BIOTEKNOLOGI

qPCR (quantitative-PCR ATAU Real Time-PCR)

Dosen Pengampu :
Suci Lestari, M.Pd.

Disusun oleh :
1. Annisa Salsyabila Rahmi 1701125044
2. Isroatul Mi’rojiyah 1701125047
3. Nabilah 1701125035
4. Nur Muhammad Wicaksono 1701125050

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF DR HAMKA
2021
 qPCR (quantitative-PCR atau Real Time-PCR)

A. Pengertian
Teknik RT-PCR adalah metode yang umum dan telah lama digunakan dalam
penelitian obat, terutama untuk deteksi informasi genetik. Teknik RT- PCR menggunakan
mRNA (messenger RNA) sebagai cetakan (template) (Herawati, 2020). Pada tahap
trasnkripsi balik, yaitu tahap pertama pada teknik RT-PCR, enzim reverse transcriptase
digunakan untuk mengubah template RNA menjadi DNA untai tunggal komplementer
(cDNA-complenetary DNA). Tahap selanjutnya adalah mengubah cDNA untai tunggal
menjadi DNA untai ganda menggunakan enzim DNA polimerase. Molekul DNA yang
dihasilkan pada tahap ini dapat digunakan sebagai template untuk reaksi PCR selanjutnya.
Teknik qPCR merupakan teknik in vitro untuk menentukan/mengukur jumlah dan
keberadaan dari produk PCR (template DNA) secara real time. qPCR merupakan metode
yang ampuh untuk pengukuran ekspresi mRNA (Herawati, 2020).
Kuantitatif PCR (qPCR), juga dikenal sebagai PCR waktu nyata, adalah teknik
analisis yang telah merevolusi eksplorasi analisis ekspresi gen (Andrade et al., 2017).
Metode RT-PCR berfungsi mendeteksi adanya virus dalam tubuh pasien melalui
reaksi rantai polimerase dengan primer atau probeyang khusus menargetkan genom
SARS-CoV-2, sehingga jumlah cDNA SARS-CoV-2 dalam spesimen pasien dapat
dihitung (Agustina & Fajrunni’mah, 2020).
RT-PCR merupakan salah satu jenis uji molekular yang dapat digunakan untuk
mendeteksi infeksi COVID-19. RT- PCR merupakan metode identifikasi dan konfirmasi
laboratorium kasus COVID-19 yang paling disarankan. RT-PCR menargetkan beberapa
gen dari virus tersebut, yaitu gen N, E, S dan RdRP (Yanti et al., 2020).
Real-time PCR atau quantitative PCR (qPCR) merupakan salah satu metode untuk
mendeteksi spesifikasi dan kuantitas mRNA. Prinsip kerja qPCR adalah mendeteksi dan
mengkuantifikasi berdasarkan keberadaan Reporter Fluorescens (Novianti et al., 2019).
Real-time PCR (RT-PCR) atau dikenal juga dengan quantitative PCR (qPCR)
adalah metode analisis kuantitatif terkini yang dinilai akurat dalam deteksi kimera pada
jaringan transforman. Hal ini penting dilakukan untuk menyeleksi kimera sebelum
pengembangan generasi transforman lanjut. Dalam reaksi qPCR diperlukan senyawa
pelapor (reporter) yang berperan dalam memberikan sinyal untuk mengetahui jumlah
amplikon yang terbentuk. Kuantitas sinyal bergantung pada beberapa komponen utama,

1
 seperti jumlah DNA sampel, marka, pelapor, dNTPs, dan jumlah enzim Taq DNA
polimerase. Dengan mengetahui jumlah amplikon, dapat diketahui besaran konsentrasi
sampel yang dianalisis, baik menggunakan kurva standar (kuantifikasi absolut) maupun
kuantifikasi relatif. Analisis qPCR dapat juga diaplikasikan untuk penentuan konsentrasi
DNA, deteksi gen yang memiliki konsentrasi sangat rendah dalam sampel, analisis
tingkat ekspresi gen, dan penentuan jumlah salinan gen dalam genom (Polosoro &
Enggarini, 2016).
Metode qPCR adalah metode analisis yang dapat mengukur DNA berpotensi
dengan akurat (Wijiastuti et al., 2015).

