Reaksi berantai polimerase

Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik reaksi berantai polimerase

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah
bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat
dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai
teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan
ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR
banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya
memerlukan jumlah sampel yang kecil.

Prinsip kerja
Prinsip kerja reaksi berantai polimerase

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus yang
tergantung oleh kebutuhan. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap
bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu
tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi
berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai
5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan
DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2
menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini
bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
 3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA
polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase,
proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa
berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA
yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah
karena penambahan terjadi secara eksponensial.

*****

POLYMERASE CHAIN REACTION

Biologi Molekular, Genetika

Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah metode enzimatis untuk
melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in
vitro. Metode ini ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985, seorang saintis dari perusahaan
CETUS Corporation. Metode PCR ini pada awalnya hanya digunakan untuk melipatgandakan
molekul DNA, akan tetapi dalam perkembangannya dapat digunakan untuk melipatgandakan
molekul mRNA.

Metode PCR dapat melipatgandakan fragmen molekul DNA menjadi molekul DNA (110 bp/5x10-
19) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit. Kelebihan dari
metode PCR adalah DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu
sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam genom
bakteri hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR.

Prinsip Dasar PCR

Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA cetakan, (2)
oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP,
dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai
DNA.
Proses PCR terdiri dari tiga tahap, yakni denaturasi, penempelan (annealing), dan amplifikasi.
Pada tahap denaturasi, suatu fragmen DNA (duoble strand) dipanaskan pada suhu 95 0C selama
1-2 menit sehingga akan terpisah menjadi rantai tunggal (single strand). Kemudian dilakukan
penempelan (annealing) pada suhu 55 0C selama 1-2 menit, yakni oligonukleotida primer
menempel pada DNA cetakan yang komplementer dengan sekuen primer. Setelah dilakukan
penempelan, suhu dinaikkan menjadi 72 0C selama 1,5 menit. Pada suhu ini, enzim DNA
polimerase akan melakukan poses polimerasi, yakni rantai DNA yang baru akan membentuk
jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. Proses ini disebut amplifikasi (diperkuat/disalin
beberapa kali) (lihat gambar 1).

Gambar 1. Proses PCR

Reaksi-reaksi seperti diatas dapat diulangi sampai 25-30 kali (siklus) sehingga akan didapatkan
molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru. Banyaknya amplifikasi tergantung pada
konsentrasi DNA target yang akan digunakan. Setelah diperoleh molekul-molekul DNA dalam
jumlah yang sesuai, maka DNA tersebut dapat diamati dengan menggunakan cara elektroforesis
gel, analisis fragmen restriksi, atau metode Sanger.
 Aplikasi PCR

Sejak ditemukannya metode PCR, perkembangan dunia biologi molekular dan bioteknologi
semakin pesat. Beberapa contoh penerapan PCR antara lain:

1. Studi arkeologi gen purba, seperti fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) yang
telah membeku selama 400.000 tahun
2. Analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari atau jaringan
3. Deteksi virus papilloma pada kelamin manusia
4. Deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV
5. Diagnosa kelainan genetik sebelum kelairan
6. Peramalan hemofilia
7. isolasi DNA dari miselium jamur dan spora
8. pengujian kualitas air minum
9. analisis filogenetik dalam taksonomi
10. identifikasi polimorfisme DNA
11. identifikasi jenis kelamin
12. skrining pustaka gen λgt11
13. penentuan urutan nukleotida
14. pemetaan genom manusia
15. dan lain-lain

******

Konsep Dasar Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

A. Pengertian teknik PCR
Polymerase chain reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase merupakan suatu teknik perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Teknik ini banyak dilakukan di bidang
biokimia, bidang kedokteran/medis dan biologi molekuler sebab cukup praktis dan murah, hanya
memerlukan sampel yang sedikit, dan dapat dihasilkan DNA dalam jumlah besar dengan waktu singkat,
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary
Mullis pada (tahun 1983). Suatu penemuan di bidang genetika yang luar biasa.

B. Komponen dalam penggunaan teknik PCR

Berbagai komponen dalam Polymerase chain reaction (PCR) yaitu:
 DNA Template (cetakan), yaitu DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen yang akan
digandakan.
 DNA Polimerase, yaitu enzim yang mengkatalisis polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA.
 Oligonukleotida Primer, yaitu DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus
membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA.
 dNTP (deoxynucleoside triphosphate), sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru, terdiri atas 4 macam
sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
 Buffer, yaitu bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan
DNA polymerase.
 Ion Logam, sebagai kofaktor DNA polymerase, tanpa ion ini DNA polymerase tidak dapat bekerja. Umumnya
ion bivalen (Mg2+) dan monovalen (K+).

C. Tahapan Reaksi
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu
dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
1. Denaturasi, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal melalui pemanasan pada temperatur
94-96 °C selama 30-60 detik.
2. Annealing atau Penempelan, yaitu hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan
DNA pada suhu 45-60 °C.
3. Ekstensi/elongasi, yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polymerase
pada suhu 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada
pasangannya.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

 Pra-denaturasi, dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan
mengaktifasi DNA Polimerase.
 Final Elongasi, dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa
setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus
PCR terakhir.

