LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA II

ReverseTranscriptionPCR (RT-PCR)

DISUSUN OLEH:

NAMA :RESTI YULIA

NIM : 19032047

KELAS : BIOLOGI C

KELOMPOK : 1

DOSEN PENGAMPU :

Dr.DWI HILDA PUTRI,S.Si.,M.Biomed

ASISTEN:

1.AZZAHRA KHAIRUNNISA

2.NUR AZZIMA

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PADANG

2021
 ReverseTranscriptionPCR (RT-PCR)

A.Tujuan Praktikum

1. Praktikan memahami prinsip dogma central biologi

2. Praktikan memahami prinsip dan langkah kerja RT-PCR

B. Waktu dan Tempat Praktikum

Hari/Tanggal : Rabu /20 oktober 2021

Pukul : 09.40-12.20 WIB

Tempat : Rumah saya(melalui daring atau online)

C.Dasar Teori

Enzim reversetranscriptase (RT) merupakan salah satu reagen yang sangat

penting dalam bidang biologi molekuler, yaitu untuk mensintesis DNA
komplementer (cDNA) dari messenger RNA (mRNA). Kombinasi antara aktivitas
RT dan amplifikasi PCR telah menjadi suatu goldstandard dalam proses
pengklonan daerah pengkode gen dari berbagai target yang diinginkan. Dengan
demikian, enzim RT telah menjadi bagian penting dalam perkembangan
biologimolekuler, genetik, dan biomedis. Tujuan dari penelitian ini ialah
menghasilkan enzimrekombinan RT-RNase H simianbetaretrovirus serotype-2
(SRV-2) yang diisolasi dari monyet ekor panjang (Macacafascicularis) asal
Indonesia. Tahapan penelitian yang telah dilakukan ialah ekspresi gen penyandi
RT SRV-2 menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli, pemurnian, analisis
hasil ekspresi, dan aplikasi pada teknik RT PCR. Hasil analisis ekspresi protein
dengan teknik SDS PAGE menunjukkan ada pita protein spesifik berukuran
sekitar 32,7 kDa yang kemungkinan merupakan pita RT SRV-2. Aplikasi enzim
RT SRV-2 dalam teknik RT PCR berhasil mentranskripsi balik mRNA pada
beberapa target gen, yaitu β-globin, virus CDV, dan env virus SRV-2. Hal ini
menunjukkan bahwa enzim rekombinan RT SRV-2 berhasil dikembangkan dan
menunjukkan aktivitas walaupun masih rendah dibandingkan enzim
komersial(Saepuloh,2013).
 Gencarnya penelitian mengenai enzim RT dipicu oleh penemuan retrovirus
manusia, yaitu human immunodeficiency virus (HIV) pada tahun 1980-an yang
merupakan agen patogen penyebab terjadinya
acquiredimmunodeficiencysyndrome (AIDS) pada manusia. Telah tersedianya
informasi mengenai retrovirus dan RT sangat membantu dalam identifikasi dan
penelitian mengenai agen patogen ini. Tingginya morbiditas dan mortalitas pada
penderita HIV/AIDS mengharuskan ditemukannya agen antiretrovirus dan enzim
RT ini menjadi target utama untuk dihambat melalui penemuan senyawa anti-RT
(Hizi&Herschhorn 2007).

Penelitian enzim RT terus berkembang tidak hanya terhadap virus HIV

tetapi juga dari berbagai jenis virus lainnya dari famili Retroviridae. Tujuan
penelitian tersebut selain untuk pencarian model virus dalam pengembangan anti
RT HIV, juga untuk pemenuhan enzim rekombinan RT yang mempunyai aktivitas
enzim tinggi. Berbagai jenis RT yang telah dipelajari antara lain berasal dari
molonymurine leukemia virus (MuLV), mouse mammarytumourvirus(MMTV),
aviansarcomaandleukosis virus (ASLV), Mason-Pfizermonkey virus (MPMV),
baboonendogenous virus (BaEV), felineimmunodeficiency virus (FIV), human T
lymphotropic virus (HTLV), dan simianimmunodefieciency virus (SIV) (Flint et
al.2009; Herschhorn&Hizi 2010).

