BIOTEKNOLOGI PERIKANAN

PRAKTIKUM
Diajukan Untuk Memenuhi Sebagai Persyaratan Menyelesaikan Praktikum
Bioteknologi Perikanan Tentang PCR

Oleh :
SYAFITRI SIREGAR
NIM.201710260312085

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN PERTERNAKAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2017
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

PCR salah satu teknik dalam biologi molekuler untuk mengamplifikasikan

sejumlah kecil DNA secara in vitro menggunakan sistem enzimatik dan suhu.
Teknik ini menggunakan enzim yang dapat mensintesi DNA untuk memproduksi
jutaan copy DNA yang identik dengan template. Panjang target DNA berkisar
antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer.
Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang
berada setelah target disebut primer reverse.
Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali
jumlahnya. Proses PCR ini terdiri dari 3 tahapan yang berulang dalam 30 – 40
siklus. Tahapan 3 langkah yaitu, denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim
polimerase. Denaturasi dari DNA yang berlangsung pada suhu 94 - 98C, selama
tahap ini rantai ganda DNA akan terpisah menjadi rantai tunggal.
Tahap kedua annealing dari primer, yang berlangsung pada suhu 50 - 65C.
Tahap ketiga perpanjangan atau ekstension dari primer oleh DNA polymerase
pada suhu 72C. Pada tahap yang ketiga ini taq polimerase mengamplifikasikan
DNA asal sampai jutaan kali. Adapun larutan PCR terdiri dari : DNA polimerase
(enzim taq polimerase) yang tahan terhadap suhu tinggi, buffer PF+CR
mengandung Tris – HCl, KCl dan MgCl2, Empat nukleotida (dNTPs; dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), dua oligonukleotida dan DNA template. ( Ikhwan Ali, 2014)
Sementara itu, beberapa faktor yang mempengaruhi spesifitas PCR adalah
temperatur annealing, aktifitas dan jumlah polimerase, konsentrasi primer, DNA
template dan Mg2+. Pada perkembangannya keseluruhan bahan yang diperlukan
dalam proses PCR tersebut seringkali tercampur dalam bentuk PCR mix.
PCR merupakan metode yang sangat dapat diandalkan, khususnya untuk
mendeteksi atau mendiagnosis penyakit, baik itu yang disebabkan karena bakteri
atau virus. Diagnosis dapat dilakukan dalam jumlah sampel yang banyak dan
waktu yang cepat.

1.2 Tujuan
1. Untuk mengetahui dan memahami yang dimaksud dengan PCR.
2. Untuk mengetahui prinsip kerja atau cara kerja dari PCR.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik memperbanyak
DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh sepasang primer.
Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA target dalam jumlah
jutaaan kali hanya dalam beberapa jam. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya.
Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo,
yaitu adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer
(annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase
dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan
enzim ligase dan primer RNA. Secra singkat, teknik PCR dilakukan engan cara
mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), taq DNA polimerase dalam larutan DNA
yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara
berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang
diinginkan. ( Ikhwan Ali, 2014)
Adapun larutan PCR terdiri dari : DNA polimerase (enzim taq polimerase)
yang tahan terhadap suhu tinggi, buffer PF+CR mengandung Tris – HCl, KCl dan
MgCl2, Empat nukleotida (dNTPs; dATP, dCTP, dGTP, dTTP), dua
oligonukleotida dan DNA template. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu:
1) Pra – Denaturasi DNA template
2) Denaturasi
3) Penempelan primer (Annealing)
4) Pemanjangan (Ekstension)
5) Pemantapan (Post – Ekstension)
Tahap kedua sampai ke empat merupakan tahap yang selalu berulang atau
siklusnya berulang, dimana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA.
Tahap pra – denaturasi merupakan tahap yang dilakukan selama 1 – 9 menit dia
awal reaksi yang berfungsi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan
mengaktifkan DNA polimerasi. (Rahayu & Nugroho, 2015)
Denaturasi dari DNA yang berlangsung pada suhu 94 - 98C, selama tahap
ini rantai ganda DNA akan terpisah menjadi rantai tunggal. Denaturasi yang tidak
lengkap akan menyebabkan denaturasi secara cepat, seangkan waktu denaturasi
yang terlalu lama dapat mempengaruhi kerja enzim tag polimerasi.
Tahap penempelan (annealing) merupakan proses penempelan primer pada
bagian DNA template yang komplemen urutan basanya dan berlangsung pada
suhu 50 - 65C. tahap annealing berlangsung selama 1 – 2 menit. Pada tahap
extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi
primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target yang akan
bergerak dari ujung 5’ menuju 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan
atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan
basa nukleotida yang akan ditargetkan. Pada setiap 1000bp yang akan
diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Jika kuran dari 500bp dibutuhkan
waktu 30 detik dan pada kisaran 500 tetapi kurang dar 1kb memerlukan waktu 45
detik, namun apabila lebih dari 1kb membutuhkan waktu 2 menit disetiap
siklusnya.
Suhu yang dibutuhkan untuk proses extension adalah berkisar 70 -72C.
Tahap post extension, biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim 70 - 72C
selama 5 – 15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa
sudah diperpanjang secara sempurna dengan penempelan dNTP’s, dan proses ini
dilakukan setelah proses PCR terakhir. (Rahayu & Nugroho, 2015)
Primer merupakan sepotong untai DNA pendek utas tunggal
(oligonukleotida). Panjang primer berkisar 10 sampai 40 basa. Pemilihan primer
merupakan poin terpenting dalam menentukan keberhasilan proses amplifikasi
(PCR). Primer berfungsi untuk menginisiasi reaksi polimerasi DNA secara in
vitro, mengenali dan menandai fragmen sampel DNA (template) yang akan
diamplifikasi. Pemilihan primer yang kurang tepat dapat mengakibatkan
terjadinya kesalahan segmen yang diamplifikasi.