D. Peranan dan Fungsi PCR

Teknik Polymerase Chain Reaction berperan untuk :
1. Amplifikasi urutan nukleotida.
2. Menentukan kondisi urutan nukleotida yang mengalami mutasi.
3. Bidang kedokteran forensik.
4. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print.
E. Aplikasi teknik PCR
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya :
 Isolasi Gen, untuk mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genom manusia dan menyisipkannya ke sel
bakteri, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida
sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang
sesuai dengan gen tersebut.
 DNA Sequencing, urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, dimana proses
awalnya adalah reaksi PCR menggunakan satu primer dengan tambahan dideoxynucleotide.
 Forensik, jika proses identifikasi korban secara fisik sulit dilakukan, maka dilakukan pengujian DNA dengan
mengambil sampel dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi
bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari
keluarga yang memiliki pertalian darah.
 Diagnosa Penyakit, PCR merupakan teknik yang sering digunakan untuk diagnosa penyakit berbahaya seperti
Influenza A(H1N1).

Sumber Referensi Pendukung:

Karcher, Susan J. 1995. Molecular Biology A Project Approach. Academic Press. USA.

*****

Tahap proses PCR

Sebelumnya Kita telah membahas tentang lima komponen pendukung PCR dalam ulasan yang
berjudul “POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)”, sekarang mari melanjutkan ke tahap
proses PCR.

Lima komponen pendukung PCR tentu sangat dibutuhkan dalam mengoperasikan sistem yang
menakjubkan ini. Mengapa dikatakan menakjubkan? Karena dengan adanya PCR membuat
berbagai bidang kesehatan, penelitian dan lain sebagainya menjadi berkembang pesat.

Nah, untuk mengoperasikan alat ini, setidaknya ada tiga tahapan yang Anda perlu dan harus
perhatikan dengan seksama yaitu pre-PCR seperti preparasi reagensia dan spesimen, proses
amplifikasi dan terakhir post-PCR dengan hasil akhir berupa deteksi atau analisa hasil.
Baca : Mengukur Konsentrasi DNA

Sekarang, mari bahas proses amplifikasi, dimana dalam reaksi ini dimulai dari proses denaturasi
(pemisahan) rantai DNA template, penempelan primer (annealing) pada DNA target dan
pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA Polimerase.
Masing-masing tahap proses PCR membutuhkan kisaran suhu 95°C, 50°C dan 72°C.

Gambar: GENESIG q16 Real Time PCR Machine

1. Pemisahan (Denaturasi) DNA Template

Denaturasi adalah perubahan atau modifikasi struktur sekuender, tersier dan kuartener molekul
tanpa adanya pemecahan ikatan peptida. Denaturasi DNA tamplate adalah proses terputusnya
ikatan hidrogen antar basa yang terdapat dalam pasangan untai DNA tamplate. Untai ganda DNA
template (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal (suhu 95°C). Proses ini
menyebabkan DNA yang semula untai ganda, kini terpecah menjadi untai tunggal. Sampai di sini,
proses berlanjut pada tahapan berikutnya yaitu penempelan primer.

2. Penempelan (Annealing) Primer

Tahapan ini merupakan tahap lanjutan dari terputusnya ikatan ganda DNA tamplate menjadi untai
tunggal. Masing-masing untai tunggal DNA template akan mengalami proses ‘pendinginan’
hingga mencapai suhu tertentu. Hal ini dimaksudkan untuk memberi jeda bagi penempelan primer.
Setiap untai tunggal DNA template akan ditempeli pasangan primer. Di alam, primer dibuat oleh
enzim yang disebut primase. Ada dua jenis primer yang akan menempel, yaitu primer maju
(forward primer) dan primer mundur (reserve primer).
Setiap pasangan primer tersebut telah dipilih sedemikian rupa agar satu primer bersifat
komplementer terhadap salah satu ujung gen yang diinginkan pada salah satu rantai. Jadi, masing-
masing primer akan menempati ujung yang berbeda pada untai DNA. Pasangan primer ini akan
membentuk ikatan hidrogen dengan sekuen komplementernya. Dengan demikian maka akan
terbentuk molekul untai ganda yang stabil.

Baca : Sekuensing DNA

3. Pemanjangan (Extension) Primer

 DNA Polimerase digunakan untuk proses memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya
bantuan dari dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. DNA Polimerase
yang paling sering digunakan dalam PCR berasal dari strain bakteri Thermus aquaticus yang hidup
di sumber air panas Yellowstone National Park. Bakteri ini dapat bertahan hidup pada suhu
medekati titik didih dan bekerja optimal pada 72 °C (162 ° F). Primer yang telah menempel pada
untai tunggal DNA template akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’ dengan penambahan dNTP
yang komplemen dengan template DNA polimerase. Proses pemanjangan (extension) primer ini
juga dikenal dengan istilah polimerisasi primer.

Baca Juga :
Ini Dia ‘Kenakalan’ Masa Kecil Yang Ternyata Bagus untuk Otak

Waspada, Ini 4 Makanan Penurun Daya Ingat

‘Protein Urin’ untuk Identifikasi Kanker Pankreas

*****

Tahapan Proses PCR

1. Denaturasi
Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan
untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai
DNA baru yang akan dibuat.
2. Penempelan (Annealing)
Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA
berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel
pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat
menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 550C selama 30-60 detik.
3. Pemanjangan (Ektension)
Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polymerase akan memanjangkan
sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.
Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali
mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru.
Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial.