RT-PCR

(Reverse Transcriptase PCR)

KELOMPOK 1
1. Anis Khoerunnisa (31119038)
2. Ditha Rizqi Aulia Utami (31119024)
3.Yadi Aditya Prawira (31119040)
4. Rika Merida (31119026)
5. Shofani Aulia Subela (31119034)
6. Riyan Aryanti (31119036)
7.Muflihah Nurazizah (31119008)
8.Tary Novitri (31119050)
9. Rifa Agnia Farid (31119004)
10. Suroyya Nur I (31119003)
11. Silvie Permata Sari (31119017)
12. Alhikam Nazabulah (31119009)
 Pendahuluan
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
adalah suatu metode untuk mendeteksi
ribonucleic acid (RNA) yang dapat
menggambarkan viabilitas lebih baik karena
RNA 3 didegradasi beberapa menit setelah
sel mati. RT-PCR merupakan Amplifikasi DNA
dengan template RNA. Terdiri dari 2 tahap :
RT : Reverse Transcription berguna untuk
cDNA Synthesis dan PCR untuk Amplifikasi
DNA
Teknik ini memanfaatkan kehadiran enzim Polymerase yang bersifat termostabil untuk
mengamplifikasi molekul DNA secara in vitro. Teknik ini mampu memperbanyak segmen DNA
tertentu yang telah ditandai oleh primer, dalam jumlah ribuan hingga jutaan copy dalam waktu
beberapa jam saja.
 Sejarah
Awal mula RT-PCR digunakan yaitu sebagai pengganti Northern blotting
karena memiliki kelemahan yaitu:
1. Teknik ini memakan waktu
2. Sejumlah besar RNA diperlukan untuk deteksi
3. Kuantifikasi tidak akurat pada kelimpahan rendah.
Namun sejak penemuan PCR oleh Kary Mullis pada tahun 1983, RT-
PCR telah menggantikan Northern blot sebagai metode pilihan untuk deteksi
dan kuantifikasi RNA.
 Sejarah
RT-PCR telah menjadi teknik benchmark untuk mendeteksi dan
membandingkan kadar RNA karena:
1. Tidak memerlukan pemrosesan pasca-PCR
2. Kelimpahan RNA (>107kali lipat) yang luas dapat diukur
3. Memberikan wawasan tentang data kualitatif dan kuantitatif, Karena
kesederhanaan, spesifisitas dan sensitivitasnya, RT-PCR digunakan untuk
berbagai aplikasi, mulai dari eksperimen sederhana seperti kuantifikasi sel ragi
dalam anggur untuk penggunaan yang lebih kompleks sebagai alat diagnostic
untuk mendeteksi pathogen menular seperti flu burung, virus dan SARS-CoV-2.
 Prinsip
Dalam RT-PCR, template RNA
pertama-tama diubah menjadi
sebuah yang saling melengkapi
DNA (cDNA) menggunakan
sebuah reverse transcriptase/
transcriptase balik. cDNA
kemudian digunakan sebagai
template untuk amplifikasi
eksponensial menggunakan
PCR.
 Langkah RT-PCR
 Step 1 Menentukan Pendekatan RT PCR

