TUGAS SENSOR KIMIA DAN BIOSENSOR

REVIEW JURNAL

Nama : Yulia Dwi Anisa (1718103010…)

Nahdiatul Ummah (171810301061)

Diagnosis DNA Visual Virus Keriting Daun Kuning Tomat dengan Rekombinase Terintegrasi
Amplifikasi Polimerase dan gold-nanopartikel Probe

Diagnosis DNA visual dengan prosedur cepat dan sederhana telah dikembangkan pada
pengintegrasian recombinase polimerase amplification (RPA) dan gold-nanopartikel probe
(AuNP). Seluruh proses diimplementasikan hanya dalam satu tabung tanpa instrumen presisi dan
membutuhkan waktu total 20 menit untuk memperkuat fragmen DNA dengan RPA dan untuk
membedakan fragmen DNA dengan AuNP. Hasilnya dalam berbagai warna dapat langsung
diamati dengan mata telanjang. Melalui penemuan fragmen DNA kecil Tomato yellow leaf curl
virus ( TYLCV), sistem ini dapat mendeteksi satu salinan per mikroliter virus dalam isolat murni
DNA yang diekstraksi dan dapat dengan mudah mengidentifikasi tanaman yang terinfeksi
dengan keadaan yang baik( tanaman sehat). Sistem ini memberikan diagnosis DNA yang sangat
sensitif dan stabil. Metode visual ini berpotensi untuk diagnosis penyakit dan prognostikasi di
lapangan berdasarkan keunggulan kesederhanaan, kecepatan tinggi, portabilitas, dan sensitivitas.
Pengamatan visual dari gejala penyakit pada jaringan tanaman berkontribusi terhadap
diagnosis penyakit, tetapi pendekatan ini biasanya membutuhkan ahli patologi yang
berpengalaman dan tidak dapat diandalkan ketika gejala muncul pada tahap awal infeksi. Deteksi
dini pathogen tanaman penting dilakukan dalam penanggulangan penyakit tanaman, terutama
untuk karantina tanaman di perbatasan negara dan budidaya bibit di greenhouse. Banyak
pendekatan bioteknologi molekuler telah diterapkan secara luas untuk mendiagnosis penyakit
tanaman termasuk metode berbasis imunologi dan asam nukleat, yang menyelidiki protein
patogen dan asam nukleat yang diekstraksi dari bahan tumbuhan dan dapat menggantikan
pengamatan dan budidaya patogen. Metode berbasis imunologi, seperti enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) dan lateral flow device (LF), berguna untuk mendeteksi antigen
patogen dan telah dikembangkan menjadi peralatan yang ringan, karena metode ini bersifat
spesifik bergantung pada antibodi monoklonal, sensitivitas umumnya bervariasi menurut
spesiesnya. Metode berbasis asam nukleat terutama melibatkan reaksi berantai polimerase
(PCR), yang pertama kali memperkuat gen tertentu atau fragmen DNA untuk deteksi selanjutnya
dengan elektroforesis gel. Metode PCR dasar dan lanjutan saat ini banyak digunakan untuk
mendeteksi patogen tanaman karena sensitivitasnya yang tinggi. Metode berbasis asam nukleat
memiliki akurasi, spesifisitas, dan sensitivitas yang lebih besar daripada metode berbasis
imunologi, tetapi metode tersebut sangat bergantung pada keahlian dan instrumen di
laboratorium, yang menjadi keterbatasan untuk aplikasi sederhana yang digunakan di lapangan.
Untuk mengatasi keterbatasan ini, teknik amplifikasi asam nukleat isotermal yang peting dan
pringan serta biosensor masing-masing memberikan solusi untuk kelemahan yang ada.
Teknik amplifikasi isotermal baru-baru ini digunakan untuk genotipe, diagnosis penyakit,
amplifikasi genom keseluruhan, miniaturisasi dan otomatisasi aplikasi bioanalitik berdasarkan
sifat isotermal, prosedur sederhana dan kemampuan amplifikasi yang sangat baik. Rocombinase
polymerase amplification (RPA) dapat bekerja dengan baik pada suhu konstan mulai dari 25
hingga 45 °C, dan bahkan pada suhu tubuh manusia. Reaksi selesai dalam 20-40 menit tetapi
durasi deteksi limit hanya 5 menit. Di antara pendekatan-pendekatan tersebut, RPA memiliki
kelebihan yaitu sederhana dan nyaman untuk dilakukan pada suhu rendah dan untuk waktu yang
singkat namun tetap memiliki karakteristik efisiensi amplifikasi eksponensial dan deteksi yang
sangat sensitif. Aplikasi RPA dalam diagnosis patogen tanaman telah banyak dilakukan,
termasuk pada Tomato yellow leaf curl virus ( TYLCV). Amplicon RPA tidak cocok untuk
dideteksi dengan elektrofotesis gel agarosa dan harus dimurnikan dengan kolom pembersih PCR.
Probe yang dirancang khusus, enzim, strip aliran lateral, dan pemrosesan lebih lanjut terlibat
dalam deteksi amplikon RPA. Deteksi amplikon RPA yang sederhana dan efektif adalah masalah
berikutnya dalam pengembangan teknik diagnostik yang cepat dan sensitif.
Biosensor berbasis DNA yang inovatif dan portabel telah digunakan sebagai alat
diagnostik dalam beberapa tahun terakhir, biosensor tersebut menunjukkan karakteristik yang
cepat dan sensitif dapat memungkinkan analisis patogen kualitatif dan kuantitatif dengan teknik
bebas label. Untuk alasan kesederhanaan dan kenyamanan, probe DNA berlabel gold-
nanopartikel (AuNP) sebagai sensor DNA optik adalah metode terbaik untuk deteksi DNA.
Deteksi kolorimetri dari probe AuNP yang dikenali dengan amplikon diimplementasikan
sebagian besar dengan strip aliran lateral dan agregasi AuNP. Meskipun tidak ada peralatan
tambahan yang diperlukan untuk mendeteksi agregasi AuNP dengan mata telanjang, masih
terdapat kekurangan seperti akurasi, sensitivitas, dan interpretasi kuantitatif. Pendekatan baru
dapat meningkatkan kualitas deteksi kolorimetri agregasi AuNP dalam analisis kualitatif dan
kuantitatif dengan mata telanjang yang dapat memfasilitasi perluasan aplikasi probe AuNP
dalam deteksi DNA.
Tujuan untuk mempercepat reaksi dan menyederhanakan prosedur, telah mengintegrasikan
RPA dengan probe AuNP yang optimal untuk mendeteksi DNA patogen dengan mata telanjang.
Semua kondisi reaksi dalam prosedur teknik diagnosis DNA visual telah sepenuhnya
dioptimalkan di bawah persyaratan peralatan yang sederhana. Pada penelitian ini TYLCV dipilih
sebagai model patogen karena dapat menginfeksi tomat dan genus Solanum tanaman, dan
menyebabkan kerugian ekonomi yang serius. Kinerja pendekatan ini dibandingkan langsung
dengan metode bench-top konvensional. Sistem yang cepat dan sederhana ini dapat digunakan
dalam analisis patogen kualitatif dan kuantitatif dan aplikasi luas dalam diagnosis dan
prognostikasi penyakit.