Reaksi PCR real time dapat dilakukan satu tahap (one step real time PCR)
maupun dua tahap (two step real time PCR). Keseluruhan reaksi sintesis cDNA
sampai amplifikasi PCR dalam PCR real time satu tahap dilakukan dalam satu
tabung. PolymeraseChainReaction (PCR) real time satu tahap dapat
meminimalkan variasi perlakuan laboratorium karena reaksi kedua enzim terjadi
dalam satu tabung. Reaksi reversetranscriptase pada proses PCR real time dua
tahap dilakukan terpisah dari pengujian PCR real time. Prosedur PCR real time
dua tahap akan bekerja lebih baik ketika menggunakan suatu DNA
bindingdyeseperti SYBR green I karena akan lebih mempermudah untuk
mengeliminasi primer-dimer melalui manipulasi Tm. SYBR green I merupakan
salah satu jenis DNA bindingdye yang mempunyai kemampuan mengikat 100 kali
lebih tinggi dan relatif lebih ramah lingkungan jika dibandingkan dengan
ethidiumbromide. Bahkan, DNA bindingdye ini lebih mudah diterapkan karena
tidak memerlukan adanya probe yang spesifik dan biaya yang dibutuhkan relatif
terjangkau. PCR real time dua tahap memberikan kemungkinan untuk terjadinya
peningkatan kontaminasi DNA (Vandesompeleetal. 2002; Giglioetal. 2003).

Berbagai modifikasi PCR real time telah dikembangkan untuk

meningkatkan kerja dari PCR real time seperti PCR real timemultiplek. Saat ini,
telah tersedia kit komersial untuk PCR real timemultiplek yang memungkinkan
untuk kombinasi beberapa pengujian dalam satu reaksi.
PolymeraseChainReaction (PCR) multiplek adalah amplifikasi secara
berkelanjutan dua atau lebih DNA atau cDNA target dalam satu reaksi tabung dan
hanya dapat dilakukan dengan menggunakan probe berlabel spesifik pada setiap
urutan DNA target. Kelebihan dari PCR multiplek adalah jumlah sampel yang
dibutuhkan lebih sedikit sehingga berguna apabila jumlah sampel yang tersedia
dalam jumlah terbatas dan kemampuannya untuk menggabungkan pengujian
dalam satu sistem internal kontrol (Belak 2007; Hoffmannetal. 2007).

Metode RT-PCR memiliki keunggulan karena mempunyai spesifikasi dan

sensitifitas yang tinggi se-hingga dapat mendeteksi patogen dengan titer/jumlah
yang sedikit (Wardetal. 2004).Namun metode ini memiliki kekurangan, yaitu
keberadaan senyawa inhibitor pada ekstrak RNA total tanaman yang dapat
mempengaruhi proses amplifikasi DNA target. Oleh karena itu, pemilihan metode
ekstraksi RNA yang tepat sangat berpengaruh terhadap keberhasilan deteksi RNA
virus pada jaringan tanaman(Ma dan Yang 2011).
D. Alat dan Bahan

-Alat

1. Mikropipet ukuran 0,5-10 μl dan

10-100 μl

2. Vortex

3. Spin down

4. Mesin PCR (Themalcycler)

5. Ice block

6. Peralatan elektroforesis

7. GelDoc/UV Transilluminator

-Bahan

1. Sampel RNA

2. Tips ukuran 0,5-10 μl dan 10-100 μl steril

3. PCR tube steril

4. Kit sintesis cDNA (SensifastcDNAsynthesis

kit, Bioline):

a) TransAmpBuffer (primer oligo-dT dan

randomhexamer, dNTPs, buffer)

b) Enzim ReverseTranscriptase

5. Nuclease-freewater

6. PCR master mix (MyTaq HS Red mix, Bioline)

7. Primer mt2-forward

8. Primer mt2-reverse

9. Gel agarose 1,5%

10. Buffer TAE 1x

11. DNA Ladder 100 bp

12. GelRed

13. Loadingdye
 E.Cara Kerja
No. Tahapan Prosedur Kerja
1 Sintesis cDNA a. Hitung konsentrasi rata-rata dari hasil isolasi RNA!
b. Hitung volume RNA yang akan dipipet ke dalam reaksi sintesis cDNA dengan
rumus berikut:
Volume RNA(μl) = 1000 ng
Konsentrasi rata-rata RNA (ng/μl)
c. Masukkan komponen reaksi sintesis cDNA ke dalam PCR tube sesuai tabel berikut
ini:

Komponen Volume
Reaksi (μl)
5x TransAmp Buffer 4
Enzim Reverse 1
Transcriptase
Sampel RNA (1000 X
ng)
Nuclease-free water 20-(4+1+X)
Volume Total 20

d. Vortex sebentar untuk menghomogenkan, lalu spin down agar semua campuran
berada di dasar PCR tube!
e. Atur program inkubasi reaksi sintesis cDNA di mesin PCR seperti berikut:

Taha Suhu Durasi

p (oC)
Annealing primer 25 10 menit
Reverse transcription 42 15 menit
Inaktivasi 85 5 menit
Hold 4 
(penyimpanan sementara) f. Masukkan
PCR tube
berisi reaksi sintesis cDNA ke dalam mesin PCR, lalu “START RUN”!
2 PCR Komp [Awal] [Akhir] Volume **Jumla Volume
onen per tube h Reaksi Mix
Reaksi (μl)
PCR (μl)
PCR 2x 1x 5,0 X5 25,0