Dalam melakukan RT-PCR,

metode satu langkah dan dua langkah
adalah dua pendekatan yang umum,
masing-masing dengan kelebihan dan
kekurangannya sendiri. RT-PCR satu
langkah menggabungkan sintesis cDNA
untai pertama (RT) dan PCR berikutnya
dalam tabung reaksi tunggal. Namun, RT-
PCR dua langkah memerlukan dua reaksi
terpisah, dimulai dengan sintesis cDNA
untai pertama (RT), diikuti dengan
amplifikasi sebagian cDNA yang
dihasilkan oleh PCR dalam tabung terpisah.
Langkah RT-PCR
 Langkah RT-PCR
 Step 2 Prepare Sample
Total RNA secara rutin digunakan dalam RT-PCR satu langkah. Mempertahankan
integritas RNA sangat penting dan memerlukan tindakan pencegahan khusus selama
ekstraksi, pemrosesan, penyimpanan, dan penggunaan eksperimental. Tujuan utama dari
alur kerja isolasi adalah untuk menstabilkan molekul RNA, menghambat RNase, dan
memaksimalkan hasil dengan metode penyimpanan dan ekstraksi yang tepat.
 Step 3 Design Primer
RT-PCR satu langkah Superscript IV merekomendasikan penggunaan primer spesifik
gen (GSP). Oligo (dT) atau primer acak tidak direkomendasikan, karena produk non-
spesifik dapat dihasilkan, sehingga mengurangi jumlah produk RT-PCR target. Merancang
GSP yang baik adalah langkah pertama menuju keberhasilan percobaan RT-PCR satu
langkah.
 Step 4 Hapus DNA genom
Penghapusan DNA genom dengan DNase konvensional dapat menyebabkan tingkat
kehilangan atau kerusakan RNA yang berbeda, yang mengarah pada hasil yang tidak
konsisten. Enzim DNase generasi baru - Enzim ezDNase Invitrogen secara signifikan
mengurangi kemungkinan sintesis cDNA terganggu karena pengobatan DNase.
Langkah RT-PCR
 Step 5 Lakukan RT-PCR satu langkah

Sistem RT-PCR Satu Langkah Invitrogen

SuperScript IV menggabungkan Proses Tinggi
SuperScript IV Reverse Transcriptase dan
Invitrogen Platinum SuperFi DNA polimerase untuk
memberikan kinerja RT-PCR satu langkah.

 Mekanisme aktivasi hot-start dua fase untuk

spesifisitas analitik yang tinggi, hasil, dan pengaturan
suhu kamar
 Aplikasi
Aplikasi eksponensial melalui reaksi rantai polimerase transkripsi balik menyediakan
teknik yang sangat sensitif di mana jumlah salinan molekul RNA yang sangat rendah
dapat dideteksi. RT-PCR banyak digunakan dalam diagnosis penyakit genetik dan
secara semikuantitatif dalam penentuan ukuran ekspresi gen.

 Metode penelitian : Sebagai contoh, Lin et al. menggunakan RT-PCR untuk mengukur
ekspresi gen gal dalam sel ragi.
 Penyisipan Gen : RT-PCR juga dapat sangat berguna dalam penyisipan gen eukariotik
ke dalam prokariota. RT-PCR umumnya digunakan dalam mempelajari genom virus
yang genomnya tersusun dari RNA, seperti virus influenza A dan retovirus seperti HIV.
 Aplikasi
 Diagnosis Penyakit Genetik : RT-PCR dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit
genetik seperti sindrom Lesch-Nyhan. Juga dapat digunakan sebagai tes flu burung-
H7N9.
 Deteksi Kanker : Para ilmuwan sedang mengerjakan cara untuk menggunakan RT-PCR
dalam deteksi kanker untuk membantu meningkatkan prognosis dan memantau terapi
respons.
 RT-PCR umumnya digunakan dalam mempelajari genom virus yang genomnya terdiri
dari RNA, seperti influenzavirus A dan retrovirus seperti HIV.
 Masalah Teknis
 RT-PCR membutuhkan teknisi profesional yang mampu melakukan pemeriksaan RT-PCR
dan menganalisis data dengan tepat, serta peralatan khusus karena proses pengerjaannya
yang relatif lebih rumit
 Pada metode RT-PCR, kesalahan pengerjaan yang tidak sesuai dengan prosedur dimulai
dari pra analitik misalnya identifikasi sampel yang salah
 Proses pengambilan sampel yang tidak benar
 Kualitas spesimen yang buruk atau hanya mengandung sangat sedikit sampel
 Kondisi pengiriman dan penyimpanan sampel yang tidak akurat
 Solusi

Untuk menghindari kesalahan saat identifikasi sampel, harus memperhatikan beberapa hal,
diantaranya :