Alat dan Bahan

 Preparasi sampel dan ekstraksi DNA. Tomat yang sehat ditanam di kandang jaring bebas
serangga dan kemudian ditempatkan dengan TYLCV-viruliferous whitefly ( Bemisia tabaci
biotipe B) selama satu minggu. DNA virus diekstraksi dari daun tanaman tomat yang terinfeksi
TYLCV menggunakan Gene-SpinTM Isolasi GenomicDNA Kit, Protech Technology Enterprise
Co., Taipei, Taiwan). DNA plasmid diekstraksi dari kultur cairan Escherichia coli ( TOP10,
Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA) membawa isolat TYLCV 82-2-1 dan 57-2 klon.

Desain primer dan analisis PCR konvensional

Urutan nukleotida dari 56 isolat Taiwan TYLCV diadaptasi dari Tsai dkk, diterapkan
dalam penyelarasan beberapa urutan menggunakan perangkat lunak (JalView, versi 2.10.5).
Menurut consensus beberapa urutan, TYLCV-specific ditetapkan 1/2R
(5′GGATTAGAGGCATGAGTACA-3′/5′GGATTAGAGGCATGAGTACATGCCATATA-3′)
dirancang dan disintesis (Mission Biotech, Taipei, Taiwan). Reaksi PCR konvensional dilakukan
dengan volume total 10 μL mengandung DNA yang diisolasi (5 ng), 1x Taq DNA Polymerase
Master Mix RED (Ampligon, Odense, Denmark) dan set primer spesifik TYLCV 1/2R (0,1 μM),
dan kemudian diimplementasikan dalam thermal cycler (Labcycler, SensoQuest, Göttingen,
Jerman) menggunakan program ini: denaturasi pada 95 °C selama 5 menit diikuti oleh 30 siklus
95 °C selama 30 detik, 55 °C selama 30 detik, dan 72 °C selama 30 detik dan ekstensi terakhir
pada 72 °C selama 10 menit. Untuk menilai sensitivitas, diterapkan konsentrasi DNA yang
bervariasi berturut-turut dari isolat TYLCV 82-2-1 dalam reaksi PCR dari 10 9 hingga 1
eksemplar per μL. Amplikon (10 μL) akhirnya divalidasi dengan elektroforesis gel pada gel
agarosa (1,5%).

