Wizard Genomic Dna Purification Kit Protocol - En.id

Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
MANUAL TEKNIS
Penyihir®Kit Pemurnian
DNA Genom
Petunjuk Penggunaan Produk
A1120, A1123, A1125 dan A1620
Direvisi 19/3
TM050
Penyihir®Kit Pemurnian
DNA Genom
Semua literatur teknis tersedia di: www.promega.com/protocols/
Kunjungi situs web untuk memverifikasi bahwa Anda menggunakan versi terbaru dari Manual Teknis ini. Email
Layanan Teknis Promega jika Anda memiliki pertanyaan tentang penggunaan sistem ini: techserv@promega.com
1. Deskripsi ................................................................... ................................................................... ........................................ 1
2. Komponen Produk dan Kondisi Penyimpanan ......................................... ................................................... 2
3. Protokol untuk Isolasi DNA Genom .................................................. ................................................................... ...... 4

3.A. Mengisolasi DNA Genom dari Darah Utuh (Volume Sampel 300µl atau 3ml) ........................................ 4
3.B. Mengisolasi DNA Genom dari Darah Utuh (Volume Sampel 10ml) .................................................. ......... 6
3.C. Mengisolasi DNA Genomik dari Darah Utuh (piring 96-sumur) ........................................ ........................ 8
3.D. Isolasi DNA Genom dari Sel Kultur Jaringan dan Jaringan Hewan ........................................ ... 10
3.E. Mengisolasi DNA Genom dari Jaringan Tumbuhan .................................................. ........................................ 12
3.F. Mengisolasi DNA Genom dari Ragi .................................................. ................................................... 13
3.G. Isolasi DNA Genom dari Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif................................................ 14
4. Pemecahan Masalah ............................................................ ................................................................... ................................... 15
5. Referensi............................................................ ................................................................... ................................................... 16
6. Lampiran................................................................... ................................................................... ........................................ 17

6.A. Komposisi Buffer dan Solusinya.............................................. ............................................ 17
6.B. Produk-produk terkait ................................................ ................................................................... .................... 17
7. Ringkasan Perubahan ................................................... ................................................................... ......................... 17
1. Deskripsi
Penyihir®Kit Pemurnian DNA Genom dirancang untuk isolasi DNA dari sel darah putih (Bagian 3.A, B dan C), sel kultur jaringan
dan jaringan hewan (Bagian 3.D), jaringan tumbuhan (Bagian 3.E), ragi (Bagian 3.F), dan bakteri Gram positif dan Gram
negatif (Bagian 3.G). Tabel 1 mencantumkan hasil khas untuk DNA yang dimurnikan dari masing-masing sumber ini.
Penyihir®Kit Pemurnian DNA Genom didasarkan pada proses empat langkah (1). Langkah pertama dalam prosedur
pemurnian melisiskan sel dan inti. Untuk isolasi DNA dari sel darah putih, langkah ini melibatkan lisis sel darah merah
dalam Solusi Lisis Sel, diikuti oleh lisis sel darah putih dan intinya dalam Solusi Lisis Inti. Langkah pencernaan RNase
dapat disertakan saat ini; ini opsional untuk beberapa aplikasi. Protein seluler kemudian dihilangkan dengan langkah
pengendapan garam, yang mengendapkan protein tetapi meninggalkan DNA genomik dengan berat molekul tinggi
dalam larutan. Akhirnya, DNA genom dipekatkan dan dihilangkan garamnya dengan presipitasi isopropanol.
DNA yang dimurnikan dengan sistem ini cocok untuk berbagai aplikasi, termasuk amplifikasi, pencernaan dengan
restriksi endonuklease dan hibridisasi membran (misalnya, Southern dan dot/slot blots).
Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 AS · Bebas Pulsa di AS 800-356-9526 · 608-274-4330 · Faks 608-277-2516 1
www.promega.com TM050 · Direvisi 19/3
2. Komponen Produk dan Kondisi Penyimpanan
Isolasi Skala Kecil (minipreps)
PRODUK UKURAN KUCING. #
Penyihir®Kit Pemurnian DNA Genom 100 isolasi A1120

Setiap sistem mengandung reagen yang cukup untuk 100 isolasi DNA genom dari300µldari sampel darah
utuh. Termasuk:
• 100ml Solusi Lisis Sel
• 50ml Solusi Lisis Inti
• 25ml Solusi Pengendapan Protein
• 50ml Solusi Rehidrasi DNA Solusi
• 250µl RNase A

Setiap sistem mengandung reagen yang cukup untuk 500 isolasi DNA genom dari300µldari sampel darah
utuh. Termasuk:
• 500ml Solusi Lisis Sel
• 250ml Solusi Lisis Inti
• 100ml Solusi Rehidrasi DNA Solusi
• 1,25ml RNase A
Isolasi Skala Besar (maxiprep)

Setiap sistem mengandung reagen yang cukup untuk 100 isolasi DNA genom dari10mldari sampel darah
utuh. Termasuk:
• 3L Solusi Lisis Sel
• 1L Solusi Lisis Inti
• 150ml Solusi Rehidrasi DNA
Catatan:Cat.# A1620 tidak termasuk Solusi RNase A.
Item Tersedia Secara Terpisah
Solusi Lisis Sel 1L A7933

Solusi Lisis Inti 1L A7943
Solusi Pengendapan Protein 350ml A7953
Solusi Rehidrasi DNA 50ml A7963
RNase A (4mg/ml) 1ml A7973
Kondisi penyimpanan:Simpan Penyihir®Kit Pemurnian DNA Genom pada suhu kamar (15–30°C). Lihat label produk untuk
tanggal kedaluwarsa.
2 Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Bebas Pulsa di USA 800-356-9526 · 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 TM050 ·
Revisi 19/3 www.promega.com
Tabel 1. Hasil DNA dari Berbagai Bahan Awal.
Jumlah Awal
Spesies dan Bahan Bahan Hasil DNA Khas Perawatan RNase
Darah Utuh Manusia
(Hasil tergantung pada 300µl 5–15µg Opsional
jumlah sel darah putih 1.0ml 25–50µg Opsional
yang ada) 10.0ml 250–500µg Opsional
piring 96-sumur 50µl/sumur 0,2–0,7µg Opsional
(Proses sesedikit 20µl/
sumur; lihat Tabel 2.)
Darah Utuh Tikus
EDTA (4%) dirawat 300µl 6µg Opsional
Heparin (4%) diobati 300µl 6–7µg Opsional
piring 96-sumur 50µl/sumur 0,2–0,7µg Opsional
Garis Sel
K562 (manusia) 3 × 106sel 15–30µg Yg dibutuhkan
COS (monyet hijau Afrika) 1,5 × 106sel 10µg Yg dibutuhkan
NIH3T3 (tikus) 2.25 × 106sel 9,5-12,5µg Yg dibutuhkan
PC12 (pheochromocytoma tikus) 8,25 × 106sel 6µg Yg dibutuhkan
CHO (hamster) 1-2 × 106sel 6–7µg Yg dibutuhkan
Jaringan Hewan
hati tikus 11mg 15-20µg Yg dibutuhkan
Ekor Tikus 0.5–1.0cm ekor 10–30µg Opsional