Master
Mix
Primer 10 μM 0,5 μM 0,5 X5 2,5
mt2-
forward
Primer 10 μM 0,5 μM 0,5 X5 2,5
mt2-reverse
Nuclease- Mencukupkan volume 3 X5 15,0
free sampai 10 μl
water
*DNA 1  Vortex dan spin
template down mix PCR
 Bagi mix PCR @ 9
μl ke dalam 4 tube
PCR
Volume 10  Tambahkan
Total @DNA template
 Vortex dan spin
down
a. Masukkan komponen reaksi PCR ke dalam PCR tube sesuai tabel berikut:
 Gen target:
Metallothionein 2 (mt2)

Keterangan:
*DNA template yang digunakan ada 4:
1) cDNA 1 (yang disintesis dari RNA 1)
2) cDNA 2 (yang disintesis dari RNA 2)
3) RNA 1
4) RNA 2
**Jumlah reaksi: 4 + (10% x 4) = 4,4 ~ 5

b. Atur program PCR sesuai tabel berikut:

Tahap PCR Suhu (oC) Durasi Siklus

Denaturasi awal 95 1 menit
Denaturasi lanjut 95 15 detik
c. Masu
Annealing 60 15 detik 35 x
kkan
Elongasi 72 10 detik
PCR
Elongasi Akhir 72 5 menit
tube
berisi reaksi sintesis cDNA ke dalam mesin PCR, lalu “START RUN”!
3 Elektroforesis a. Siapkan gel agarose 1,5%!
b. Masukkan ke dalam chamber elektroforesis dan tambahkan bufer TAE 1x sampai gel
agarose terendam!
c. Lakukan loading sampel dengan campuran berikut:

Sumur 1 2 3 4 5
ke-
Mix GelRed: 10 μl GelRed: GelRed: GelRed: GelRed:
Loading dye: 1 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl
μl DNA ladder Produk Produk Produk Produk PCR
100 PCR PCR PCR RNA RNA 2 : 5 μl
bp: 3 μl cDNA cDNA 1 : 5 μl
1 : 5 μl 2:
5 μl
d. Atur voltase 100V dan waktu 20 menit
e. START RUN
f. Amati hasil elektroforesis di GelDoc atau UV Transilluminator!
F. Hasil Pengamatan

Hasil Pengamatan: Elektroferogram produk RT-

PCR
G. Pembahasan
Praktikum yang dilaksanakan secara daring pada kali ini yaitu mengenai
reverse transcriptase (RT). RT-PCR menggunakan enzim reverse transcriptase
(RT) dalam kombinasi dengan PCR dan elektroforesis gel. RT-PCR dapat
digunakan untuk membandingkan ekspresi gen antar sampel—misalnya, dalam
tahap embrionik yang berbeda, dalam jaringan yang berbeda, atau dalam jenis
sel yang sama dalam kondisi yang berbeda. RT-PCR dimulai dengan mengubah
sampel mRNA menjadi DNA untai ganda dengan urutan yang sesuai. Pertama,
enzim reverse transcriptase digunakan untuk mensintesis salinan DNA
komplementer dari setiap mRNA dalam sampel, yang disebut reverse transcript.
Ingatlah bahwa ujung 3’ dari mRNA memiliki bentangan nukleotida adenin (A)
yang disebut ekor poli-A. Hal ini memungkinkan untai komplementer pendek
nukleotida deoksiribo timin (poli-dT atau oligo-dT) ditambahkan dan
digunakan sebagai primer untuk sintesis untai DNA ini. Setelah degradasi
enzimatik dari mRNA, untai DNA kedua, komplementer dengan yang pertama,
disintesis oleh DNA polimerase. DNA untai ganda yang dihasilkan disebut
DNA komplementer (cDNA).
Tahapan sintesis cDNA dari mRNA (reverse transcription)
1.
2.
3.
4.
5.

Selanjutnya dalam RT-PCR adalah langkah PCR. Seperti yang akan Anda
ingat, PCR adalah cara cepat membuat banyak salinan dari satu bentangan
spesifik DNA untai ganda, menggunakan primer yang berhibridisasi ke ujung
yang berlawanan dari segmen yang diinginkan. Contohnya seperti pada Gambar
2, ditambahkan primer yang sesuai dengan segmen suatu gen pada Drosophila,
menggunakan cDNA dari setiap tahap embrionik sebagai templat untuk
amplifikasi PCR dalam sampel terpisah.

Analisis ekspresi gen tunggal dengan RT-PCR

1.
2.
3.

H. Kesimpulan

Daftar Pustaka

Pertanyaan