- Kondisi pengemasan, pengiriman dan penyimpanan sampel harus akurat. Spesimen dari pasien
yang diduga MERS-CoV harus dikemas, dikirim, dan diangkut sesuai dengan International Air
Transport Association (IATA) yang terbaru. Spesimen harus disimpan dan dikirim pada suhu yang
sesuai.
- Pada saat pemipetan, hindari terbentuknya aerosol dan gunakan mikropipet filter tip.
- Simpan semua reagen dalam aliquot untuk meminimalisir resiko terpapar kontaminasi
 Solusi
- Untuk menghindari kontaminasi silang, Cryotube dililit parafilm dan masukkan
ke dalam Plastik Klip.
- Pada metode RT-PCR, mengingat proses pengerjaan yang lebih kompleks maka
diperlukan petugas laboratorium dengan keahlian khusus dan berkompeten untuk
mengurangi kemungkinan kesalahan teknis.
 Perbedaan RT PCR & PCR Konvensional
PCR konvensional digunakan
untuk membalikkan transkripsi mRNA
ke cDNA dan kemudian memperkuat
hasil ini menggunakan PCR tradisional.
Sedangkan Reverse Transcriptase (RT-
PCR) digunakan untuk amplifikasi, isolasi
atau identifikasi sekuen dari sel atau
jaringan RNA. Metode ini dibantu oleh
reverse transcriptase (mengubah RNA
menjadi cDNA), mencakup pemetaan,
menggambarkan kapan dan dimana gen
diekspresikan.
 Perbedaan RT PCR & PCR Konvensional
Ada beberapa alasan mengapa peneliti akan menggunakan RT-PCR
sebagai lawan pcr,(Keunggulan dari RT-PCR) yaitu:
1. 1. mRNA merupakan pesan yang dikirim untuk diterjemahkan, RT-
PCR dapat memberi kita pengukuran ekspresi gen yang tidak dapat
dilakukan PCR.
2. 2. cDNA yang dihasilkan tidak mengandung intron seperti yang
dimiliki DNA, oleh karena itu RT-PCR dapat memberi gen yang
dapat dimasukkan ke dalam prokariota (yang tidak dapat dan tidak
memisahkan intron keluar).
 Kesimpulan
RT-PCR merupakan Amplifikasi DNA dengan template RNA • Terdiri dari 2
tahap: RT : Reverse Transcription berguna untuk cDNA Synthesis dan PCR untuk
Amplifikasi DNA, teknik ini memanfaatkan kehadiran enzim Polymerase yang bersifat
termostabil untuk mengamplifikasi molekul DNA secara in vitro.

Perbedaan RT PCR dan PCR Konvensional yaitu analisis hasil amplifikasi fragmen
DNA pada PCR konvensional dilakukan dengan visualisasi di agar elektroforesis. Resiko
kontaminasi yang terjadi pada PCR real time sangat kecil, karena amplifikasi PCR real
time dilakukan dalam sistem yang tertutup dan tidak memerlukan tahapan-tahapan yang
panjang seperti yang dilakukan di PCR konvensional. Jika dibanding kan dengan PCR
konvensional dengan biaya yang relatif lebih murah.
 Daftar Pustaka
• Hewajuli, D. A., & Dharmayanti, N. L. P. I. (2014). Perkembangan Teknologi Reverse
Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan
Newcastle Diseases. Wartazoa, 24, 16-29.
• Agustina, A. S., & Fajrunni'mah, R. (2020). Perbandingan metode RT-PCR dan tes rapid
antibodi untuk deteksi COVID-19. Jurnal Kesehatan Manarang, 6(Khusus), 47-54.
• Gayatri, L., Listiawan, M. Y., & Agusni, I. (2014). Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) untuk Mendeteksi Viabilitas Mycobacterium leprae pada Pasien Kusta
Tipe Multibasiler Pascapengobatan MDT-WHO. Berkala Ilmu Kesehatan Kulit dan
Kelamin, 26(2), 1-6.
• Agustina, A. S., & Fajrunni'mah, R. (2020). Perbandingan metode RT-PCR dan tes rapid
antibodi untuk deteksi COVID-19. Jurnal Kesehatan Manarang, 6(Khusus), 47-54.
• Lippi, G., Simundic, A.-M., & Plebani, M. (2020). Potential preanalytical and analytical
vulnerabilities in the laboratory diagnosis of coronavirus disease 2019 (COVID-19). Clinical
Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), (0).
Thank
You!