Analisis Skuens dan Desain Probe gold-nanopartikel (AuNP).

Amplikon PCR konvensional diikat menjadi vektor (pCR™ 2.1-TOPO ®, TOPO®
TACloning® Kit; Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA) dan disekuenskan (Mission Biotech,
Taipei, Taiwan). Urutan amplikon PCR konvensional yang sangat kuat berasal dari sampel
terpisah dan isolat TYLCV ditemukan dan dirancang untuk menjadi probe DNA terkonjugasi
dengan AuNP (Gambar. 1a ). Untuk sintesis probe AuNP, DNA probe dimodifikasi dengan 5′-
end labe-led thiol (C6SH) (5′-thiol-TATCGTGTTAATAATTATGT-3′). cDNA buatan yang
melengkapi untuk menyelidiki DNA juga dirancang
(5′ATGGTTCTCGTACTTCCCAGCTTCCTGGTGATTGTAAACTACATAATTAACGATA-
3′) ( Mission Biotech, Taipei, Taiwan) (Gambar S1).

Preparasi probe AuNP dan Uji Kolorimetri

Larutan AuNP (ukuran partikel 13nm)(TANBead ® NanoGold-13, Taiwan Advanced
Nanotech Inc., Taipei, Taiwan). Probe AuNP disiapkan sesuai dengan prosedur literatur.
Konsentrasi probe AuNP diatur untuk pertumbuhan 50nM dengan air murni dan disimpan pada
suhu 4 °C untuk penggunaan selanjutnya. Untuk uji kolorimetri, probe AuNP (1 μL, 50nM)
ditambahkan ke dalam larutan DNA (100 μL) dengan natrium klorida (15 μL, 3M). Larutan
ssDNA pelengkap dibuat pada konsentrasi yang bervariasi dari 50 pM sampai 10 μM. Campuran
sampel DNA dan Probe AuNP diinkubasi pada suhu 95 °C selama 5 menit. Hidroksilamina
hidroklorida (H2NOH, 1.5 μL, 400mM) dan hidrogen tetrakloroaurat (III) (HAuCl 4, 1.5 μL,
25mM, Sigma-Aldrich, USA) kemudian ditambahkan dan dicampur dengan larutan. Setelah
kurang lebih 30-an, AuNP tumbuh dan divisualisasikan dengan berbagai warna. UV/Analisis
spektral terlihat dari larutan AuNP diimplementasikan dengan spektrofotometer (NanoDrop TM
2000, Thermo Fisher Scientific Inc., MA, AS).
Rekombinase polimerase amplifikasi (RPA) dan uji kolorimetri AUNP
Reaksi polimerase amplifikasi (RPA) dicapai dengan menggunakan kit dasar (TwistAmp ®,
TwistDX, Cambridge, UK) menurut rekomendasi pabrikan dengan beberapa modifikasi. Reaksi
RPA dilakukan terbentuk dalam volume total 20 μL mengandung DNA yang diisolasi (5ng) dan
set primer (480 nM) dan kemudian diimplementasikan pada 39 °C selama 30 menit. Untuk
menetapkan kondisi optimal untuk deteksi DNA, reaksi RPA dilakukan pada 33, 35, 37, dan
39°C berturut-turut selama 5, 10, 20, dan 30 menit. Untuk menguji kepekaan, berbagai
konsentrasi DNA isolat TYLCV 82-2-1 diaplikasikan pada reaksi RPA dari 109 hingga 1
eksemplar per μL dalam urutan yang sesuai, dan kemudian diinkubasi pada 33 °C selama 10
menit. Amplikon RPA (4 μL) divalidasi dengan elektroforesis gel pada gel agarosa (1,5%).
Amplikon RPA (10 μL) digunakan dalam uji kolorimetri AuNP. Untuk diagnosis DNA visual,
probe AuNP (50nM, 1 μL untuk menguji amplikon RPA, 3.5 μL untuk studi sensitivitas
diagnosis DNA visual) adalah
ditambahkan ke dalam RPA amplicon (10 μL) dengan blending lalu diinkubasi pada suhu 95 ° C
selama 5 menit. Selanjutnya, H. 2 NOH (1 μL, 200mM) dan HAuCl 4 ( 1 μL, 12.5mM)
ditambahkan dan dicampur. Setelah kurang lebih 30 detik, AuNP tumbuh dan divisualisasikan
dengan berbagai warna. Gambar dan spektrum UV/visibel dari larutan AuNP tumbuh
akhirnya direkam.
Gambar 1. Desain probe AuNP. (a) Urutan fragmen target diperkuat dari berbagai tanaman
yang terinfeksi TYCLV dan isolat referensi. Isolat 57-2 membawa polimorfisme nukleotida
tunggal (SNP) (A / G) di basa 61. ( b) Skema diagnosis kolorimetri DNA melalui probe AuNP
yang dihibridisasi dengan amplikon target komplementer. ( c) Uji sensitivitas probe AuNP yang
dihibridisasi dengan cDNA buatan khusus.
Analisis gambar gel
Semua gambar gel diperoleh dengan sistem gambar gel digital (DigiGel, DGIS-10c, TOPBIO
Co., New Taipei City, Taiwan) dan direkam dalam format JPEG. Gambar gel diproses dengan
cropping, penyesuaian otomatis kecerahan dan kontras, dan kuantifikasi pita elektroforetik
menggunakan Fiji (software analisis gambar). Nilai sinyal dengan 4 ulangan dinyatakan sebagai
mean aritmatika ± standart deviasi (sd). Hubungan antara jumlah amplikon dan konsentrasi
template ditentukan dengan regresi linier menggunakan Microsoft Excel 2016.