Serangga
sel sf9 5 × 106sel 16µg Yg dibutuhkan
Jaringan Tumbuhan
Daun Tomat 40mg 7–12µg Yg dibutuhkan
Bakteri Gram Negatif

Escherichia coliJM109 1ml 20µg Yg dibutuhkan
budaya semalam, 5ml 75–100µg Yg dibutuhkan
~2 × 109sel/ml
20µg Yg dibutuhkan
Enterobacter cloacae 1ml
75–100µg Yg dibutuhkan
budaya semalam, 5ml
~6 × 109sel/ml
Bakteri Gram Positif
Staphylococcus epidermis 1ml 6–13µg Yg dibutuhkan
budaya semalam,
~3,5 × 108sel/ml
Ragi
Saccharomyces cerevisiae 1ml 4,5–6,5µg Yg dibutuhkan
budaya semalam,
~1,9 × 108sel/ml
3. Protokol untuk Isolasi DNA Genom
Kami menguji pemurnian DNA genom dari seluruh darah segar yang dikumpulkan dalam tabung antikoagulan EDTA,
heparin dan sitrat dan mendeteksi tidak ada efek samping pada manipulasi DNA berikutnya, termasuk PCR (2). Sampel
darah antikoagulan dapat disimpan pada suhu 2-8°C hingga dua bulan, tetapi hasil DNA akan berkurang dengan
bertambahnya lama penyimpanan.
Protokol di Bagian 3.A telah dirancang dan diuji untuk sampel darah hingga volume 3ml. Protokol di Bagian 3.B telah dirancang
dan diuji untuk sampel darah hingga volume 10ml. Hasil DNA genomik akan bervariasi tergantung pada jumlah sel darah putih
yang ada. Darah beku dapat digunakan dalam protokol berikut, tetapi hasil mungkin lebih rendah daripada yang diperoleh
dengan menggunakan darah segar, dan Solusi Lisis Sel tambahan mungkin diperlukan.
Peringatan:Saat menangani sampel darah (Bagian 3.A, B dan C), ikuti prosedur yang direkomendasikan di institusi Anda untuk
bahan biohazardous atau lihat referensi 3.
3.A. Mengisolasi DNA Genom dari Darah Utuh (Volume Sampel 300µl atau 3ml)
Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

• tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml steril (untuk 300µl sampel darah)
• tabung centrifuge 15ml steril (untuk sampel darah 3ml)
• penangas air, 37°C
• isopropanol, suhu kamar
• 70% etanol, suhu kamar
• penangas air, 65 °C (opsional; untuk rehidrasi DNA cepat)
1. Untuk Volume Sampel 300µl: Tambahkan 900µl Cell Lysis Solution ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5ml steril.
Untuk Volume Sampel 3ml: Tambahkan 9.0ml Cell Lysis Solution ke dalam tabung centrifuge 15ml steril.
! Penting:Darah harus dikumpulkan dalam tabung antikoagulan EDTA, heparin atau sitrat untuk mencegah pembekuan.
2. Goyangkan tabung darah secara perlahan hingga tercampur rata; kemudian pindahkan darah ke tabung yang berisi Cell Lysis Solution.
Balikkan tabung 5-6 kali untuk mencampur.
3. Inkubasi campuran selama 10 menit pada suhu kamar (balikkan 2-3 kali sekali selama inkubasi) untuk melisiskan sel
darah merah. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 20 detik pada suhu kamar untuk 300µl sampel. Centrifuge
pada 2.000× gselama 10 menit pada suhu kamar untuk 3 ml sampel.
4. Buang dan buang supernatan sebanyak mungkin tanpa mengganggu pelet putih yang terlihat. Kira-kira 10–20µl
cairan sisa akan tertinggal di dalam tabung 1,5ml (300µl sampel). Kira-kira 50–100µl sisa cairan akan tertinggal di
dalam tabung 15ml (sampel 3ml).
Jika sampel darah telah dibekukan, ulangi Langkah 1-4 sampai pelet berwarna putih. Mungkin ada beberapa kehilangan DNA
dari sampel beku.
Catatan:Beberapa sel darah merah atau puing-puing sel mungkin terlihat bersama dengan sel darah putih. Jika pelet tampaknya
mengandunghanya sel darah merah, tambahkan alikuot tambahan Solusi Lisis Sel setelah menghilangkan supernatan di atas
pelet sel, dan kemudian ulangiLangkah 3-4.
5. Vortex tabung dengan kuat sampai sel darah putih disuspensikan kembali (10–15 detik).
!Sepenuhnya resuspend sel darah putih untuk mendapatkan lisis sel yang efisien.
6. Tambahkan Nuclei Lysis Solution (300µl untuk volume sampel 300µl; 3,0ml untuk volume sampel 3ml) ke dalam tabung yang berisi sel-sel
yang disuspensikan kembali. Pipet larutan 5-6 kali untuk melisiskan sel darah putih. Solusinya harus menjadi sangat kental. Jika
gumpalan sel terlihat setelah pencampuran, inkubasikan larutan pada suhu 37°C sampai gumpalan tersebut hilang.
Jika gumpalan masih terlihat setelah 1 jam, tambahkan Larutan Nuclei Lysis tambahan (100µl untuk volume sampel 300µl;
1,0ml untuk volume sampel 3ml) dan ulangi inkubasi.
7. Opsional:Tambahkan Larutan RNase (1,5µl untuk volume sampel 300µl; 15µl untuk volume sampel 3ml) ke lisat nuklir,
dan campur sampel dengan membalik tabung 2–5 kali. Inkubasi campuran pada suhu 37°C selama 15 menit, lalu
dinginkan hingga suhu kamar.
8. Tambahkan Solusi Pengendapan Protein (100µl untuk volume sampel 300µl; 1,0ml untuk volume sampel 3ml) ke lisat nuklir,
dan vortex dengan kuat selama 10-20 detik. Gumpalan protein kecil mungkin terlihat setelah vortexing.
Catatan:Jika Solusi Nuclei Lysis tambahan ditambahkan dalamLangkah 6, tambahkan total 130µl Protein Precipitation
Solution untuk volume sampel 300µl dan 1.3ml Protein Precipitation Solution untuk volume sampel 3ml.
9. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 3 menit pada suhu kamar untuk volume sampel 300µl. Centrifuge di
2.000× gselama 10 menit pada suhu kamar untuk volume sampel 3ml.
Pelet protein coklat tua harus terlihat. Jika tidak ada pelet yang diamati, lihat Bagian 4.
10. Untuk volume sampel 300µl, pindahkan supernatan ke tabung mikrosentrifus 1,5ml bersih yang berisi 300µl
isopropanol suhu kamar. Untuk volume sampel 3ml, pindahkan supernatan ke tabung sentrifus 15ml yang
berisi isopropanol suhu kamar 3ml.
Catatan:Beberapa supernatan mungkin tetap berada di tabung asli yang berisi pelet protein. Biarkan cairan sisa ini di dalam tabung
untuk menghindari kontaminasi larutan DNA dengan protein yang diendapkan.
11. Campurkan larutan secara perlahan dengan cara inversi sampai untaian DNA seperti benang putih membentuk massa yang terlihat.
12. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 1 menit pada suhu kamar untuk 300µl sampel. Centrifuge pada 2.000× g
selama 1 menit pada suhu kamar untuk 3ml sampel. DNA akan terlihat sebagai pelet putih kecil.
13. Tuang supernatan, dan tambahkan satu volume sampel etanol 70% suhu kamar ke DNA. Balikkan tabung beberapa kali dengan
hati-hati untuk mencuci pelet DNA dan sisi-sisi tabung mikrosentrifugasi. Centrifuge seperti pada Langkah 12.
14. Aspirasi etanol dengan hati-hati menggunakan pipet Pasteur yang ditarik atau ujung pipet pengurutan. Pelet DNA sangat
longgar pada titik ini dan harus berhati-hati untuk menghindari aspirasi pelet ke dalam pipet. Balikkan tabung di atas
kertas penyerap bersih dan keringkan pelet selama 10-15 menit.
15. Tambahkan Larutan Rehidrasi DNA (100µl untuk volume sampel 300µl; 250µl untuk volume sampel 3ml) ke dalam tabung dan rehidrasi
DNA dengan menginkubasi pada 65°C selama 1 jam. Campur larutan secara berkala dengan mengetuk tabung dengan lembut.
Atau, rehidrasi DNA dengan menginkubasi larutan semalaman pada suhu kamar atau pada 4°C.
16. Simpan DNA pada 2–8°C.
3.B. Mengisolasi DNA Genom dari Darah Utuh (Volume Sampel 10ml)
Kit skala besar tersedia untuk memproses hingga 1 liter darah lengkap (Kat.# A1620). Kit ini tidak termasuk Solusi
RNase karena langkah destruksi RNase bersifat opsional. Solusi RNase A (4mg/ml) tersedia sebagai item terpisah (Cat.#
A7973). Jika diperlukan, total 5ml larutan RNase A diperlukan untuk memproses 1 liter darah.

• tabung centrifuge 50ml steril
1. Untuk sampel darah utuh 10ml: Tambahkan 30ml Cell Lysis Solution ke dalam tabung centrifuge 50ml steril.
!Penting:Darah harus dikumpulkan dalam tabung antikoagulan EDTA, heparin atau sitrat untuk mencegah pembekuan.
2. Goyangkan tabung darah secara perlahan hingga tercampur rata; kemudian pindahkan 10ml darah ke dalam tabung yang berisi Cell
Lysis Solution. Balikkan tabung 5-6 kali untuk mencampur.
3. Inkubasi campuran selama 10 menit pada suhu kamar (balikkan 2-3 kali sekali selama inkubasi) untuk melisiskan sel
darah merah. Centrifuge pada 2.000× gselama 10 menit pada suhu kamar.
4. Buang dan buang supernatan sebanyak mungkin tanpa mengganggu pelet putih yang terlihat. Sekitar
1.4ml cairan sisa akan tetap ada.
Jika sampel darah telah dibekukan, tambahkan 30 ml Larutan Lisis Sel tambahan, balikkan 5-6 kali untuk mencampur, dan
ulangi Langkah 3-4 sampai pelet hampir putih. Mungkin ada beberapa kehilangan DNA dalam sampel beku.
Catatan:Beberapa sel darah merah atau puing-puing sel mungkin terlihat bersama dengan sel darah putih. Jika pelet tampaknya
mengandunghanya sel darah merah, tambahkan alikuot tambahan Solusi Lisis Sel setelah menghilangkan supernatan di atas
pelet sel, dan kemudian ulangiLangkah 3-4.
5. Vortex tabung dengan kuat sampai sel darah putih disuspensikan kembali (10–15 detik).
!Sepenuhnya resuspend sel darah putih untuk mendapatkan lisis sel yang efisien.
6. Tambahkan 10ml Nuclei Lysis Solution ke dalam tabung yang berisi sel-sel yang diresuspensi. Pipet larutan 5-6 kali untuk
melisiskan sel darah putih. Solusinya harus menjadi sangat kental. Jika gumpalan sel terlihat setelah pencampuran,
inkubasikan larutan pada suhu 37°C sampai gumpalan tersebut hilang. Jika gumpalan masih terlihat setelah 1 jam,
tambahkan 3 ml larutan lisis inti tambahan dan ulangi inkubasi.
7. Opsional:Tambahkan RNase A, hingga konsentrasi akhir 20µg/ml, ke lisat inti dan campur sampel dengan membalik
tabung 2-5 kali. Inkubasi campuran pada suhu 37°C selama 15 menit, lalu dinginkan hingga suhu kamar.
8. Tambahkan 3.3ml Protein Precipitation Solution ke lisat inti, dan vortex dengan kuat selama 10-20 detik.
Gumpalan protein kecil mungkin terlihat setelah vortexing.
Catatan:Jika Solusi Nuclei Lysis tambahan ditambahkan dalamLangkah 6, tambahkan 4ml Protein Precipitation Solution
(bukan 3.3ml).
9. Centrifuge pada 2.000× gselama 10 menit pada suhu kamar.
Pelet protein coklat tua harus terlihat. Jika tidak ada pelet yang diamati, lihat Bagian 4.
10. Pindahkan supernatan ke dalam tabung sentrifus 50 ml yang berisi 10 ml isopropanol suhu kamar.
Catatan:Beberapa supernatan mungkin tetap berada di tabung asli yang berisi pelet protein. Biarkan sisa cairan di dalam
tabung untuk menghindari kontaminasi larutan DNA dengan protein yang diendapkan.
11. Campurkan larutan secara perlahan dengan cara inversi sampai untaian DNA seperti benang putih membentuk massa yang terlihat.
12. Centrifuge pada 2.000× gselama 1 menit pada suhu kamar. DNA akan terlihat sebagai pelet putih kecil.
13. Tuang supernatan dan tambahkan 10ml etanol 70% suhu kamar ke DNA. Balikkan tabung beberapa kali dengan hati-hati
untuk mencuci pelet DNA dan sisi-sisi tabung sentrifus. Centrifuge seperti pada Langkah 12.
14. Aspirasi etanol dengan hati-hati. Pelet DNA sangat longgar pada titik ini dan harus berhati-hati untuk menghindari
aspirasi pelet ke dalam pipet. Keringkan pelet di udara selama 10-15 menit.
15. Tambahkan 800µl DNA Rehydration Solution ke dalam tabung, dan rehidrasi DNA dengan menginkubasi pada 65°C selama 1 jam.
Campur larutan secara berkala dengan mengetuk tabung dengan lembut. Atau, rehidrasi DNA dengan menginkubasi larutan
semalaman pada suhu kamar atau pada 4°C.
3.C. Mengisolasi DNA Genom dari Darah Utuh (piring 96-sumur)
Protokol ini dapat diskalakan menjadi 20µl, 30l atau 40µl darah. Tabel 2 menguraikan berbagai volume larutan yang digunakan dalam
setiap langkah. Persiapan lima puluh mikroliter umumnya menghasilkan DNA genom dalam kisaran 0,2-0,7µg, tergantung pada jumlah
leukosit dalam sampel darah.
Tabel 2. Volume Reagen yang Dibutuhkan untuk Berbagai Jumlah Darah Awal.
Lisis sel Protein DNA

