dan konsentrasi DNA
yang akan di amplifikasi tergantung kebutuhan. Primer bersifat spesifik
pada DNA yang terdiri dari primer forward dan reverse. Polimerase yaitu
enzim untuk memperbanyak DNA. Taq polimerase adalah enzim
polimerase paling murah yang berasal dari bakteri thermus aquarius.
Selanjutnya ada dNTP’s yaitu nukleutida yang terpisah pisah, yang
nantinya akan dibantu oleh enzim polimerase untuk membentuk strain,
dNTP’s terdiri dari dGTP dCTP dATP dTTP. Kemudian ada bahan
tambahan berupa MgCl2 yang berguna untuk membantu enzim bekerja
secara maksimal, ada buffer sebagai larutan penyangga yang akan
menjamin kerja PCR dan terakhir ada Water yang dugunakan untuk
penambahan agar volume sesuai dengan yang KIT butuhkan. Air yang
dibutuhkan adalah air steril dengan 2x penyulingan.

Buatlah mastermix (Bioline™) dengan perhitungan:

Bahan Volume per sampel (µl)
DNA Tamplate 200ng
Primer 1 Forward 0,5
Primer 2 Reverse 0,5
My Taq HS Red Mix, 2x 25
Water (d𝐻2𝑂) Up to 50

4
 Campur semua bahan mix PCR lalu pipet sebanyak 24µl ke dalam
tube PCR. Kemudian masukkan ke dalam alat PCR dengan pengaturan
dan suhu pada tabel.

SUHU WAKTU SIKLUS GRADIENT

DENATURASI AWAL 95˚C 1 Menit 1
DENATURASI 95˚C 15 Detik
ANNEALING 55˚C 15 Detik 25-35 ±3
EXTENSION 72˚C 10 Detik

Setelah proses amplifikasi selesai, lakukan proses elektroforesis

untuk memastikan dan mengkonfirmasi hasil PCR.

F. PRINSIP KERJA
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara
20-30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga
tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:
1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung
pada suhu tinggi (94-96'C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan
DNA menjadi ber berkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini
dilakukan agak lama (sampai 5 menit untuk memastikan semua berkas
DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap
menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1-2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA
template yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu
antara 45-60'C. Penempelan ini bersifat spesifk. Suhu yang tidak tepat
menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini 1--2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari
jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini
biasanya dilakukan pada suhu 76~C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
Lepas dari tahap 3, siklus diulang diulang kembali mulai tahap 1.

5
G. ALAT DAN BAHAN
1. Alat
- Ice Pack - White Tip

- Vorteks
- Mikrotube

- Mikropipet - Tusuk gigi

2. Reagen
- dNTP (dATP, dGTP, dCTP dan dTTP)

Sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses

ekstensi DNA. 
- Primer Forward dan Reverse Primer yang digunakan dalam PCR
adalah 16S rRNA yang bersifat universal berukuran sekitar 1500
bp

6
 Sebagai pemula dalam proses sintesis DNA dalam PCR, atau untuk
mengawali reaksi replikasi DNA pada reaksi PCR. Primer yang
dibutuhkan untuk PCR biasanya satu pasang yaitu
primer forward dan backward.
- DDH2O

DDH2O digunakan untuk menghidrasi agar DNA tidak berada

dalam kondisi kering yang dapat menganggu proses sintesis DNA
oleh enzim Taq Polimerase.

3. Sampel
- Koloni E.Coli

H. CARA KERJA

7
1. Persiapan Mix PCR
- Siapkan alat dan bahan serta APD yang lengkap.
- Sterilkan alat dan bahan serta tangan yang akan bekerja
menggunakan alkohol.
- Beri nama pada microtube menggunakan spidol permanen.
- Pipet dNTP sebanyak 12,5 µl, masukkan kedalam microtube.

- Pipet sebanyak 0,5µl primer 1 dan 0,5µl primer 2 ke dalam

microtube.

- Pipet kembali DDH2O sebanyak 10,5µl ke dalam microtube.

- Tambahkan koloni pada media kultur menggunakan tusuk gigi

sebanyak 1µl.

8
 - Vorteks larutan mix PCR selama 15 detik.

