Nama : Aqila Salmaagista Dikumpulkan tgl.

: 16 September 2019
NPM : 1706044805 Paraf Asisten :
Kelas : Rekayasa Genetika

LTM Pemicu 1: Polymerase Chain Reaction

I. Outline
1. Polymerase Chain Reaction
2. Quantitative Polymerase Chain Reaction
a. Dye-based qPCR
b. Probe-based qPCR
c. Instrumen yang Digunakan pada qPCR
d. Aplikasi qPCR
3. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
a. Definisi
b. Kegunaan
c. Mekanisme

II. Pembahasan
1. Polymerase Chain Reaction

Gambar 1. Mekanisme Polymerase Chain Reaction

(Sumber: upload.wikimedia.org)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode enzimatis

untuk melakukan sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Metode ini dapat
mengamplifikasi suatu segmen DNA hingga jutaan kali lipat dalam waktu yang
singkat. PCR didasarkan oleh kemampuan DNA polimerase untuk menyintesis
untai DNA yang bersifat komplemen terhadap DNA template yang diberikan
secara berulang untuk menghasilkan DNA komplemen dalam jumlah yang
banyak. Terdapat beberapa komponen penting dalam pelaksanaan PCR, yaitu
DNA template yang memiliki segmen target, DNA template didapatkan dengan
memisahkan untai ganda DNA menggunakan DNA polimerase, primer, buffer,
dan dNTPs. Secara umum, terdapat 3 tahapan dalam reaksi ini, yaitu denaturasi
 yang berperan memisahkan ikatan hidrogen pada untai komplemen DNA menjadi
dua untai terpisah, langkah kedua adalah annealing dimana primer menempelkan
dirinya pada setiap untai DNA yang telah dipisahkan dengan denaturasi, dan yang
terakhir adalah extension yaitu disintesisnya DNA baru oleh primer dengan
bantuan enzim TaqPolymerase. Terdapat beberapa jenis dari PCR, yaitu
quantitative polymerase chain reaction (qPCR) dan reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR)

2. Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)

Quantitative Polymerase Chain Reaction merupakan metode dimana
produk memungkinkan untuk dideteksi dan dikuantifikasi secara real-time,
ketika sedang disintesis (Van Guilder et al, 2008). Pada metode ini penghitungan
dilakukan dengan deteksi fluoresens yang meningkat seiring proses PCR. Metode
ini mampu mendeteksi adanya perubahan konsentrasi DNA target. Seperti pada
PCR standar, DNA diamplifikasi dengan 3 langkah berulang: denaturasi, anil, dan
elongasi. Namun, dalam qPCR, pelabelan fluoresens memungkinkan
pengumpulan data saat PCR berlangsung. Terdapat dua metode umum untuk
mendeteksi dan mengkuantifikasi produk, yaitu dye-based dan probe-based.
a. Dye-Based qPCR

Gambar 2. Mekanisme qPCR dye-based

(Sumber: takarabio.com)

Pewarna yang ditambahkan dapat memancarkan sinyal fluoresens yang

dapat dideteksi oleh thermal-cycler saat menenpel pada dsDNA. Pada qPCR
dye-based, perhitungan sinyal fluoresens memungkinkan kuantifikasi
molekul DNA yang diperkuat dengan penggunaan pewarna pengikat dsDNA
(double stranded DNA). Pengukuran sinyal fluoresens dilakukan pada setiap
siklus PCR di tahap elongasi, karena pada tahap denaturasi dan DNA terlepas
menjadi untai tunggal sinyal fluoresens dari pewarna melemah. Sinyal
fluoresensi meningkat secara proporsional dengan jumlah DNA yang
direplikasi dan karenanya DNA dikuantifikasi dalam "waktu nyata". Pada
 metode ini, harus digunakan polimerase yang tahan terhadap panas dan
bersifat resisten terhadap inhibitor. Kekurangan dari qPCR dye-based adalah
hanya satu target yang dapat diamati pada satu waktu.

b. Probe-based qPCR
Sedangkan pada qPCR probe-based, banyak target dapat dideteksi
secara bersamaan pada sampel, tetapi akan dibutuhkan optimisasi dan desain
probe spesifik target, yang digunakan sebagai tambahan untuk primer.
Metode ini menggunakan aktivitas eksonuklease 5’—3’. Primer dipasangkan
dengan probe yang memiliki reporter dan quencher yang hanya dapat
menempel dengan DNA target. Quencher yang terikat dengan reporter
berperan untuk mencegah reporter memancarkan energi fluoresensinya.
Ketika probe terhidrolisis karena tahapan ekstensi primer, reporter dan
quencher akan terpisah. Terpisahnya reporter dan quencher menyebabkan
meningkatnya sinyal fluoresens dari reporter. Jadi, sinyal fluoresensi dari
reaksi qPCR berbasis probe sebanding dengan jumlah urutan target probe
yang ada dalam sampel. Karena qPCR berbasis probe lebih spesifik daripada
qPCR dye-based, probe-based qPCR sering digunakan dalam tes diagnostik
qPCR.