2.2 Elektroforesis Hasil PCR

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Gel yang
digunakan antara lai agarosa. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut
akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tersebut tergantung pada jumlah muatan terhadap massanya serta tergantung pula
pada bentuk molekulnya.
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari
gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-
faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan,
kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka
pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung
jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat
bergerak melalui matriks tersebut.
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan
bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga
digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-
masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan
mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika,
digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu
sekuen DNA tertentu. (Rahayu & Nugroho, 2015)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat molekul yang bermuatan
listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul yang
digunakan dalam praktikum elektroforesis adalah molekul DNA yang
bermuatan negatif. Molekul akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub
negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul
yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda),
sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (katoda) DNA memiliki muatan negatif karena
mengandung gugus O. Oleh karena itu, arah migrasi DNA adalah dari kutub
negatif ke kutub positif.

2.3 Keunggulan Enzim Taq Polimerase

Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang merupakan katalisis reaksi
sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus
aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim
taq polimerase tahan terhadap pemanasan berulang-ulang dan dapat aktif pada
suhu tinggi yang akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan
meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder, oleh karena itu
penambahan enzim tidak perlu dilakukan pada setiap siklusnya. (Rahayu &
Nugroho, 2015)
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Hasil
Berikut ini merupakan hasil dari praktikum PCR
Gambar Keterangan
Hasil PCR dari sampel isolasi DNA
yang berwarna hijau.

Hasil dari elektroforesis praktikum

PCR yang dilakukan dapat dilihat dari
gambar disamping yang merupakan
hasil pengukuran dari Gel.doc. Pada
gambar disamping dapat dilihat pita
DNA bertumpuk dan untuk band tidak
terlihat pada gel penyangga DNA nya
ada tetapi tidak dapat dibaca. Hal ini
disebabkan oleh perbedaan nyata antara
pita yang dipengaruhi oleh persentasi
agarose, waktu elektrofosresis dan
konsentrasi EtBr. Sehingga praktikum
DNA ini belum berhasil.