B. Tujuan
Teknik qPCR berguna untuk penyelidikan dan penelitian terhadap ekspresi gen-
gen tertentu. Teknik qPCR juga dapat digunakan sebagai alat analitik karena dapat
menghitung konsetrasi awal template untuk melakukan evaluasi jumlah salinan DNA,
konsentrasi virus (viral load), deteksi polimorfisme nukleotida tunggal (single nucleotide
polymorphism atau SNP) dan diskriminasi alel. Selain itu, teknik ini dapat
memungkinkan deteksi beberapa target PCR secara bersamaan dan sangat fleksibel, tdak
tergantung pada analisis hilir, seperti elektroforesis atau densitometri. Teknik real time-
PCR berguna untuk mendeteksi keberadaan atau ketidakhadiran dan menentukan jumlah
asam nukleat melihat peningkatan intensitas sinyal fluoresen atau pemecahan probe
selama proses amplifikasi sekuen (Herawati, 2020).
Metode qPCR dapat mendeteksi adanya kimera pada tanaman hasil transformasi
melalui perbandingan jumlah salinan transgen relatif yang diperoleh. Dengan demikian,
metode qPCR dapat digunakan sebagai alat penyeleksi untuk membantu memperkecil
jumlah sampel sebelum dianalisis lebih lanjut menggunakan Southern blot (Polosoro &
Enggarini, 2016).

C. Aplikasi qPCR
1. Metode untuk deteksi virus SARS-CoV-2
Teknik molekuler standar yang digunakan untuk deteksi SARS-CoV-2 adalah
teknik quantitative Realtime Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction
(qRT-PCR) (Herawati, 2020).

2
2. Prediksi DNA primer gen PGC-1 α cecak (Hemidactylus platyurus)
Diawali dengan pengkajian filogenik spesies yang memiliki kekerabatan
paling dekat. Selanjutnya, gen dianalisis menggunakan perangkat lunak Basic Local
Alignment Search Tools (BLAST) dan didapatkan nilai identity. Sekuen gen dengan
nilai identity tertinggi kemudian digunakan untuk tahap selanjutnya, yaitu multiple
alignment. Tahap tersebut bertujuan untuk memperoleh urutan basa dan dipilih yang
memiliki susunan basa dengan kemiripan mencapai 80-100%.
Tahap desain primer merupakan analisis untuk menentukan DNA primer
menggunakan perangkat lunak Primer3 dan memilih daerah yang paling lestari
dengan beberapa kriteria, yaitu jumlah nukleotida, kandungan GC dan tidak terdapat
kemungkinan komplementer antar basa dalam satu rantai primer. Selanjutnya, tahap
Real Time PCR. Uji Real Time PCR bertujuan untuk membuktikan bahwa DNA
primer telah sesuai dengan melihat hasil annealing DNA primer dengan DNA sampel.
Prosedur Real Time PCR dimulai dari sintesis DNA, inaktivasi reverse transcriptase,
PCR, annealing gen PGC-1 α dan melting curve (Novianti et al., 2019).
3. Isolasi dan seleksi bakteri termofilik dari limbah pengolahan batik
Limbah yang digunakan adalah limbah yang mengandung bacto agar, pepton,
tripton, NaCl, K2HPO4, glukosa, kuadestilata, K2Cr2O4-. Tahap pertama adalah
pembuatan media HTR (heterotrof) dengan komposisi 15 gram bacto agar, 15 gram
pepton, 3 gram tripton, 5 gram NaCl, dan 2 gram K 2HPO4 yang dilarutkan dalam
1000mL kuadestilata. Isolasi dilakukan dengan menggores 1 ose sampel limbah pada
media HTR dan diinkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 30 oC dilakukan dua kali
pengulangan hingga menghasilkan isolat-isolat murni. Isolat yang telah dimurnikan
akan diidentifikasi gen penyandi kormat reduktase dengan metode qPCR
menggunakan primer spesifik CRVIRD. Hasil qPCR digunakan untuk
mengidentifikasi gen berdasarkan jumlah DNA yang teramplifikasi.
Amplifikasi dilakukan dalam mesin qPCR dan hasilnya ditampilkan dalam
bentuk grafik pada layar komputer. Hasil analisis qPCR menunjukkan bahwa
konsentrasi DNA yang teramplifikasi pada isolat A lebih tinggi daripada konsentrasi
DNA pada isolat B dan C sehingga diduga aktivitas kromat reduktase pada isolat A
lebih tinggi daripada isolat lainnya (Wijiastuti et al., 2015).
Beberapa hasil penelitian menunjukkan aplikasi qPCR dalam perakitan
tanaman transgenik. Hasil penelitian menggunakan analisis qPCR terhadap tembakau
transgenik menunjukkan adanya perbedaan kuantitas DNA transgen pada tunas
3
 bagian atas dengan tunas bagian bawah. Hal ini memperlihatkan adanya kimera pada
jaringan tembakau transgenik. menggabungkan analisis qPCR dan Southern blot
untuk mendeteksi kimera pada Vitis vinifera transgenik, diperoleh hasil dari sembilan
galur transforman terdapat satu galur yang bersifat kimera karena memiliki kuantitas
DNA dan ekspresi transgen yang sangat rendah (Polosoro & Enggarini, 2016).
Melalui analisis qPCR dapat diketahui bahwa anakan dalam satu rumpun padi
Nipponbare hasil transformasi generasi T0 memiliki perbandingan jumlah sisipan
transgen yang sama, sedangkan rumpun yang berasal dari satu kalus dapat
menghasilkan individu tanaman yang memiliki jumlah sisipan transgen berbeda.
Analisis qPCR bermanfaat dalam penentuan jumlah salinan transgen pada generasi
awal tanaman transgenik. Selain itu, perlu dilakukan pemisahan terhadap rumpun
yang tumbuh dari satu kalus pada saat aklimatisasi sehingga setiap rumpun dapat
dianggap sebagai lini yang berbeda. Hal ini dilakukan dengan tujuan menjaga
keseragaman sisipan transgen pada generasi selanjutnya (Polosoro & Enggarini,
2016).

D. Metode
Peneliti telah mengembangkan beberapa metode dari Quantitative PCR atau bisa
disebut sebagai Real Time PCR. Metode ini membutuhkan setiap asam nukleat yang
setara dari setiap sampel dan setiap sampel yang dianalisis dengan analisis identik
sampai ke analisis quantitative. Urutan gen dapat digunakan sebagai sampel memperkuat
efisiensi normalisasi. Menggunakan metode PCR konvensional dan kuantitasi. Metode ini
sangat sulit untuk memastikan semua sample telah dianalisis selama fase log dari reaksi
(untuk kedua gen target dan normalisasi gen) (Kim, 2001).
Metode yang lain yaitu quantitive competitive (QC)-PCR, telah dikembangkan
dan sering digunakan secara luas untuk PCR quantitasi. QC-PCR bergantung pada
penyertaan dari pengendalian dalam kompetisi setiap reaksi. Ke-efisien setiap reaksi telah
di normalkan ke kompetisi dalam. Beberapa darti kompetisi dalam dapat dimasukkan ke
setiap sampel. Tuntuk mendapatkan yang relatif kuantitasi, produk PCR yang tidak
diketahui diperbandingkan dengan produk kompetisi PCR yang diketahui. Keberhasilan
uji PCR kompetitif kuantitatif bergantung pada pengembangan kontrol internal yang
memperkuat dengan efisiensi yang sama seperti molekul target (Kim, 2001).
RT-PCR mendeteksi apakan adanya RNA virus yang muncul pada sampel pasien.
Pemeriksaan ini bekerja dengan menangkap dan memperjelas material genetik seperti
4
 protein S, protein N dan envelope dari virus. Untuk mengukur viral RNA, RNA perlu
dikonversi menjadi DNA dan disalin secara berulang menggunakan siklus temperatur
yang terdapat pada mesin PCR dan kemudian menggunakan marker fluorescent untuk
mendeteksi virus. Jika nilai fluoresen mencapai level tertentu, maka hal ini
mengkonfirmasi presensi dari virus. Hasil tes positif menginterpretasikan bahwa pasien
saat ini sedang terinfeksi oleh virus dan hasil tes negatif menunjukkan bahwa pasien tidak
sedang terinfeksi virus atau virus tidak ditemukan pada spesimen yang digunakan atau
kualitas sampel yang diambil rendah atau pemeriksaan terlalu cepat ataupun terlalu
terlambat dilakukan untuk mendeteksi replikasi dari virus (Yanti et al., 2020).
Eksperimen qPCR memerlukan proses validasi. Validasi eksperimen qPCR
dilakukan dengan dua langkah. Langkah pertama adalah mengamati kurva disosiasi yang
menunjukkan titik leleh produk PCR yang dihasilkan. Apabila puncak kurva disosiasi
yang dihasilkan lebih dari satu, hal ini berarti reaksi PCR menghasilkan lebih dari satu
produk, sedangkan apabila puncak kurva disosiasi menunjukkan nilai yang berbeda,
berarti produk PCR yang dihasilkan berbeda satu sama lain. Langkah kedua adalah
penentuan nilai ambang atau Ct threshold. Nilai ambang adalah nilai delta Rn dengan
kurva amplifikasi berada pada posisi linear. Penentuan nilai ambang dapat dilakukan
dengan menggeser garis horizontal pada kurva amplifikasi sehingga didapatkan posisi
saat kurva amplifikasi dalam kondisi linear. Jika nilai ambang sudah ditetapkan, maka
nilai CT setiap sampel dapat ditentukan (Polosoro & Enggarini, 2016).

E. Kelebihan
Metode ini memiliki keuntungan, yaitu analisis jauh lebih cepat dan murah
dibanding dengan Southern blot (Polosoro & Enggarini, 2016). Selain itu, metode qPCR
memiliki sensibilitas yang tinggi, deteksi transkrip secara real time, memiliki kecepatan
analisis dan reproduktifitas yang baik untuk mendapatkan profil ekspresi gen (Andrade et
al., 2017). Teknik ini juga sangat fleksibel dan dapat mendeteksi beberapa target PCR
secara bersamaan serta dapat menguji keberadaaan virus RNA dengan waktu yang relatif
cepat (Herawati, 2020).
Teknik qPCR merupakan teknik yang sangat kuat untuk mengukur perubahan
ekspresi gen, kualitas dan integritas RNA, efisiensi sintesis cDNA, dan variasi jumlah
input RNA (Andrade et al., 2017). Teknik ini memiliki sensitifitas yang baik sehingga
dijadikan sebagai referensi metode utama untuk mendeteksi Covid-19 (Herawati, 2020).
5
F. Keterbatasan qPCR untuk deteksi pathogen
Kekurangan dari metode qPCR adalah tidak dapat membedakan antara lini-lini
yang memiliki jumlah salinan transgen yang sama. Transgen yang memiliki jumlah
salinan yang sama dapat berbeda dalam hal sekuen dan panjang basa transgen (Polosoro
& Enggarini, 2016). Selain itu, adanya resiko hasil false-negative dan false-positive
sehingga membutuhkan fasilitas laboratorium dengan level keamanan yang tinggi
(Herawati, 2020).
Metode ini memiliki kelemahan, yaitu seluruh sampel harus diukur konsentrasinya
secara mutlak agar diperoleh hasil yang akurat. Kuantifikasi sampel DNA secara mutlak
cukup sulit dilakukan sehingga dalam hal ini metode kuantifikasi relatif yang digunakan
dalam penelitian ini dianggap lebih unggul (Polosoro & Enggarini, 2016).
Keterbatasan metode RT-PCR untuk deteksi pathogen:
1. RT-PCR bergantung pada penangkapan dan pendeteksian virus. Besar kemungkinan
pasien yang telah bersih atau pulih dari penyakit akan terlewat dari deteksi. RT-PCR
mengandalkan kemampuan dalam mendeteksi virus sehingga memungkinkan
melewatkan pasien yang telah pulih dari penyakit (Yanti et al., 2020).
2. Distribusi virus pada saluran pernafasan cukup bervariasi. Jika seseorang terinfeksi
virus, maka virus dapat dideteksi di dalam sputum atau usap (swab) nasofaring. Akan
tetapi, virus juga tidak dapat terdeteksi di kedua lokasi tersebut pada waktu yang
bersamaan.
3. Teknik RT-PCR sedikit lebih sulit dibandingkan dengan metode PCR yang
konvensional. RT-PCR membutuhkan teknisi professional yang mampu melakukan
pemeriksaan RT-PCR dan menganalisis data dengan tepat, serta peralatan khusus
karena proses pengerjaannya yang relatif lebih rumit (Agustina & Fajrunni’mah,
2020).
4. Adanya resiko false-negative dan false-positive. Terjadinya false-positive dengan satu
atau lebih primer dan reaksi probe kontrol negatif merupakan indikasi terjadi
kontaminasi pada sampel. Oleh karena itu, kontrol internal penting digunakan pada
pengujian dengan teknik ini karena berguna untuk mengidentifikasi zat-zat yang dapat
mengganggu proses amplifikasi PCR (Herawati, 2020).
Pada metode RT-PCR, kesalahan pengerjaan yang tidak sesuai dengan
prosedur dimulai dari pra analitik. Misalnya, identifikasi sampel yang salah, proses
pengambilan sampel yang tidak benar, kualitas spesimen yang buruk atau hanya
6
 mengandung sangat sedikit sampel, kondisi pengiriman dan penyimpanan sampel
yang tidak akurat, kontaminasi sampel, adanya kesalahan pipettingselama persiapan
sampel manual atau aliquot, menjadi penyebab kesalahan diagnostik (Agustina &
Fajrunni’mah, 2020).