Larutan Lisis Inti Pengendapan Rehidrasi
Sampel (Lisis sel darah merah) Larutan Larutan isopropanol Larutan
20µl 60µl 20µl 6.7µl 20µl 10µl
30µl 90µl 30µl 10µl 30µl 15µl
40µl 120µl 40µl 13.3µl 40µl 20µl
50µl 150µl 50µl 16,5µl 50µl 25µl

• Pelat 96-sumur V-bottom mampu menampung 300µl volume/sumur (Costar®Kucing#3896)
• Sealer pelat 96-sumur (Costar®Cat.#3095) (opsional; untuk digunakan dengan darah manusia)
1. Tambahkan 150µl Cell Lysis Solution ke masing-masing well.
!Penting:Darah harus dikumpulkan dalam tabung antikoagulan EDTA, heparin atau sitrat.
2. Tambahkan 50µl darah segar ke setiap sumur dan pipet 2-3 kali hingga tercampur.
3. Biarkan piring pada suhu kamar selama 10 menit, pemipetan larutan dua kali selama inkubasi untuk membantu melisiskan
sel darah merah.
4. Centrifuge pada 800× gselama 5 menit dalam centrifuge meja untuk memusatkan sel.
5. Keluarkan dan buang supernatan dengan hati-hati dengan ujung mikropipet, sisakan sedikit sel darah putih dan beberapa
sel darah merah. Penggunaan ujung pipet yang diperpanjang, seperti ujung pemuatan gel, direkomendasikan.
Memiringkan pelat 96-sumur 50–80 ° (tergantung pada jumlah cairan yang ada per sumur) memungkinkan
pembuangan cairan yang lebih menyeluruh dari sumur.
6. Tambahkan 50µl Nuclei Lysis Solution ke masing-masing well dan pipet 5–6 kali untuk meresuspensi pellet dan melisiskan sel darah
putih. Solusinya harus menjadi lebih kental. Sebagai bantuan dalam visualisasi pelet DNA, 2µl per lubang pembawa (misalnya,
Polyacryl Carrier [Molecular Research Center, Inc., Cat.# PC152]) dapat ditambahkan pada langkah ini. Hasil DNA umumnya setara
dengan atau tanpa penggunaan pembawa.
7. Tambahkan 16,5µl Protein Precipitation Solution per sumur dan pipet 5–6 kali hingga tercampur.
8. Centrifuge pada 1.400× gselama 10 menit pada suhu kamar. Pelet protein coklat harus terlihat. Jika tidak ada pelet
yang terlihat, lihat Bagian 4.
9. Pengendapan/Rehidrasi DNA di Pelat 96-Sumur
sebuah. Pindahkan supernatan dengan hati-hati ke sumur bersih yang mengandung 50µl isopropanol suhu kamar per sumur dan
campur dengan pemipetan.
Catatan:Beberapa supernatan mungkin tetap berada di sumur asli yang mengandung pelet protein. Biarkan cairan sisa ini di dalam sumur
untuk menghindari kontaminasi larutan DNA dengan protein yang diendapkan. Seperti dalamLangkah 5, memiringkan pelat akan memudahkan
pengeluaran cairan dari sumur. Menggunakan ujung pipet yang diperpanjang pada langkah ini tidak memungkinkan pencampuran sampel
dengan isopropanol dengan mudah.
b. Centrifuge pada 1.400× gselama 10 menit. Keluarkan isopropanol dengan hati-hati dengan ujung mikropipet.
c. Tambahkan 100µl etanol 70% suhu kamar per sumur.
d. Centrifuge pada 1.400× gselama 10 menit pada suhu kamar.
e. Aspirasi etanol dengan hati-hati menggunakan pipet Pasteur yang ditarik atau ujung pipet pengurutan. Perawatan harus dilakukan untuk
menghindari aspirasi pelet DNA. Tempatkan baki pada sudut 30–45° dan keringkan di udara selama 10-15 menit.
f. Tambahkan 25µl DNA Rehydration Solution ke masing-masing well. Biarkan DNA rehidrasi semalaman pada suhu
kamar atau pada 4°C.
g. Simpan DNA pada 2-8°C.

