Tugas Bioteknologi

“ Polymerase Chain Reaction(PCR)”

Dosen : Prof. Dr Marlina,M.Si Apt.

AFRIYANI
1821012027
Program Pascasarjana
Fakultas Farmasi
Universitas Andalas
Padang 2018
 DEFENISI Keuntungan

Komponen proses
Kelemahan
PCR

Tahapan penting
dalam proses PCR Aplikasi

Jenis-jenis PCR
 Defenisi

Polymerase Chain Reactions 

suatu teknik
perbanyakan(replikasi) DNA
secara enzimatik tanpa
menggunakan organisme.
Contoh instrumen
Komponen proses PCR

DNA cetakan

Oligonukleotida senyawa
primer buffer

Deoksiribonukelotida Enzim DNA

trifosfat (dNTP), Polimerase
DNA cetakan,

• DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipat gandakan.

• Berkisar antara 10 5– 10 6 molekul.
• Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.
Oligonukleotida primer.

• Suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 – 28 basa

nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis
rantai DNA.
• Mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60%
Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP),

• Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari

dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
• dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah
konsentrasi efektif ion.
• Untuk reaksi polimerasi
• Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan
katalisis reaksi sintesis rantai DNA.
• Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer.
Larutan buffer PCR
• Umumnya mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8
(suhu 20 o C); 50 Mm, KCl; 0,1% gelatin atau BSA
(Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak 0,01%
atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%;
disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2
Tahapan penting dalam proses PCR

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang

selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung
dengn cepat.

Perpanjangan
Rantai DNA

Anneling

denaturasi
DENATURASI

A. Denaturasi

1. Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal.

2. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95
oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk
meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal.

3. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat

menyebabkan utas DNA terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama
dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase
Anneling

• Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap

annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR,
karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka
akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk
DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap
ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing
yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita
elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang
tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi.
Perpanjangan DNA

• Extension merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension

atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan
nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA
utas ganda.

• Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti
perubahan konsentrasi DNA.
Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan
(template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi
berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target
meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi
milyaran amplifikasi DNA target. 
 TIPE PCR

1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); metode

ini digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan
analisis model derifat dari perbedaan DNA.

2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen

internal yang diketahui.
Metode ini khusus digunakan untuk mengidentifikasi ”sekuen antara”
dari beragam gen.
 Tipe PCR

3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi

pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak
diperlukan. Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set
kedua mengamplifikasi target kedua selama proses pertama berlangsung

4. Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil produk PCR.

Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur kuantitas, dimulai dari
jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode ini juga menampilkan copy dari
sampel
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk
amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan
RNA. Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase (mengubah
RNA menjadi cDNA), mencakup pemetaan, menggambarkan kapan
dan dimana gen diekspresikan

6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) bertujuan untuk

mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh
Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan teknik PCR
menggunakan primer – primer dengan sequens acak untuk keperluan
amplifikasi lokus acak dari genom.
 KELEBIHAN PCR
Memiliki spesifisitas
tinggi

Sangat cepat, dapat memberikan hasil

yang sama pada hari yang sama

Dapat membedakan varian

mikroorganisme

Mikroorganisme yang
dideteksi tidak harus hidup

Mudah di set up
 KELEMAHAN

Teknik
Interpretasi hasil
prosedur yang
Sangat PCR yang positif
Biaya peralatan kompleks dan
belum tervalidasi
mudah dan reagen bertahap
untuk semua
terkontamin mahal membutuhkan
penyakit infeksi
asi keahlian
(misalnya infeksi
khusus untuk
pasif atau laten)
melakukannya.
Aplikasi
 Aplikasi PCR

Jurnal Application of nested PCR for diagnosis of histoplasmosis

Jenis PCR yang Untuk

digunakan Mendiagnosis
Nested PCR Histoplasmosis
• Histoplasmosis adalah
penyakit infeksi jamur pada
paru-paru yang disebabkan
karena menghirup spora
jamur
•  Histoplasma capsulatum.
Spora jamur ini bisa
ditemukan di tanah atau
pada kotoran burung dan
kelelawar, dan paling sering
ditularkan melalui udara
 Metode pcr mampu mendeteksi 4
Sampelnya sedikit dari 5 kasus histoplasmosis

Metode kultur jaringan

Dibandingkan medote kultur
memiliki sensitivitas rendah
jaringan dan PCR nested
secara umum
1. Sampel serum diuji menggunakan anti-H. capsulatum var. Capsulatum
alat tes antibody enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit
(Histoplasma DxSelect; Focus Diagnostics, Cypress, CA,USA)
2. DNA diekstraksi dari spesimen jaringan biopsi (Potong kecil-kecil
menggunakan pisau steril) menggunakan Dneasy Blood & Tissue Kit
(Qiagen, Jerman). 
3. Lima mikroliter dari larutan DNA digunakan untuk PCR. Seratus
mikroliter sampel cairan (termasuk serum) dicampur dengan volume
buffer lysis yang sama, diikuti oleh proteinase K (60 μg / ml) dan
jumlah yang cukup Unit Westase (Takara Bio, Otsu, Jepang)
4. DNA tersebut diekstrak dari sampel jaringan tertanam parafin
(beberapa irisan per sampel) menggunakan kit DEXPAT (Takara Bio)

5. Lima (5 μl ) hingga 10 μl masing-masing sampel digunakan untuk

PCR menggunakan set modifikasi primer. Primer menguatkan
segmen gen H. antagonulatum M antigen PCR putaran pertama
dilakukan menggunakan primer Msp1F dan Msp2R , PCR
dikonduksi dengan menggunakan Msp2F dan Msp3R (5 0 
ATAAGGACGTCACGAAGGGCC-3 0 ) primer dengan 5–10 ml produk
PCR putaran pertama
• PCR menhasilkan volume reaksi 50-μl yang
mengandung 1,25 U Takara Ex Taq (Takara Bio), 19 Ex
Taq buffer, 4 μl setiap dNTP (Takara Bio), dan 1 μM
setiap primer. 
TERIMAKASIH   