DAFTAR PUSTAKA

Agustina, A. S., & Fajrunni’mah, R. (2020). Perbandingan Metode RT-PCR dan Tes Rapid
Antibodi untuk Deteksi Covid-19. Jurnal Kesehatan Manarang, 6, 47–54.
Andrade, L. M. de, Brito, M. dos S., Junior, R. F. P., Marchiori, P. E. R., Nóbile, P. M.,
Martins, A. P. B., Ribeiro, R. V., & Silvana, C. (2017). Reference Genes for
Normalization of qPCR Assays in Sugarcane Plants Under Water Deficit. Plant
Methods, 13(28), 13–28. https://doi.org/10.1186/s13007-017-0178-2
Herawati, N. (2020). Jenis-Jenis Metode Rapid-Test Untuk Deteksi Virus SARS-CoV-2.
BioTrends, 11(1), 11–20.
Kim, D. W. (2001). Real time quantitative PCR. Experimental & Molecular Medicine, 33(1
Suppl), 101–109. https://doi.org/10.1016/b978-012372185-3/50024-9
Novianti, T., Juniantito, V., Jusuf, A. A., Arida, E. A., Widia, S., Jusman, A., & Sadikin, M.
(2019). Prediksi DNA Primer gen PGC- 1α cecak ( Hemidactylus platyurus ) dengan
metoda phylogenetic , multiple alignment , dan qPCR. Indonesian Journal of
Biotechnology and Biodiversity, 3(1), 39–47.
Polosoro, A., & Enggarini, W. (2016). Keragaman Jumlah Salinan Transgen Galur T0 Padi
Kultivar Nipponbare Berdasarkan Analisis qPCR dengan Penanda Gen hptII. Jurnal
AgroBiogen, 12(2), 73–80.
Wijiastuti, Artika, I. M., & Nurhidayat, N. (2015). Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik
Pereduksi Kromium Heksavalen dari Limbah Pengolahan Batik. Current Biochemistry,
2(1), 22–31.
Yanti, B., Ismida, F. D., Elsa, K., & Sarah, S. (2020). Perbedaan Uji Diagnostik Antigen,
Antibodi, RT-PCR dan Tes Cepat Molekuler pada Coronavirus Disease 2019. Jurnal
Kedokteran Syiah Kuala, 20(3), 172–177.
https://doi.org/https://doi.org/10.24815/jks.v20i3.18719