LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

PERCOBAAN VII
POLYMERASE CHAIN REACTION(PCR)

OLEH :

NAMA : NANI CANTIKA

STAMBUK : F1D118024
KELOMPOK : IV (EMPAT)
ASISTEN PEMBIMBING : SULISTYANINGSI

PROGRAM STUDI BIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2021
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bioteknologi berfokus pada bidang molekuler dengan memanfaatkan

DNA sehingga muncullah bioteknologi moderen. Ekstraksi DNA merupakan

prosedur rutin dalam analisis molekuler. Masalah-masalah dalam ekstraksi

DNA masih merupakan hal penting yang perlu diatasi. Jumlah dan kualitas

DNA hasil ekstraksi bervariasi tergantung dari spesies tanaman sehingga

mempengaruhi analisis lebih lanjut seperti hibridisasi DNA, pemotongan DNA

dengan enzim restriksi maupun analisis dengan polymerase chain reaction

(PCR).

PCR merupakan metode molekular untuk menggandakan potongan

DNA hingga berjuta kali lipat dalam waktu yang relatif singkat. Penggandaan

tersebut tidak terlepas dari penggunaan enzim dan sepasang primer bersifat

spesifik terhadap DNA target yang akan dilipatgandakan. Sehingga nantinya

dapat digunakan untuk keperluan lain yang berkaitan dengan DNA.

Komponen-komponen yang harus ada dalam proses PCR antara lain DNA

cetakan yaitu potongan DNA yang akan dilipatgandakan, primer yaitu suatu

potongan atau sequence dari oligonukleotida pendek yang digunakan untuk

mengawali sintesis DNA, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas

dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan enzim DNA polimerase yaitu enzim yang

melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA, dan senyawa bufer.

Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah

suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro.

 Amplifikas DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer

oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA suatu sekuens

oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. PCR

memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya

primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template

(cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan dan berasal dari

patogen yang terdapat dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase

merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.

Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung 3’ primer ketika

proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polimerase.

Berdasarkan latar belakang tersebut maka dilakukan praktikum tentang PCR

(Polymerase Chain Reaction).

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Bagaimana mengetahui teknik PCR?

2. Apa saja faktor yang mempengaruhi dalam teknik PCR ?

3. Apa manfaat mengetahui teknik PCR ?

C. Tujuan Praktikum

Tujuan yang ingin dicapai pada praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Untuk mengetahui teknik PCR

2. Untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi dalam teknik PCR

3. Untuk mengetahui manfaat proses pembuatan PCR

D. Manfaat Praktikum

Manfaat yang dapat diperoleh pada praktikum ini adalah sebagai

berikut :

1. Dapat mengetahui teknik PCR.

2. Dapat mengetahui faktor yang mempengaruhi teknik PCR.

3. Dapat mengetahui manfaat teknik PCR.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

A. PCR (Polymerase chain reaction)

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan metode untuk

mengamplifikasi asam nukleat dengan menggunakan perbedaan suhu untuk

menggandakan DNA yang menjadi target. PCR digunakan sebagai alat yang

digunakan untuk aplikasi non medis dan juga medis. Dalam aplikasi medis

mikrobiologi, PCR digunakan sebagai diagnostik untuk mendeteksi atau

mengkarakterisasi penyakit dari sampel spesimen pasien. Prosedur dasar PCR

untuk tujuan tertentu, seperti hot-start yang merupakan teknik untuk

meningkatkan spesifitas, reverse trancriptase PCR (rt-PCR) yang

memungkinkan untuk mengamplifikasi target DNA dan nested PCR yang

dirancang untuk mendapatkan tingkat sensitivitas yang lebih tinggi dari PCR

konvensional (Kurniati, 2019).