Catatan:Volume kecil DNA dapat dengan mudah dikumpulkan di dasar sumur-V dengan mensentrifugasi pelat 96-sumur secara singkat
sebelum digunakan.
3.D. Mengisolasi DNA Genom dari Sel Kultur Jaringan dan Jaringan Hewan

• Tabung mikrosentrifugasi 1,5ml
• Tabung centrifuge 15ml (untuk jaringan hewan)
• homogenizer kecil (Fisher Tissue Tearor, Cat.# 15-338-55, atau setara) (untuk jaringan hewan)
• tripsin (hanya untuk sel kultur jaringan yang melekat)
• PBS (untuk sel kultur jaringan)
• nitrogen cair (opsional; untuk sel kultur jaringan, Langkah 1.d; untuk penggilingan jaringan hewan, Langkah 2.b, sebagai pengganti
homogenizer kecil; dan untuk ekor tikus, Langkah 3.b)
• lesung dan alu (opsional; untuk penggilingan jaringan hewan, Langkah 2.b, sebagai pengganti homogenizer kecil; dan untuk ekor tikus,
Langkah 3.b)
• Penangas air 95 °C (opsional; untuk sel kultur jaringan, Langkah 1.d)
• penangas air, 37 °C

• 0,5M EDTA (pH 8,0) (untuk ekor tikus)
• Proteinase K (20mg/ml dalam air; Cat.# V3021) (untuk ekor tikus)
• penangas air 55°C (untuk ekor tikus)
1. Sel Kultur Jaringan

sebuah. Panen sel, dan pindahkan ke tabung mikrosentrifugasi 1,5ml. Untuk sel yang melekat, lakukan tripsinisasi sel
sebelum dipanen.
b. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 10 detik untuk pelet sel.

c. Buang supernatan, tinggalkan pelet sel ditambah 10-50µl cairan sisa.
d. Cuci sel dengan menambahkan 200µl PBS dan vortex kuat-kuat untuk meresuspensi sel. Centrifuge seperti pada Langkah
1.b, dan hapus PBS.
Catatan:Untuk sel yang tidak lisis dengan baik hanya dalam Larutan Lisis Inti saja (misalnya, sel PC12), lakukan langkah beku-cair
tambahan sebagai berikut sebelum melanjutkan ke Langkah 1.e: Cuci sel seperti pada Langkah 1.d; kemudian bekukan dalam nitrogen
cair. Mencairkan sel dengan memanaskan pada 95 ° C. Ulangi prosedur ini untuk total 4 siklus.
e. Tambahkan 600µl Nuclei Lysis Solution, dan pipet untuk melisiskan sel. Pipet sampai tidak ada gumpalan sel yang terlihat.
f. Lanjutkan ke Bagian 3.D, Langkah 4.
2. Jaringan Hewan (Hati dan Otak Tikus)

sebuah. Tambahkan 600µl Nuclei Lysis Solution ke dalam tabung sentrifus 15ml, dan dinginkan di atas es.
b. Tambahkan 10-20mg jaringan segar atau yang telah dicairkan ke dalam larutan lisis inti dingin dan homogenkan selama 10 detik
menggunakan homogenizer kecil. Pindahkan lisat ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml. Sebagai alternatif, giling jaringan dalam
nitrogen cair menggunakan lesung dan alu yang telah didinginkan sebelumnya dalam nitrogen cair. Setelah penggilingan,
biarkan nitrogen cair menguap dan pindahkan sekitar 10–20mg jaringan dasar ke 600µl Nuclei Lysis
Solution dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5ml.
c. Inkubasi lisat pada 65 ° C selama 15-30 menit.
d. Lanjutkan ke Bagian 3.D, Langkah 4.
3. Jaringan Hewan (Ekor Tikus)

sebuah. Untuk setiap sampel yang akan diproses, tambahkan 120µl larutan EDTA 0,5M (pH 8,0) ke dalam 500µl Larutan Nuclei Lysis dalam
tabung sentrifus. Dinginkan di atas es.
Catatan:Solusinya akan berubah menjadi keruh saat didinginkan.
b. Tambahkan 0,5-1 cm ekor tikus segar atau yang sudah dicairkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml.
Catatan:Jaringan dapat digiling menjadi bubuk halus dalam nitrogen cair menggunakan mortar dan alu yang telah didinginkan
sebelumnya dalam nitrogen cair. Kemudian pindahkan bubuk tersebut ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml.
c. Tambahkan 600µl EDTA/Nuclei Lysis Solution dari Langkah 3.a ke dalam tabung.
d. Tambahkan 17,5µl 20mg/ml Proteinase K.
e. Inkubasi semalaman pada suhu 55 ° C dengan pengocokan lembut. Sebagai alternatif, lakukan inkubasi 3 jam 55 °C
(dengan pengocokan); vortex sampel sekali per jam jika melakukan inkubasi 3 jam. Pastikan ekornya benar-
benar tercerna.
4. Opsional untuk ekor tikus:Tambahkan 3µl larutan RNase ke lisat inti dan campur sampel dengan membalik tabung 2–5
kali. Inkubasi campuran selama 15–30 menit pada suhu 37°C. Biarkan sampel mendingin hingga suhu kamar selama 5
menit sebelum melanjutkan.
5. Untuk sampel suhu kamar, tambahkan 200µl Protein Precipitation Solution dan vortex dengan kecepatan tinggi selama 20 detik.
Dinginkan sampel di atas es selama 5 menit.
6. Centrifuge selama 4 menit pada 13.000-16.000× g. Protein yang diendapkan akan membentuk pelet putih yang rapat.
7. Keluarkan dengan hati-hati supernatan yang mengandung DNA (meninggalkan pelet protein) dan pindahkan ke
tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml bersih yang berisi 600µl isopropanol suhu kamar.
8. Campur larutan secara perlahan dengan cara inversi sampai untaian DNA seperti benang putih membentuk massa yang terlihat.
9. Centrifuge selama 1 menit pada 13.000-16.000× gpada suhu kamar. DNA akan terlihat sebagai pelet putih kecil.
Tuang supernatan dengan hati-hati.
10. Tambahkan 600µl etanol 70% suhu kamar, dan balikkan tabung secara perlahan beberapa kali untuk mencuci DNA.
Centrifuge selama 1 menit pada 13.000-16.000× gpada suhu kamar.
11. Aspirasi etanol dengan hati-hati menggunakan pipet Pasteur yang ditarik atau ujung pipet pengurutan. Pelet DNA
sangat longgar pada titik ini, dan harus berhati-hati agar pelet tidak terhisap ke dalam pipet.
12. Balikkan tabung di atas kertas penyerap bersih, dan keringkan pelet selama 10-15 menit.
13. Tambahkan 100µl DNA Rehydration Solution, dan rehidrasi DNA dengan menginkubasi pada 65°C selama 1 jam. Campur larutan secara
berkala dengan mengetuk tabung dengan lembut. Atau, rehidrasi DNA dengan menginkubasi larutan semalaman pada suhu kamar
atau pada 4°C.
3.E. Mengisolasi DNA Genom dari Jaringan Tumbuhan