2. Prosedur Pemerograman PCR

- Tekan tombol ON pada alat PCR.
- Tap pada strip Files, kemudian akan muncul menu lain, yaitu;
New, Edit, Copy, dan Detele.
- Tap pada strip New, kemudian akan muncul menu baru, yaitu:
Direktory dan Program. Tap pada strip Program.
- Akan muncul window baru : Edit Program Name, beri nama pada
program maksimal 10 huruf. Kemudian tekan Enter untuk
konfirmasi nama program.
- Akan muncul window baru yaitu: Edit Program. Tap Steps pada
Edit Program.
- Muncul jendela baru. Ketuk bidang input untuk mengaktifkannya.
Isi bidang input suhu waktu dan siklus sesuai dengan tabel
dibawah.
SUHU WAKTU SIKLUS GRADIENT
DENATURASI AWAL 95˚C 1 Menit 1
DENATURASI 95˚C 15 Detik
ANNEALING 55˚C 15 Detik 25-35 ±3
EXTENSION 72˚C 10 Detik
- Setelah diinput kemudian data disave.

9
 3. Prosedur Penggunaan PCR
- Sampel dimasukkan kedalam alat spindown.
- Tutup penutup alat sampai berbunyi klik.
- Nyalakan alat, maka sampel akan berputar, tunggu hingga 15
menit.
- Masukkan sampel ke dalam alat PCR
- Tap pada menu strip Run
- Akan muncul strip menu baru; Start, Stop now, Pause, Continue,
dan Reports. Tap pada menu Start.
- Akan muncul jendela baru Start.
- Tap Start Now, maka tutup akan bergerak turun dan peringatan
akan muncul.
- Area atas layar sentuh menunjukkan sisa waktu berjalan.
- Tap Daftar Langkah akan terlihat langkah mana yang baru saja
aktif.
- Tap Grafik dan akan terlihat profil suhu.
- Tap Info dan akan ada informasi umum.
- Tunggu sampai alat selesai maka proses amplifikasi selesai.

I. HASIL
Didapatkan Hasil amplifikasi 25 mikrolit dengan warna pink
magenta (pink keunguan).

10
J. PEMBAHASAN
Proses awal proses PCR adalah pra-denaturasi, step ini bersifat
opsional tergantung pada alat PCR yang digunakan Proses ini digunakan
untuk mengaktifkan enzim, dan dilakukan hanya 1 siklus di awal.
Selanjutnya tahap denaturasi yang dilakukan pada suhu kisaran 96-
98˚C tergantung pada kit yang digunakan.Pada tahap ini terjadi
pemutusan ikatan hidrogen pada DNA dari double strain menjadi single
strain. Saat suhu sudah kembali normal 50-65˚C strain akan menyatu
kembali.
Kemudian ada tahap annealing/primiring dengan suhu kisaran 58-
52˚C tergantung primer yang digunakan. Primer digunakan sebagai
indikator yang akan menempel pada DNA target yang cocok dengan
susunan DNAnya karena itu primer bersifat spesifik. Primer yang
digunakan dalam PCR adalah 16S rRNA yang bersifat universal
berukuran sekitar 1500 bp. Panjang primer hanya 12-18bp.
Kemudian ada proses inti dari tahap PCR ekstension/elongasi suhu
yang dilakukan pada proses ini adalah mutlak yaitu 72˚C. Proses ini
dilakukan oleh enzim polimerase, enzim ini akan membantu sNTP’s
untuk menempel dan membuat strain baru. Hasil PCR harus mendapatkan
amplikon yaitu produk paling spesifik karena hanya sekuens DNA
spesifik tanpa tambahan. Hasil amplikon terganutng pada hasil DNA yang
diisolasi dan jumlah siklus. Amplikon yang akan dibaca pada alat
elektroforesis, jika tidak terbentuk amplikan bisa jadi primer tidak
spesifik sehingga tidak bisa mencari DNA target, atau memang hasil
negatif karena tidak ada DNA target, atau bisa juga karena proses isolasi
DNA yang gagal. Proses pemanjangan tergantung pada jenis polimerase
umumnya 1-3kb ,sedangkan taq polimerase yang digunakan untuk
praktikum mampu memanjangkan DNA hingga 1kb.

11
K. KESIMPULAN
Dari praktikum biologi molekular yaitu amplifikasi DNA bakteri
dengan prosedur pengunaan PCR mulai dari mix PCR hingga
pemerograman PCR yang kami lakukan pada tanggal 8 September 2020
dengan didapat hasil berupa amplifikasi 25 mikrolit dengan warna pink
magenta (pink keunguan)

12
 Tangerang, 8 September 2020

Mengetahui,
PRAKTIKAN PEMBIMBING

Maulina Afifah
Dewi Inderiati, S.Si., M.Biomed.
(P3.73.34.2.19.023)
NILAI

Ahmad Fahrurrozi, S.Si., M.Sc

Indra Lesmana, S.Si., M.Biotech.

13