IDENTIFIKASI DNA DARI

BAKTERI ESCHERICHIA
COLI MENGGUNAKAN
METODE
PCR(POLYMERASE CHAIN
REACTION)
Kelompok 8
1. Nirwana Arinatupa Ritonga (200205127)
2. Tasya Barokah (200205147)
3. Yeti Oktafiani Sari. ( 200205148)
4. Fatma kirani (200205112)
5. Ines Rebeka Zebua ( 190205115)
 DNA
Defenisi DNA Asam Deoksiribonukleat (DNA)
merupakan materi genetik yang membawa
informasi genetik bagi seluruh makhluk hidup.
DNA terdiri atas bagian yang mengkode
genetik (ekson), bagian yang tidak mengkode
genetik (intron) dan bagian yang mengatur
regulasi genetik
 Karena fungsinya yang membawa
informasi genetik, DNA sangat berguna
dalam identifikasi penyakit infeksi kanker,

FUNGSI kelainan genetik, bahkan forensik. Setelah

tiga belas tahun lalu, Human Genome

DNA Project berhasil mencatat peranan gen-gen

pada genom manusia, kini dunia medis
memasuki era farmakogenomik, untuk
tercapainya personalized medicine.
Pengobatan akan lebih tepat sasaran jika
mengacu pada diagnosis molekuler.
 Peranan diagnostik molekuler
dalam personalized medicine

1.Deteksi dini dan pemilihan metode

pengobatan yang aman dan efektif berdasarkan
diagnosis molekuler
2.Integrasi antara diagnostik molekuler dengan
terapi
3.Pemantauan terapi serta penentuan prognosis
Teknik Identifikasi
Molekuler
Salah satu teknik identifikasi molekuler
yang dapat digunakan sebagai sarana
diagnosis penyakit adalah teknik
amplifikasi DNA. Teknik ini mampu
melipat gandakan untai DNA sampel
sehingga dapat dianalisis dengan lebih
jelas. Sejak awal ditemukannya, teknik
amplifikasi DNA yang digunakan adalah
Polymerase Chain Reaction (PCR)
 PCR
Polymerase chain reaction atau PCR
(reaksi berantai polimerase)
adalah teknik untuk
mengaplifikasikan fragmen DNA
dalam jumlah besar secara enzimatik
tanpa menggunakan organisme.
amplifikasi DNA menghasilkan jutaan
salinan fragmen DNA
 ✓ Untuk skrining atau sekuensing
secara cepat
KEGUNAAN ✓ Sebagai pelacak peristiwa kriminal
pada bagian forensik
PCR ✓ Diagnosa secara dini penyakit
hepatitis B, TBC dll
✓ Mendeteksi bakteri patogen dalam
air dan lingkungan (sensitivitas 1-
10sel/100ml air).
ALAT PCR
Pengembangan Teknologi
PCR
PCR dikembangkan pada tahun 1984 oleh
seorang biokimiawa bernama Kary Mullis.
PCR atau reaksi berantai polimerase adalah
suatu metode enzimatis dalam bidang
biologi molekuler yang bertujuan untuk
melipat gandakan secara eksponensial
suatu sekuen nukleotida tertentu dengan
jumlah kelipatan ribuan hingga jutaan
salinan secara in vitro, Ketika awal
perkembangannya, metode ini hanya
digunakan sebagai metode untuk melipat
gandakan DNA. Kemudian, metode ini
dikembangkan untuk melipat gandakan dan
melakukan kuantitasi molekul mRNA.
 TEKNIK
PCR
Teknik PCR dinilai memiliki cukup banyak keunggulan dalam
mendiagnosis penyakit, namun teknik ini juga memiliki beberapa
kekurangan. Oleh karena itu, beberapa peneliti mengeksplorasi teknik
amplifikasi DNA lebih lanjut, sehingga mereka menemukan metode
amplifikasi yang disebut Loop-mediated Isothermal Amplification
(LAMP). Baik PCR maupun LAMP, masing-masing memiliki kelebihan
dan kekurangan dalam penggunaannya. Artikel ini akan mengulas
mengenai perbedaan prinsip kerja, kelebihan, kekurangan, dan aplikasi
teknik PCR dan LAMP sebagai metode diagnosis molekuler.
 Prinsip Kerja PCR
Menggandakan potongan DNA tertentu dari
seluruh untaian DNA, baik yang berasal dari DNA
sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti DNA
mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA).
Untuk mendapat potongan DNA, diperlukan
Primer yang berfungsi untuk menandai dimana
ujung DNA yang akan digandakan. Primer
biasanya berpasangan, yaitu Primer forward untuk
menandai ujung depan untai DNA dan Primer
Reverse untuk menandai dari ujung belakang.
Karena DNA terdiri dari 2 untai pilinan ganda
(double strand), maka DNA Primer forward
bekerja pada strand yang satu sementara Primer
Reverse bekerja pada untai pilihan yang satunya.
 BAHAN REAKSI PCR

campuran reaksi yang terdiri dari:

✓ 200ng DNA template,
✓ 0.15M dari masing-masing oligonukleotida primer,
✓ 200M dari masing-masing dNTPs,
✓ 2mM MgCl2,
✓ 10 buffer dan
✓ 1,5 unit Taq DNA polymerase  dalam 0,6ml tabung
effendorf dengan total volume 50L
 SIKLUS PCR
✓ Denaturasi : 94oC, 15 detik
✓ Primer annealing : 55oC, 30 detik
✓ Primer extension: 72oC, 2 menit
✓ Akhiri siklus terakhir dengan
perpanjangan pada 72oC selama 5
menit. Kemudian hentikan dengan
mendinginkan pada suhu 4oC dan
menambahkan 10mM EDTA (bila
diperlukan).
 PROSES PCR
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi
tahap denaturasi, pemisahan kedua untai DNA pada temperatur
tinggi. DNA akan terdenaturasi pada temperatur 90 hingga 97 ºC ,
Pada teknik PCR, denaturasi terjadi pada temperatur 94ºC selama
15 detik
annealing, tahap penempelan primer pada pita DNA yang sesuai,
pada suhu 55 hingga 60ºC selama 30 detik dan
ekstensi oleh enzim DNA polimerase pada suhu 72ºC dalam
waktu yang disesuaikan dengan panjang atau pendeknya ukuran
DNA yang diharapkan sebagai produk amplifikasi Umumnya,
waktu yang digunakan untuk ekstensi DNA pada PCR yaitu 2 – 3
menit.
 Siklus Reaksi
Siklus Reaksi PCR dilakukan dengan
mengulangi siklus Reaksi perlipat
gandaan sebanyak 20-30 siklus.
Banyak siklus yang dilakukan
tergantung pada konsentrasi awal
DNA target yang dilipatgandakan
 Hal-hal penting yang perlu
diperhatikan dalam reaksi PCR
1. Konsentrasi enzim

Taq DNA polimerase, konsentrasi: unit per 5L reaksi. Perlu optimisasi. Konsentrasi enzim
terlalu tinggi  background non-spesifik, terlalu rendah  tidak cukup produk.

2. Konsentrasi dNTPs

Konsentrasi masing-masing dNTPs: 200M  hasil yang baik. Pengurangan konsentrasi

dNTPs dapat mengurangi mispriming pada tempat-tempat bukan target, dan mengurangi
kemungkinan perluasan kesalahan penggabungan nukleotida.
3. Konsentrasi Magnesium

Sangat penting untuk dioptimumkan konsentrasinya.

Mg mempengaruhi: penguatan primer (primer annealing), suhu peruraian

pada template, spesifikasi produk, formasi primer-dimer, dan aktifitas serta
fidelitas enzim. Masing-masing reaksi PCR diperlukan mM melebihi
konsentrasi dNTP. EDTA dalam stok primer dapat mengganggu konsentrasi
optimum mg.
.4. Primer

Kontrasi primer: terjadi kesalahan priming (mispriming) dan penumpukan hasil yg tidak spesifik
serta menyebabkan munculnya primer-dimer (independent template),  produk yg diinginkan
menjadi rendah.

Usahakan melting temperatur antara 55-80oC.

Primer annealing: tergantung pada komposisi dasar, panjang dan konsentrasi primer, normalnya 5oC
dibawah melting temperaturnya (hasil terbaik biasanya antara 55-75oC). Peningkatan suhu
annealing dapat msedikit kesalahan pemanjangan nukleotida.

Primer extension, tergantung pada panjang dan konsentrasi target sekuen serta temperatur;
optimumnya 72oC.
 Tahapan-Tahapan Polymerase
Chain Reaction (PCR) :
1.Denaturasi DNA untai ganda akan membuka menjadi dua
untai tunggal.
2.Penempelan primer, primer akan menuju daerah yang spesifik
yang komplemen dengan urutan primer.
3.Reaksi polimerisasi (Extension) Primer yang telah menempel
tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan
penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA
polimerase.
 Selain ketiga proses tersebut, PCR didahului dan diakhiri
oleh tahapan berikut
✓ Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk
memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi
DNA Polymerase
✓ Final elongasi
Dilakukan pada suhu optimum enzim (70oC -72oC)
selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas
tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara
sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR
terakhir.
Faktor yang dapat menentukan tingkat
keberhasilan teknik amplifikasi DNA
menggunakan PCR
Faktor-faktor itu antara lain deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP); oligonukleotida
primer; DNA cetakan (template); komposisis larutan buffer; jumlah siklus reaksi;
enzim yang digunakan; dan faktor teknis dan non-teknis lainnya, seperti kontaminasi.
PCR memiliki keunggulan yaitu mampu melipat gandakan suatu fragmen DNA
sehingga mencapai 109 kali lipat. Oleh karena itu, adanya kontaminasi dalam jumlah
sangat sedikit sekalipun dapat mengakibatkan terjadinya kesalahan dengan
menghasilkan produk amplifikasi yang tidak diharapkan.
Faktor yang dapat menentukan tingkat
keberhasilan teknik amplifikasi DNA
menggunakan PCR
Amplikon, atau hasil amplifikasi DNA dengan PCR dapat dilihat
setelah melalui teknik elektroforesis. DNA amplikon diberi
pewarnaan dengan ethidium bromida yang akan berfluoresens
ketika dipaparkan pada sinar UV level medium dengan Panjang
gelombang 300nm dari UV transilluminator.
 TEKNIK
PCR
Teknik PCR dinilai memiliki cukup banyak keunggulan dalam
mendiagnosis penyakit, namun teknik ini juga memiliki beberapa
kekurangan. Oleh karena itu, beberapa peneliti mengeksplorasi teknik
amplifikasi DNA lebih lanjut, sehingga mereka menemukan metode
amplifikasi yang disebut Loop-mediated Isothermal Amplification
(LAMP). Baik PCR maupun LAMP, masing-masing memiliki kelebihan
dan kekurangan dalam penggunaannya. Artikel ini akan mengulas
mengenai perbedaan prinsip kerja, kelebihan, kekurangan, dan aplikasi
teknik PCR dan LAMP sebagai metode diagnostik molekuler.
 Kelebihan Dan Kekurangan
Teknik PCR

PCR memiliki kelebihan dengan

keakuratannya dalam menguji
atau mendeteksi keberadaan
virus SARS-COV-2 atau COVID-
19 pada awal infeksi virus dalam
tubuh seseorang.
 Kekurangan:
Kekurangannya adalah, metode
ini memerlukan prosedur
pemeriksaaan yang lebih rumit
dan waktu hasil pemeriksaannya
yang lebih lama.
Terima
kasih