Nama : Agung Mulya Darmawan

Nomor Induk Mahasiswa : 1308617059

Mata Kuliah : Praktikum Biologi Molekuler (B)

Polymerase Chain Reaction (PCR) Konvensional dan Real Time PCR (qPCR)

Amplifikasi DNA dilakukan dengan alat thermocycler (PCR) , proses ini dimaksudkan untuk
meningkatkan jumlah DNA target yang ada , sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis.
Penggunaan elektroforesis gel hanya terjadi pada PCR konvensional.
Pada dasarnya real time PCR merupakan modifikasi PCR konvensional yang dapat menghasilkan
kuantifikasi yang tepat dari asam nukleat yang spesifik dengan menggunakan detek fluoresensi (Fraga ,
2014 ) .Ada dua jenis qPCR yang sering digunakan dalam penelitian biologi molekuler yaitu kuantifikasi
absolut dan kuantifikasi relatif. Kuantifikasi absolut mengacu pada jenis analisis dimana peneliti ingin
mengetahui kuantitas atau banyaknya gen yang diteliti dalam sampel. Sebagai contoh, peneliti ingin
mencari tahu berapa copy number gen parasit yang terdapat di sampel tumbuhan. Untuk mendapatkan
jumlah absolut ini, peneliti diarahkan untuk membuat kurva standar menggunakan sampel yang sudah
diketahui jumlahnya terlebih dahulu lalu kurva standar ini akan digunakan sebagai acuan untuk
menghitung jumlah gen dalam sampel.
Sementara untuk kuantifikasi relatif lebih sering digunakan untuk menganalisis
perbedaan fold pada ekspresi gen tertentu antara kelompok perlakuan yang berbeda. Misalnya,
penguji ingin mengetahui apakah ada perbedaan ekspresi gen yang berperan dalam sintesis lemak pada
kelompok yang rajin sarapan dan yang tidak pernah sarapan. Jenis qPCR ini membutuhkan kontrol
endogen atau sering disebut sebagai reference/housekeeping gene. Analisis data pada kuantifikasi
relatif akan bergantung dari CT value yang dihasilkan oleh reference gene dan gen
target(ptgenetika.com).

Hal yang membedakan adalah bagaimana data hasil amplifikasi dapat dianalisis oleh peneliti.
Sebagai contoh, pada PCR konvensional setelah proses termal (denaturasi, annealing/penempelan, dan
elongasi) selesai, biasanya produk PCR akan diproses lebih lanjut menggunakan gel elektroforesis dan
kemudian akan muncul band produk yang dapat dibandingkan dengan band kontrol atau standar.
Sedangkan Pada qPCR, penguji dapat mengobservasi langsung proses akumulasi produk PCR
dengan terjadinya proses amplifikasi ketika alat selesai digunakan, data hasil amplifikasi dapat langsung
dianalisis menggunakan program thermocycler yang terdapat pada komputer. Hal ini tentunya
mempersingkat waktu eksperimen dan mengurangi kemungkinan terjadinya kontaminasi karena
meniadakan proses gel elektroforesis. Fluoresens yang terdapat pada reagent PCR juga memungkinkan
keseluruhan proses amplifikasi terbaca, berbeda dengan jenis endpoint PCR dimana hanya hasil akhir
amplifikasi saja yang dapat diketahui (Stephen et.al , 2009).

Mata Kuliah Biologi Molekuler, Semester 112 1 Prodi Biologi FMIPA UNJ
Gambar: Perbedaan PCR konvensional dengan real time PCR

Sumber:researchgate (Fraga, 2014)

Mata Kuliah Biologi Molekuler, Semester 112 2 Prodi Biologi FMIPA UNJ
 Penggunaan RT-qPCR dalam mendeteksi penderita COVID-19
Virus COVID-19 atau SARS-CoV-2 merupakan virus RNA berantai positif dan menyerang sistem
pernafasan , virus RNA berantai positif secara langsung akan mengirimkan mRNA yang ditranslasikan
membentuk protein yang berguna dalam replikasi virus oleh karena itu perlu dilakukan pengujian pdp dan odp
dalam bentuk RT-PCR. Spesimen yang digunakan pada pengetesan COVID-19 menggunakan metode RT-qPCR
ialah swabs dari nasofaringeal atau orofaringeal . Dengan ujung berbahan sintetis seperti poliester dan Dacron .
Penyimpanan spesimen dilakukan pada suhu 4 o C selama 72 jam , apabila terjadi keterlambatan pada ekstraksi
maka simpan pada suhu -70 o C .

Proses diawali dengan mengektraksi asam nukleat (RNA) virus dengan menggunakan bioMérieux
NucliSens® systems, QIAamp® Viral RNA Mini Kit, QIAamp® MinElute Virus Spin Kit atau RNeasy® Mini Kit
(QIAGEN)yang kemudian disimpan pada suhu -70 o C . Karena kesensitifan pada proses RT-qPCR perlu
diadakannya quality control seperti mengikuti protokol BSL3 untuk mencegah terjadinya kontaminasi dan
melindugi keselamatan penguji.

Preparasi RT-qPCR dilakukan dengan menyiapkan RT-qPCR primers spesifik yang berguna dalam
pengamflipikasian dan pembuatan cDNA virus COVID-19 , biasanya primer tersebuta akan berupa bubuk
lipophilised . Bubuk tersebut perlu dilarutkan pada air bebas nuklease. Huang et al. (2020) merancang primer
corona virus (5′-TCAGAATGCCAATCTCCCCAAC-3′ dan 5′-AAAGGTCCACCCGATACATTGA-3′) dan SARS-CoV-2
specific probe (5′CY5-CTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGC-3′BHQ1).

Mesin yang digunakan dalam melakukan RT-qPCR harus mempunyai channel filter yang dapat
mendeteksi fluoresensi dari pewarna CY5 (Corman et. Al , 2012) Agar mengetahui positif dan negatif pdp dan
odp terjangkit COVID-19 maka perlu adanya positif control dan negatif control . Positif Control yang digunakan
setelah proses PCR apakah sama dengan yang terdapat pada GenBank (accession number: NC_045512.2).
Setelah mendapatkan sampel positif , alangkah baiknya sampel diklon kedalam plasmid vektor untuk membuat
stok positif kontrol. Negatif kontrol digunakan agar memastikan tidak terjadinya kontaminasi yang terjadi selama
protokol berlangsung. Cara pembuatannya dengan pengekstaksian Trizol dan 80 air bebas nuklease . Tak hanya
itu perlu juga adanya NTC (No template control) dengan menambahkan 5 μL RNA ke dalam tabung reaksi PCR
dan tambahkan 5 μL air bebas nuklease (Paramita ,2020.

Reagen yang digunakan pada proses RT-qPCR ialah AgPAth-IDTM One-Step RT-PCR reagents (AM1005,
Thermo Fisher Scientific atau TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix ( Corman ,2020 ), reagen tersebut dirancang
sensitif dan pengamplifikasi yang kuat terhadap RNA target menggunakan rapid single – tube TaqMan RT-qPCR.
Hasil yang didapatkan kurang lebih mencapai 1 jam. Campuran 25 X RT PCR Enzyme ( Array Script Reverse
Transcriptase dan AmpliTaq Gold Polymerase) diaktifkan pada temperatur tinggi yaitu 95 o C berfungsi dalam
membuat cDNA dan secara spesifik menuju target DNA yang akan diamplifikasi. Untuk menghindari amplifikasi
yang tidak diinginkan maka kembalikan pada temperatur ruangan. Selanjutnya pewarna yang digunakan yaitu
ROX Dye yang bertindak sebagai pewarna pasif digunakan sebagai normalisasi kuantitatif flouresensi signal. Lalu
data flouresensi dianalisis dengan menggunakan thermocycler dengan pengaturan 50 o C selama 15 menit , 95 o C
selama 3 menit , dan 45 siklus 95 o C selama 15 detik dan 60 o C selama 30 detik. Lalu jalankan program
thermocycler pada komputer , karena yang digunakan sebagai pewarna adalah CY5 maka garis yang dapat
terlihat adalah berwarna merah tua . Garis kurva yang ditujukan harus diatas dari background level atau negatif
control , maka bisa dikatakan bahwa sampel tersebut merupakan positif. Oleh karena itu positif control juga
perlu dicari terlebih dahulu sebagai validasi (CDC , 2020).

Kesimpulan
Mata Kuliah Biologi Molekuler, Semester 112 3 Prodi Biologi FMIPA UNJ
 Alasan mengapa RT-qPCR dapat dijadikan sebagai gold standart dikarenakan pada kualitas hasil yang
didapatkan dalam pengujian tersebut ialah hasil yang paling akurat karena sudah ada tervalidasi. Berbeda
dengan rapid test yang menggunakan RDT antibodi , antibodi tersebut hanya akan aktif apabila sudah timbul
gejala. Oleh karena itu dalam pemeriksaan perlu bijak dalam melakukan RT-qPCR maupun rapid test dengan
melihat kondisi wilayah yang terkena wabah.

SUMBER PUSTAKA

CDC. (2020). Real-time RT-PCR for diagnosing COVID-19 ( former 2019-nCoV ). 19(Cdc), 1–9.

Corman, V. M., Eckerle, I., Bleicker, T., & Zaki, A. (2012). Detection of a novel human coronavirus by
real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. (June 2014).
https://doi.org/10.2807/ese.17.39.20285-en

Fraga, Dean & Meulia, Tea & Fenster, Steven. (2014). Current Protocols Essential Laboratory
Techniques. 10.1002/9780470089941.et1003s08.

Corman, V. M., Landt, O., & Molenkamp, R. (2020). Detection of 2019 novel coronavirus ( 2019-
nCoV ) by. (January). https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

Huang, C., Wang, Y., Li, X., Ren, L., Zhao, J., Hu, Y., … Gu, X. (2020). Articles Clinical features of patients
infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan , China. 497–506. https://doi.org/10.1016/S0140-
6736(20)30183-5

Paramita, Swandari. (2020). GEJALA KLINIS PASIEN TERINFEKSI NOVEL CORONAVIRUS 2019 DI WUHAN,
CHINA.
https://ptgenetika.com/real-time-pcr/ (diakses pada tanggal 10/04/2020)

Stephen A Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A Garson, Jan Hellemans, Jim Huggett, Mikael Kubista,
Reinhold Mueller, Tania Nolan, Michael W Pfaffl, Gregory L Shipley, Jo Vandesompele, Carl T
Wittwer, The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time
PCR Experiments, Clinical Chemistry, Volume 55, Issue 4, 1 April 2009, Pages 611–
622, https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

Mata Kuliah Biologi Molekuler, Semester 112 4 Prodi Biologi FMIPA UNJ
Mata Kuliah Biologi Molekuler, Semester 112 5 Prodi Biologi FMIPA UNJ