3.2. Pembahasan
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
berimgrasinya molekul. Media penyangga yang dipakai pada praktikum kali ini
adalah gel agarose. Matriks agarose yang berfungsi untuk memisahkan protein
berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer agar muatan protein tidak
berubah. Mesin elektroforesis dinyalakan dengan tegangan 60 V selama 50 menit.
Pada saat proses elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari
elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu dan pada gel
agarose tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya
maka semakin jauh juga protein bergerak dengan kata lain mobilitasnya tinggi.
Begitu pula sebaliknya protei yang berat molekulnya lebih besar akan bergerak
pada jarak yang lebih pendek dengan kata lain mobilitasnya rendah. Protein
dengan mobilitas tinggi akan berhenti bergerak pada bagian bawah gel, sedangkan
protein yang mobilitasnya rendah. Dengan demikian pada jalur pergerakan protein
akan didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band atau pita protein) yang
sudah terseparasi berdasarkan berat molekulnya.
Elektroforesis hasil PCR yang didapatkan pada saat praktikum yang di foto
menggunakan Gel.doc, di dapatkan hasil yang band atau pitanya nya tidak terbaca
dan pita – pita DNA menumpuk kemudain menyebar atau dengan kata lain,
praktikum yang dilakukan tidak berhasil. Hal ini dikarenakan oleh perbedaan
nyata antara pita yang dipengaruhi oleh persentasi agarose, waktu elektrofosresis
dan konsentrasi EtBr, dan pita – pita DNA masih tercampur dengan kotoran dan
belum menjadi DNA murni.
Tahap annealing merupakan tahap yang penting dalam PCR, karena jika
suhu annealing terlalu rendah bisa membentuk hasil yang tidak spesifik, begitu
juga jika terlalau tinggi maka akan menyebabkan penguraian utas tunggal primer
DNA. Suhu annealing optimum untuk beberapa pasangan primer template dan
suhu optimumnya merupakan suatu fungsi dari melting temperature dari pasangan
primer yang kurang stabil. Pada suhu 55C primer akan menempel pada cetakan
yang sudah terpisah menjadi rantai tunggal.
Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah
sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan dalam
perikanan pada proses annealing itu sekitar 55C - 63C dan suhu yang digunakan
pada saat praktikum itu 55C -65C, pada suhu yang lebih tinggi spesifitas reaksi
akan meningkat, tetapi secara keseluruhan akan menurunkan efeiensinya.
Keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu
DNA template, primer, buffer PCR, MgCl2, enzim polimerase, suhu waktu dan
jumlah siklus, suhu annealing ditentukan oleh susunan primer. (Rahmaningsi,
2016).
Tegangan pada elektroforesi adalah 50 – 100 V dan tengangan yang
digunakan pada saat praktikum untuk elektroforesi itu adalah 60 V dalam waktu
50 menit. Hal ini dikarenakan semakin rendah tengangan pada elektroforesis
maka semakin lama waktu yang dibutuhkan, begitu juga sebaliknya semakin
tinggi tegangan pada elektroforesis maka semakin cepat waktunya. PCR dan
elektroforeis memang harus dilakukan secara berulang ulang agar mendapatkan
hasil yang maksimal. (Rahmaningsih, 2016)
 BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik memperbanyak
DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh sepasang primer.
Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA target dalam jumlah
jutaaan kali hanya dalam beberapa jam. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya.
Pada prinsipnya DNA mengalami denaturasi yang berlangsung pada suhu
94 - 98C, selama tahap ini rantai ganda DNA akan terpisah menjadi rantai
tunggal. Selanjutnya tahap penempelan (annealing) merupakan proses
penempelan primer pada bagian DNA template yang komplemen urutan basanya
dan berlangsung pada suhu 50 - 65C. tahap annealing berlangsung selama 1 – 2
menit. Terakhir tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA,
dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA
target yang akan bergerak dari ujung 5’ menuju 3’ dari untai tunggal DNA.
 DAFTAR PUSTAKA

Hastuti, S.D, 2016. Buku Penuntun Praktikum Bioteknologi Perikanan.

Laboratorium Bioteknologi Universitas Muhammadiyah Malang.

Ikhwan, Ali. 2014. Analisis Biologi Molekuler. Penerbit Deepublish. Yogyakarta.

Rahayu, D.A, Nugroho, E.D. 2016. Penuntun Praktikum Bioteknologi. Penerbit

Deepublish. Yogyakarta.

Rahmaningsih, S. 2016. Hama dan Penyakit Ikan. Penerbit Deepublish.

Yogyakarta.