B. Tahap PCR

Langkah-langkah PCR meliputi 3 tahap yaitu denaturasi, anneling dan

ekstension. Denaturasi DNA adalah proses terbentuknya DNA utas tunggal

dari DNA utas ganda. Annealing atau penempelan primer bisanya dalam waktu

30-45 detik dengan suhu penepelan 36oC sampai 72oC. Semakin panjang

ukuran primer maka akan semakin tinggi temperaturnya. Tahap terkahir adalah

ekstension merupakan pemanjangan primer dengan pemanjangan DNA primer

dari ujung 3’. Waktu yang umum digunakan sampai terbentuk DNA utas ganda
 5 menit untuk mendapatkan seluruh produk PCR. Produk PCR yang dihasilkan

kemudian dielektroforesis. Hasil elektrfororesis ini dianalisa dengan

membandingkan ketebalan band secara visual (Yuenleni, 2019).

C. Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu teknik dalam proses PCR yang bertujuan untuk

memisahkan dan memurnikan makromolekul khususnya protein dan asam

nukleat. Elektroforesis digunakan dalam bidang molekuler biasanya untuk

memurnikan fragmen DNA, memisahkan Fragmen DNA dan

mengindentifikasi fragmen DNA. Tahapan dalam elektroforesis meliputi

pemanasan gel agarosa dalam microwave, pendinginan gel dan pencetakan

dalam sumur, kemudian dielektroforesis setelah itu diamati dibawah sinar UV

dan dimasukkan dalam Gel Documentation untuk melihat band hasil

amplifikasi. Hasil positif jika terdapat pita DNA yang sejajar dengan marker

520bp dan negative jika tidak terdpat pita pada gel (Sjafaraenan, 2018).

D. Faktor yang Mempengaruhi Teknik PCR

Keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor

yaitu DNA template, primer, MgCl2, enzim polimerase, suhu, waktu dan

jumlah siklus. Konsentrasi template DNA yang terlalu kecil sering

menghasilkan pita DNA amplifikasi yang tipis dan tidak jelas. Enzim

polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA.

Konsentrasi enzim polimerase yang tidak tepat dapat menyebabkan hasil pita

DNA yang smear. Konsentrasi Taq polimerase yang berlebihan dapat

 mengakibatkan amplifikasi DNA non target yang menghasilkan produk yang

tidak spesifik dan jika konsentrasi Taq polimerase rendah menyebabkan proses

amplifikasi berjalan tidak baik atau tidak terjadi amplifikasi DNA (Muhsisni,

2018).

E. Manfaat Teknik PCR

Teknologi PCR memiliki banyka manfaat dalam berbagai bidang

misalnya dibidang pertanian teknik PCR dunagan untuk menganalisis

keragaman genetic tanaman, pembuatan sidik jari DNA tanaman, seleksi

berbantu marka molekuler, deteksi kehadiran patogen tanaman, hingga

rekayasa genetika tanaman. Bidang peternakan, teknik PCR telah membantu

para pemulian ternak untuk menyeleksi hewan-hewan ternak berdasarkan

karakter unggul serta mendeteksi adanya penyakit yang berbahaya bagi ternak.

Bidang kesehatan dan forensik, teknik PCR sangat membantu dalam

mendeteksi patogen berbahaya bagi manusia seperti deteksi Plasmodium

falciparum dan P. vivax yang menjadi penyebab penyakit malaria pada darah

manusia, deteksi virus Corona penyebab penyakit Covid-19, mengidentifikasi

korban tindak kriminal atau kecelakaan pada kasus forensik, hingga

penelusuran orang tua biologis seorang anak (Nugroho, 2019).

 III. METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Sabtu, 18 Juni 2021 pukul 14.00-

selesai WITA yang bertempat di Laboratorium Unit Genetika, Jurusan Biologi,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Halu Oleo,

Kendari, Sulawesi Tenggara.

B. Bahan Prktiikum

Bahan yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada tabel 1.

Tabel 1. Bahan dan Kegunaan

No. Nama Bahan Satuan Kegunaan
1. Sampel DNA µL Sebagai objek amplifikasi DNA
2. Master mix µL Sebagai reagen PCR
3. Primer (reverse dan µL Sebagai bahan PCR menetukan target
forward) perpanjangan rantai DNA
4. Akuades (ddH2O) µL Sebagai bahan pelarut

C. Alat Praktikum

Alat yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 2.

Tabel 2. Alat dan kegunaan

No. Nama Alat Jumlah Kegunaan
1 2 3 4
1. Mesin PCR 1 Untuk mengamplifikasi DNA

Tabel 2.Lanjutan
 1 2 3 4
2. Spindown 1 Untuk mengendapkan atau
menyatukan larutan
3. Sentrifuge 1 Untuk menghomogenkan larutan

4. Tabung eppendorf 7 Untuk menyiapkan sampel

5. Mikropipet 1 Untuk memindahkan larutan dalam
volume kecil (µL) secara akurat
9 Spektrofotometer 1 Untuk mengetahui nilai absorbansi
sampel
10. Erlenmeyer 1 Untuk wadah pembuatan gel agarose
11. Hot plate 1 Untuk memanaskan bahan pembuatan
gel agarose
12 Sumuran + sisir 1 Untuk wadah pencetak gel agarose
13 Set elektroforesis 1 Untuk migrasi DNA berdasarkan berat
molekul
14. Photoporesis 1 Untuk memvisualisasikan pita DNA
15 Alat tulis 1 Untuk menuliskan hasil pengamatan
16. Kamera 1 Untuk mengambil gambar hasil
pengamtan

D. ProsedurKerja

Prosedurkerjapadapraktikuminiadalahsebagaiberikut:

1. Pelaksanaan PCR

a. Memasukkan 5 µL master mix kedalam tabung eppendorff (0,5 mL).

Lalu menambahkan 3 µL dH2O

b. Menambahkan primer reverse dan forward masing-masing 0,5 µL

c. Menambahkan 1 µL sampel DNA (DNA template) sehingga volume total

dalam tabung eppendorff mencapai 10 µL

d. Menghomogenkan sampel dengan vortex pada 1000 rpm selama 9 detik

(setiap 3 detik tabung di angkat)

e. Melakukan sentrifuge sampe dengan menggunakan spindown

f. Memasukkan tabung eppendorff campuran sampel kedalam alat PCR

 g. Melakukan setting-an alat untuk kondisi PCR dan jumlah siklus yang

dipakai sebanyak 30 siklus

h. Melakukan pengujian kualitas sampel hasil PCR

2. Elektroforesis

a. Membuat gel agarosa 1% (g/v), dengan cara menimbang bubuk agarosa

0,3 gram dan memasukkan bubuk agarosa tersebut kedalam Erlenmeyer

b. Menambahkan 30 mL TAE 1x kedalam Erlenmeyer berisi bubuk agarosa

c. Memanaskan bahan hingga larut sempurna di atas hot plate

d. Mendinginkan bahan hingga hangat-hangat kuku

e. Menuangkan bahan kewadah pencetak yang telah di lengkapi sisir

membentuk sumuran

f. Mendiamkan bahan hingga memadat membentuk struktur gel (gel

agarosa)

g. Memasukkan gel agarosa kedalam bak elektroforesis dan menambahkan

TAE 1x hingga gel agarosa terendam

h. Melakukan suspensi sampel DNA dengan loading dye, kemudian

memasukkannya kedalam sumuran gel agarosa

i. Melakukan elektroforesis dengan cara mengalirkan listrik 100 volt, 80 A

selama 30 menit pada bak elektroforesis yang telah berisi sampel DNA

j. Setelah 30 menit, merendam gel agarosa berisi sampel DNA pada larutan

EtBr (Ethidium bromide) selama 5 menit, lalu merendamnya kedalam

akuades selama 3 menit.

k. Melakukan pembacaan hasil elektroforesis dengan photophoresis

l. Mengambil gambar hasil photophoresis berupa pita-pita DNA yang

berpendar

m. Mencatat dan mendokumentasikan hasil pengamatan.

 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Hasil pengamatan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 3.

Tabel 3.Hasil pengamatan elektroforesis produk PCR

Gambar
No. Keterangan
Pengamatan Literatur

1 2 3 4
1. 1. Sumuran
2. Produk PCR
1 3. Agerose

2
3

Berhasil (Peloa dkk., 2015)

B. Pembahasan

Teknik PCR pada sampel DNA dilakukan dengan 2 tahap yakni pelaksaan

PCR dan elektroforesis. Pelaksanaan PCR prosesnya meliputi pembentukan utas

tunggal, terjadi penempelan dan pemanjangan rantai di awali dengan membuat

larutan sampel dengan 5 µL master mix dimasukkan kedalam tabung eppendorff

(0,5 mL) ditambahkan 3 µL dH2O, primer reverse dengan forward masing-masing

0,5 µL, 1 µL sampel DNA (DNA template) sehingga volume total dalam tabung

eppendorff mencapai 10 µL. Sampel dihomogenkan dengan vortex pada 1000 rpm

selama 9 detik dan setiap 3 detik tabung di angkat, setelah itu sampel di sentrifuge

dengan menggunakan spindown. Tabung eppendorff campuran sampel

dimasukkan kedalam alat PCR, mengatur PCR dan jumalh siklus 30 kemudian

diuji kualitas sampel hasil PCR dan dielektroforesis.

Tahap dalam elektroforesis merupakan tahap pemisahan atau pemurnian

sampel target. Prosesnya dengan membuat gel agarosa 1% (g/v), dengan cara

menimbang bubuk agarosa 0,3 gram dan memasukkan bubuk agarosa tersebut

kedalam Erlenmeyer, ditambahkan 30 mL TAE sebagai larutan penyangga

kemudian dipanaskan hingga larut. Sampel didinginkan setelah itu dituang dalam

wadah pencetak yang di lengkapi sisir bentuk sumuran kemudian didiamkan

sampai membentuk gel. Gel agarosa yang terbentuk dimasukan dalam bak

elektroforesis dan ditambahkan TAE 1x hingga gel agarosa terendam, sampel

kemudian di suspensi dengan loading dye, kemudian memasukkannya kedalam

sumuran gel agarosa. Elektroforesis dilakukan dengan mengalirkan listrik 100

volt, 80 A selama 30 menit. Setelah itu, merendam gel agarosa berisi sampel DNA

pada larutan EtBr (Ethidium bromide) selama 5 menit, lalu merendamnya

kedalam akuades selama 3 menit dan membaca l hasil elektroforesis dengan

photophoresis

Berdasarkan hasil pengamatan pada gambar hasil PCR menunjukkan

bahwa pada setiap sumuran terdapat pita atau produk PCR dari sampel DNA.

Pada pola pita yang tebal dan tidak smear dengan panjang sekuen nya, hal ini

menandakan bahwa sampel DNA dapat teramplifikasi dengan baik. Keberhasilan

amplifikasi DNA dengan PCR ditentukan oleh beberapa faktor yaitu, kemurnian

dan konsentrasi komponen dalam larutan premix PCR, primer oligonukleotida

gen, jumlah dan kemurnian DNA sampel, faktor teknis dan non-teknis misalnya

kontaminasi.

Komponen PCR yang juga sangat menentukan keberhasilan dari

amplifikasi PCR adalah DNA template. DNA template yaitu untai DNA yang

dijadikan sebagai cetakan untuk melipatgandakan jumlah untai DNA target DNA

template yang terlalu sedikit menyebabkan DNA target tidak dapat teramplifikasi

karena tidak menutup kemungkinan bahwa primer sama sekali tidak menempel

pada DNA target. DNA template yang terlalu banyak juga tidak akan

menghasilkan produk PCR yang baik. Hal tersebut terjadi karena primer tidak

menempel pada gen target yang sesungguhnya, sehingga kemungkinan

teramplifikasinya gen lain yang mirip dengan gen target dapat terjadi.