• nitrogen cair
• alu tabung mikrosentrifugasi atau lesung dan alu
1. Proses jaringan daun dengan membekukan dengan nitrogen cair dan menggiling menjadi bubuk halus menggunakan alu tabung
mikrosentrifugasi atau lesung dan alu. Tambahkan 40mg bubuk daun ini ke tabung mikrosentrifus 1,5ml.
2. Tambahkan 600µl Nuclei Lysis Solution, dan vortex 1-3 detik untuk membasahi tisu.
3. Inkubasi pada suhu 65°C selama 15 menit.
4. Tambahkan 3µl Larutan RNase ke lisat sel, dan campur sampel dengan membalik tabung 2–5 kali. Inkubasi campuran pada
37°C selama 15 menit. Biarkan sampel mendingin hingga suhu kamar selama 5 menit sebelum melanjutkan.
5. Tambahkan 200µl Protein Precipitation Solution, dan vortex dengan kecepatan tinggi selama 20 detik.
6. Centrifuge selama 3 menit pada 13.000-16.000× g. Protein yang diendapkan akan membentuk pelet yang rapat.
7. Keluarkan dengan hati-hati supernatan yang mengandung DNA (meninggalkan pelet protein) dan pindahkan ke
tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml bersih yang berisi 600µl isopropanol suhu kamar.
8. Aduk perlahan larutan dengan cara inversi sampai untaian DNA seperti benang membentuk massa yang terlihat.
9. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 1 menit pada suhu kamar.
10. Tuang supernatan dengan hati-hati. Tambahkan 600µl etanol 70% suhu kamar dan perlahan balikkan tabung beberapa kali
untuk mencuci DNA. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 1 menit pada suhu kamar.
11. Aspirasi etanol dengan hati-hati menggunakan pipet Pasteur yang ditarik atau ujung pipet pengurutan. Pelet DNA sangat
longgar pada titik ini dan harus berhati-hati untuk menghindari aspirasi pelet ke dalam pipet.
12. Balikkan tabung ke kertas penyerap bersih dan keringkan pelet selama 15 menit.
13. Tambahkan 100µl DNA Rehydration Solution dan rehidrasi DNA dengan menginkubasi pada 65°C selama 1 jam. Campur larutan secara
berkala dengan mengetuk tabung dengan lembut. Atau, rehidrasi DNA dengan menginkubasi larutan semalaman pada suhu
kamar atau pada 4°C.
3.F. Mengisolasi DNA Genom dari Ragi

• kaldu YPD
• 50mM EDTA (pH 8,0)
• litikase (Sigma Cat.# L2524), disuspensikan kembali dengan Air Bebas Nuklease hingga konsentrasi akhir 75 unit/µl
1. Tambahkan 1 ml biakan yang ditumbuhkan selama 20 jam dalam kaldu YPD ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml.
2. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 2 menit untuk pelet sel. Buang supernatannya.
3. Resuspensi sel secara menyeluruh dalam 293µl 50mM EDTA.
4. Tambahkan 7,5µl 75 unit/µl litikase, dan pipet perlahan 4 kali hingga tercampur.
5. Inkubasi sampel pada suhu 37°C selama 30-60 menit untuk mencerna dinding sel. Dinginkan hingga suhu kamar.
6. Sentrifugasi sampel pada 13.000-16.000× gselama 2 menit dan kemudian buang supernatannya.
7. Tambahkan 300µl Nuclei Lysis Solution ke pelet sel dan pipet perlahan hingga tercampur.
8. Tambahkan 100µl Protein Precipitation Solution dan vortex dengan kecepatan tinggi selama 20 detik.
9. Biarkan sampel di atas es selama 5 menit.
10. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 3 menit.
11. Pindahkan supernatan yang mengandung DNA ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml bersih yang berisi 300µl
isopropanol suhu kamar.
12. Aduk perlahan dengan cara inversi sampai untaian DNA seperti benang membentuk massa yang terlihat.
14. Tuang supernatan dengan hati-hati dan tiriskan tabung di atas kertas penyerap bersih. Tambahkan 300µl etanol 70% suhu kamar dan
perlahan-lahan balikkan tabung beberapa kali untuk mencuci pelet DNA.
15. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 2 menit. Aspirasi semua etanol dengan hati-hati.
16. Tiriskan tabung di atas kertas penyerap bersih dan biarkan pelet mengering selama 10-15 menit.
17. Tambahkan 50µl DNA Rehydration Solution.
18. Tambahkan 1,5µl larutan RNase ke sampel DNA yang telah dimurnikan. Vortex sampel selama 1 detik. Sentrifugasi sebentar dalam
mikrosentrifugasi selama 5 detik untuk mengumpulkan cairan dan inkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit.
3.F. Mengisolasi DNA Genom dari Ragi (lanjutan)
19. Rehidrasi DNA dengan menginkubasi pada suhu 65°C selama 1 jam. Campur larutan secara berkala dengan mengetuk tabung dengan
lembut. Atau, rehidrasi DNA dengan menginkubasi larutan semalaman pada suhu kamar atau pada 4°C.
3.G. Mengisolasi DNA Genom dari Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif

• 50mM EDTA (pH 8,0) (untuk bakteri gram positif)
• 10mg/ml lisozim (Sigma Cat.# L4919) (untuk bakteri gram positif)
• 10mg/ml lisostaphin (Sigma Cat.# L7386) (untuk bakteri gram positif)
1. Tambahkan 1 ml biakan semalaman ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml.
2. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 2 menit untuk pelet sel. Buang supernatannya. Untuk Bakteri Gram Positif,
lanjutkan ke Langkah 3.Untuk Bakteri Gram Negatif langsung ke Langkah 6.
3. Resuspensi sel secara menyeluruh dalam 480µl 50mM EDTA.
4. Tambahkan enzim litik yang sesuai ke pelet sel yang disuspensikan kembali dalam volume total 120µl, dan pipet perlahan hingga tercampur. Tujuan
dari pretreatment ini adalah untuk melemahkan dinding sel sehingga lisis sel yang efisien dapat berlangsung.
Catatan:pastiStafilokokusspesies, campuran 60µl dari 10mg/ml lisozim dan 60µl dari 10mg/ml lisostaphin diperlukan untuk
lisis yang efisien. Namun, banyak Strain Bakteri Gram Positif (misalnya,Bacillus subtilis, Mikrokokus luteus,Nocardia
otitidiscaviarum,Rhodococcus rhodochrous, danBrevibacterium albidium) melisiskan secara efisien menggunakan lisozim
saja.
5. Inkubasi sampel pada suhu 37°C selama 30–60 menit. Centrifuge selama 2 menit pada 13.000-16.000× gdan buang
supernatannya.
6. Tambahkan 600µl Nuclei Lysis Solution. Pipet perlahan sampai sel disuspensikan kembali.
7. Inkubasi pada 80°C selama 5 menit untuk melisiskan sel; kemudian dinginkan sampai suhu kamar.
8. Tambahkan 3µl larutan RNase ke lisat sel. Balikkan tabung 2–5 kali agar tercampur.
9. Inkubasi pada suhu 37°C selama 15–60 menit. Dinginkan sampel hingga suhu kamar.
10. Tambahkan 200µl Protein Precipitation Solution ke lisat sel yang diberi perlakuan RNase. Vortex dengan kuat pada kecepatan tinggi
selama 20 detik untuk mencampurkan Protein Precipitation Solution dengan lisat sel.
11. Inkubasi sampel di atas es selama 5 menit.
13. Pindahkan supernatan yang mengandung DNA ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml bersih yang berisi 600µl
isopropanol suhu kamar.
14. Aduk perlahan dengan cara inversi sampai untaian DNA seperti benang membentuk massa yang terlihat.
16. Tuang supernatan dengan hati-hati dan tiriskan tabung di atas kertas penyerap bersih. Tambahkan 600µl etanol 70% suhu
kamar dan perlahan balikkan tabung beberapa kali untuk mencuci pelet DNA.
17. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 2 menit. Aspirasi etanol dengan hati-hati.
18. Tiriskan tabung di atas kertas penyerap bersih dan biarkan pelet mengering di udara selama 10-15 menit.
19. Tambahkan 100µl DNA Rehydration Solution ke dalam tabung dan rehidrasi DNA dengan menginkubasi pada 65°C selama 1 jam.
Campur larutan secara berkala dengan mengetuk tabung dengan lembut. Atau, rehidrasi DNA dengan menginkubasi larutan
semalaman pada suhu kamar atau pada 4°C.
4. Pemecahan masalah
Untuk pertanyaan yang tidak dibahas di sini, silakan hubungi Kantor Cabang atau Distributor Promega setempat. Informasi kontak
tersedia di:www.promega.com. Surel:techserv@promega.com
Gejala Komentar
Gumpalan darah hadir dalam sampel darah Tabung mungkin disimpan dengan tidak benar; darah tidak tercampur
sempurna, atau tabung yang tidak tepat digunakan untuk mengambil
darah. Buang darah beku dan ambil sampel baru menggunakan tabung
antikoagulan yang diberi EDTA, heparin, atau sitrat.
Hasil DNA yang buruk Sampel darah mungkin mengandung terlalu sedikit sel darah putih. Ambil
sampel darah baru.
Pelet sel darah putih tidak disuspensi ulang secara menyeluruh

pada Langkah 5 dari Bagian 3.A atau B. Pelet sel darah putih harus
divortex dengan kuat untuk meresuspensi sel.
Sampel darah terlalu tua. Hasil terbaik diperoleh dengan darah

segar. Sampel yang telah disimpan pada suhu 2–8°C selama lebih
dari 5 hari dapat mengurangi hasil.
Pelet DNA hilang selama pengendapan isopropanol. Gunakan sangat

hati-hati saat melepas isopropanol untuk menghindari kehilangan
pelet.
4. Pemecahan Masalah (lanjutan)
Gejala Komentar
DNA terdegradasi (berukuran <50kb) Pengambilan atau penyimpanan sampel darah yang tidak tepat.
Mendapatkan sampel baru di bawah kondisi yang tepat.
Hasil DNA yang buruk menggunakan protokol Kultur yang ditumbuhkan untuk waktu yang lama mengandung sebagian
bakteri Gram positif besar sel yang mudah lisis setelah terpapar pengobatan lisostaphin.
Mulailah pemurnian dengan budaya yang sehat.
Tidak ada pelet protein Sampel tidak didinginkan sampai suhu kamar sebelum menambahkan
Protein Precipitation Solution. Dinginkan sampel hingga suhu kamar
(minimal 5 menit) atau dinginkan di atas es selama 5 menit, vortex 20
detik, sentrifus selama 3 menit pada 13.000-16.000× g (10 menit pada
2.000 ×guntuk volume sampel 3ml) dan lanjutkan dengan protokol.
Larutan Pengendapan Protein tidak tercampur sempurna

dengan lisat inti. Selalu campurkan lisat inti dan Larutan
Pengendapan Protein sepenuhnya.
Pelet DNA sulit larut Sampel mungkin terlalu kering. Rehidrasi DNA dengan menginkubasi
1 jam pada 65°C, lalu biarkan sampel pada suhu kamar atau 4°C
semalaman.Peringatan:Jangan biarkan DNA pada suhu 65°C
semalaman.
Sampel tidak dicampur selama langkah rehidrasi. Ingatlah untuk

mencampur sampel secara berkala selama langkah rehidrasi.
5. Referensi
1. Miller, SA, Dykes, DD dan Polesky, HF (1988) Prosedur penggaraman sederhana untuk mengekstraksi DNA dari sel
berinti manusia.inti Asam Res.16, 1215.
2. Beutler, E., Gelbart, T. dan Kuhl, W. (1990) Interferensi heparin dengan reaksi berantai
polimerase. BioTeknik9, 166.
3. Departemen Tenaga Kerja AS, Administrasi Keselamatan dan Kesehatan Kerja (1991) Paparan di tempat kerja terhadap patogen yang
ditularkan melalui darah, aturan terakhir.Daftar Federal56, 64175.
6. Lampiran
6.A. Komposisi Buffer dan Solusi
Solusi Rehidrasi DNA (disediakan) RNase A