Gambar 3. Mekanisme qPCR probe-based

(Sumber: takarabio.com)

c. Instrumen yang digunakan

Untuk mendapatkan hasil yang akurat dan sesuai dengan kondisi
sesungguhnya, diperlukan alat-alat yang dapat menunjang proses qPCR ini.
Secara umum alat yang dibutuhkan adalah untuk memancarkan energi dan
menangkap sinyal fluoresens. Untuk memancarkan energi dapat digunakan
lampu, LED, dan juga laser. Untuk menangkap sinyal fluoresens yang
dipancarkan diperlukan photodetector, dimana alat ini dapat mengambil data
untuk panjang gelombang spesifik yang diinginkan. Selain itu diperlukan
pula komputer yang dilengkapi dengan software yang dapat menganalisis
 data yang didapat dan menyajikan grafik amplifikasi yang merupakan grafik
sinyal fluoresens terhadap banyaknya siklus yang dilakukan.

Gambar 4. Grafik Amplifikasi

(Sumber: goldbio.com)

Pada titik dimana grafik berpotongan dengan garis threshold disebut

dengan nilai Ct. Nilai Ct berbanding terbalik dengan jumlah asam nukleat
target yang terdapat pada sampel uji.

d. Aplikasi qPCR
Selama bertahun-tahun, metode ini digunakan untuk banyak hal,
diantaranya adalah:
• Analisis kuantitatif ekspresi gen
• Memvalidasi hasil komposisi DNA
• Menghitung bakteri, jamur, dan virus

3. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Reverse Transcription PCR memungkinkan penggunaan RNA sebagai
template. RNA secara terbalik ditranskripsi menjadi DNA komplementer
(cDNA), menggunakan reverse transcriptase. Kualitas dan kemurnian template
RNA sangat penting untuk keberhasilan metode ini. Langkah pertama RT-PCR
adalah sintesis DNA untai tunggal. Molekul DNA untai tunggal kemudian
diselesaikan oleh aktivitas DNA polimerase dari transkriptase dibentuk menjadi
cDNA. Efisiensi reaksi untai pertama dapat mempengaruhi proses amplifikasi.
RT-PCR dapat dilakukan dengan 2 cara, cara yang pertama adalah reverse
transcription dan polymerase chain reaction dilakukan secara terpisah. Tujuan
RT dan PCR dilakukan secara terpisah adalah untuk menyimpan cDNA dan bila
pada suatu RNA terdapat beberapa segmen target. Namun cara pertama dapat
meningkatkan potensi kontaminasi, degradasi atau kesalahan kembang biak. Cara
kedua RT dan PCR dilakukan secara bersamaan. Pada cara kedua dibutuhkan
waktu yang lebih sedikit dan meminimalisir adanya kontaminasi.
Setelah terbentuk cDNA, dilakukan prosedur PCR standar untuk
memproduksi duplikat dari cDNA yang telah dihasilkan sebelumnya. Diubahnya
 RNA menjadi cDNA dengan RT-PCR memiliki banyak keuntungan, diantaranya
karena RNA adalah untai tunggal dan sangat tidak stabil, sehingga membuatnya
sulit digunakan dalam PCR.
RT-PCR digunakan di laboratorium penelitian untuk mempelajari ekspresi
gen, misalnya dalam percobaan untuk membedakan ekson dari intron, dan dapat
digunakan secara klinis untuk mendiagnosis penyakit genetik dan memantau
terapi obat. RT-PCR membutuhkan templat RNA, enzim, nukleotida, buffer dan
termokler untuk menghasilkan produk RT-PCR.

Gambar 5. Mekanisme Reverse Transcription PCR

(Sumber: thermofisher.com)

III. Daftar Pustaka

Goldbio.com. (2019). PCR Overview | GoldBio. [online] Available at:
https://www.goldbio.com/goldbios-pcr-overview#RTPCR [Accessed 15 Sep.
2019].
Ncbi.nlm.nih.gov. (2019). Polymerase Chain Reaction (PCR). [online] Available at:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/ [Accessed 15 Sep. 2019].
Microbeonline. (2019). Polymerase Chain Reaction (PCR): Steps, Types and
Applications - Microbeonline. [online] Available at:
https://microbeonline.com/polymerase-chain-reaction-pcr-steps-types-
applications/ [Accessed 15 Sep. 2019].
Enzolifesciences.com. (2019). TechNote: What are the differences between PCR, RT-
PCR, qPCR, and RT-qPCR?. [online] Available at:
http://www.enzolifesciences.com/science-center/technotes/2017/march/what-
are-the-differences-between-pcr-rt-pcr-qpcr-and-rt-qpcr?/ [Accessed 15 Sep.
2019].