Menurut Muhsini, 2018 menyatakan bahwa konsentrasi ion Mg 2+

berpengaruh besar terhadap spesifisitas dan jumlah produk (yield) PCR.

Umumnya jika ion Mg2+ kurang akan menurunkan yield, sedangkan jika ion Mg2+

berlebih akan menghasilkan produk non spesifik. Magnesium mempengaruhi

penempelan primer serta aktifitas enzim. Kondisi optimal PCR untuk fragmen

DNA yaitu pada konsentrasi ion MgCl2 1,5 µM.

 V. PENUTUP

A. Simpulan

Simpulan pada praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Proses dalam teknik PCR meliputi pelaksanaan PCR dan dan elektroforesis.

Pelaksanaan PCR dengan pembuatan larutan sampel kemudian

dihomogenkan, setelah itu di sentrifus dan tabung dimasukkan dalam alat

PCR. Menseting alat dan melakukan pengujian kualitas sampel hasil PCR.

Elektroforesis dengan membuat gel agarosa dengan penambahan larutan

buffer, dipanaskan diatas hot plate, didinginkan, dituang dalam cetakan

sumuran, didiamkan sampai membentuk gel kemudian dimasukkan dalam

elektroforesis, sampel DNA di suspensi dengan loading dye kemudian

dimasukkan kedalam sumuran gel agarosa dan melakukan elektroforesis dan

membaca hasil elektroforesis dengan photophoresis.

2. Faktor faktor yang mempengaruhi dalam teknik PCR adalah DNA

template, primer, MgCl2, enzim polimerase, suhu, waktu dan jumlah siklus.

Kemurnian dan konsentrasi komponen dalam larutan premix PCR, primer

oligonukleotida gen, jumlah dan kemurnian DNA sampel, faktor teknis dan

non-teknis misalnya kontaminas.

3. Manfaat dalam teknik PCR adalah untuk mendiagnosa penyakit,

pemulian tanaman dan hewan, rekayasa genetik serta mengetahui kualitas

suatu makanan.
B. Saran

Saran yang dapat saya sampaikan pada praktikum ini adalah praktikan

diharapkan dapat memahami teknik PCR dengan baik dan asisten dapat

memberikan masukkan dalam praktikum teknik PCR.

 DAFTAR PUSTAKA

Kurniati, A., Dewi, D.N.S.S. dan Purwani, N.N., 2019, Deteksi Cepat dan
Spesifik Mycobacterium tuberculosis Menggunakan Polymerasi Chain
Reaction, Journal of Vocational Health Studies, 3: 83–8

Muhsinin, S., Sulastri, M.M. dan Supriadi, D., 2018, Deteksi Cepat Gen InvA
pada Salmonella spp. Dengan Metode PCRm, Jurnal Sains Farmasi dan
Klinis, 5(3): 191–200

Nugroho, K., Widyajayantie, D., Ishthifaiyyah, S.A., Aprilian, E., 2019,

Pemanfaatan Teknologi Droplet Digital PCR (ddPCR) dalam Kegiatan
Analisis Molekuler Tanaman, Jurnal Bios Logos, 11 (1): 28 – 40

Sjafaraenan, Lolodatu, H., Johannes, E., Agus, R. dan Arfan Sabran., 2018, Profil
DNA Gen Follicle Stimulating Hormone Reseptor (FSHR) pada Wanita
Akne dengan Teknik PCR dan Sekuensing DNA, Jurnal Biologi Makassar,
3(1): 1-11

Yuenleni., 2019, Langkah-Langkah Optimasi PCR, Jurnal Laboratorium

Indonesia, 1(3): 51-56