10mM Tris-HCl (pH 7,4) Larutkan RNase A hingga 4mg/ml dalam Larutan Rehidrasi DNA,
1mM EDTA (pH 8,0) didihkan 10 menit untuk menghilangkan DNase yang terkontaminasi
dan simpan dalam alikuot pada –20°C. Solusi ini juga tersedia dari
Promega (Cat.# A7973).
6.B. Produk-produk terkait
Sistem Pemurnian DNA
Produk Ukuran Kucing.#
Sistem Pemurnian DNA Genomic ReadyAmp™ 100 reaksi A7710

Penyihir®PlusSistem Pemurnian DNA SV Minipreps 50 persiapan A1330
Penyihir®PlusSistem Pemurnian DNA SV Minipreps + Adaptor Vakum 50 persiapan A1340
Penyihir®PlusSistem Pemurnian DNA SV Minipreps 250 persiapan A1460
Penyihir®PlusSistem Pemurnian DNA SV Minipreps + Adaptor Vakum 250 persiapan A1470
Adaptor Vakum masing-masing 20 A1331
Sistem Amplifikasi DNA
Produk Ukuran Kucing.#
GoTaq®Sistem Inti PCR I 200 reaksi M7660

GoTaq®Sistem Inti PCR II 200 reaksi M7665
7. Ringkasan Perubahan
Perubahan berikut dibuat pada revisi 19/3 dari dokumen ini:

Instruksi yang diperbarui untuk Bagian 3.D, Sel Kultur Jaringan, Langkah 1.d.
© 1999, 2002, 2005, 2009, 2010, 2014, 2017, 2019 Promega Corporation. Seluruh hak cipta.
GoTaq dan Wizard adalah merek dagang terdaftar dari Promega Corporation. ReadyAmp adalah merek dagang dari Promega Corporation.
Costar adalah merek dagang terdaftar dari Corning, Inc.
Produk mungkin dilindungi oleh paten yang tertunda atau dikeluarkan atau mungkin memiliki batasan tertentu. Silakan kunjungi situs Web kami untuk informasi lebih lanjut.
Semua harga dan spesifikasi dapat berubah tanpa pemberitahuan sebelumnya.
Klaim produk dapat berubah. Silakan hubungi Layanan Teknis Promega atau akses katalog online Promega untuk informasi terbaru
tentang produk Promega.

Wizard Genomic Dna Purification Kit Protocol - En.id

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Wizard Genomic Dna Purification Kit Protocol - En.id

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

1. Deskripsi ................................................................... ................................................................... ........................................ 1

2. Komponen Produk dan Kondisi Penyimpanan ......................................... ................................................... 2

3. Protokol untuk Isolasi DNA Genom .................................................. ................................................................... ...... 4

5. Referensi............................................................ ................................................................... ................................................... 16

6. Lampiran................................................................... ................................................................... ........................................ 17

Penyihir®Kit Pemurnian DNA Genom 100 isolasi A1120

Penyihir®Kit Pemurnian DNA Genom 500 isolasi A1125

Penyihir®Kit Pemurnian DNA Genom 100 isolasi A1620

Item Tersedia Secara Terpisah

PRODUK UKURAN KUCING. #

Solusi Lisis Sel 1L A7933

COS (monyet hijau Afrika) 1,5 × 106sel 10µg Yg dibutuhkan

NIH3T3 (tikus) 2.25 × 106sel 9,5-12,5µg Yg dibutuhkan

PC12 (pheochromocytoma tikus) 8,25 × 106sel 6µg Yg dibutuhkan

CHO (hamster) 1-2 × 106sel 6–7µg Yg dibutuhkan

Ekor Tikus 0.5–1.0cm ekor 10–30µg Opsional

Daun Tomat 40mg 7–12µg Yg dibutuhkan

Bakteri Gram Negatif

budaya semalam, 5ml 75–100µg Yg dibutuhkan

Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

16. Simpan DNA pada 2–8°C.

Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

9. Centrifuge pada 2.000× gselama 10 menit pada suhu kamar.

16. Simpan DNA pada 2–8°C.

Lisis sel Protein DNA

Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

1. Tambahkan 150µl Cell Lysis Solution ke masing-masing well.

9. Pengendapan/Rehidrasi DNA di Pelat 96-Sumur

campur dengan pemipetan.

dengan isopropanol dengan mudah.

c. Tambahkan 100µl etanol 70% suhu kamar per sumur.

d. Centrifuge pada 1.400× gselama 10 menit pada suhu kamar.

g. Simpan DNA pada 2-8°C.

Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

• Penangas air 95 °C (opsional; untuk sel kultur jaringan, Langkah 1.d)

• isopropanol, suhu kamar

1. Sel Kultur Jaringan

b. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 10 detik untuk pelet sel.

f. Lanjutkan ke Bagian 3.D, Langkah 4.

2. Jaringan Hewan (Hati dan Otak Tikus)

3. Jaringan Hewan (Ekor Tikus)

Catatan:Solusinya akan berubah menjadi keruh saat didinginkan.

d. Tambahkan 17,5µl 20mg/ml Proteinase K.

14. Simpan DNA pada 2–8°C.

Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

3. Inkubasi pada suhu 65°C selama 15 menit.

9. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 1 menit pada suhu kamar.

14. Simpan DNA pada 2–8°C.

Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

3. Resuspensi sel secara menyeluruh dalam 293µl 50mM EDTA.

9. Biarkan sampel di atas es selama 5 menit.

10. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 3 menit.

13. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 2 menit.

17. Tambahkan 50µl DNA Rehydration Solution.

20. Simpan DNA pada 2–8°C.

Bahan yang Disediakan oleh Pengguna

1. Tambahkan 1 ml biakan semalaman ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml.

3. Resuspensi sel secara menyeluruh dalam 480µl 50mM EDTA.

11. Inkubasi sampel di atas es selama 5 menit.

15. Centrifuge pada 13.000-16.000× gselama 2 menit.

20. Simpan DNA pada 2–8°C.

Pelet sel darah putih tidak disuspensi ulang secara menyeluruh