Hasil dan Diskusi

Konsep desain DNAdiagnosis visual.
Untuk memperjelas seluruh konsep diagnosis TYLCV DNA visual dalam satu tabung,
prosedur dijelaskan dengan ilustrasi skema (Gbr. 2 ). Selain ekstraksi DNA total, dua langkah
utama dilakukan dalam tiga tahap dalam diagnosis DNA visual, termasuk RPA, hibridisasi probe
AuNP, dan deteksi visual. Pada langkah pertama, diekstraksi DNA total (1 μL) ditambahkan ke
dalam larutan RPA (9 μL) berisi set primer spesifik dan kemudian diinkubasi pada 33°C selama
10 menit untuk memperkuat fragmen DNA spesifik TYLCV. Set primer spesifik membantu
penentuan keberadaan dan jenis patogen. Reaksi RPA bekerja sebaik PCR konvensional pada
suhu rendah yang konstan dan membutuhkan durasi yang lebih sedikit. Pendekatan ini
menghemat waktu dan tenaga, dengan kebutuhan peralatan dan keahlian sederhana dalam
amplifikasi DNA menggunakan RPA.
Pada langkah kedua, probe AuNP (3.5 μL) ditambahkan langsung ke reaksi RPA (10 μL)
dengan campuran yang ketating. Untuk tujuan hibridisasi yang sangat ketat antara probe AuNP
dan fragmen DNA spesifik TYLCV Setelah itu, campuran diinkubasi pada suhu 95°C selama 5
menit. Segera setelah itu, H 2 NOH dan HAuCl 4 (1 μL) ditambahkan dan dicampur secara
individual untuk memicu pertumbuhan AuNP. Pada suhu 95°C, fragmen DNA yang
diamplifikasi didenatured dan diubah menjadi ssDNA. Karena probe DNA terkonjugasi dengan
hibrid AuNP hanya ssDNA pelengkap dan mengembangkan heliks ganda, probe AuNP dapat
membedakan ssDNA komplementer dari ssDNA yang tidak cocok. Selain itu, kesamaan jumlah
dan urutan cDNA akan mempengaruhi pertumbuhan, ukuran dan bentuk AuNP; ukuran dan
bentuk AuNP memiliki warna dan spektrum UV/tampak yang bervariasi. Variasi warna
pertumbuhan AuNP karenanya dapat dianggap sebagai interpretasi semi-kuantitatif dari
konsentrasi cDNA. Fitur ini menunjukkan bahwa deteksi DNA yang mengandalkan probe AuNP
dapat dilakukan dengan mata telanjang. RPA yang terintegrasi dengan probe AuNP dapat
memenuhi diagnosis DNA yang sederhana dan nyaman. Sistem ini kedepannya bisa diterapkan
untuk diagnosa penyakit di lapangan.
Uji kolorimetri probe AuNP yang teridentifikasi TYLCV.
Rancangan probe amplikon dan AuNP yang teridentifikasi merupakan prioritas dalam
diagnosis DNA visual. Untuk memenuhi kebutuhan reaksi RPA, set primer yang baru
diidentifikasi TYLCV didesain ulang dan memiliki panjang yang lebih kecil, sensitivitas yang
lebih besar, dan akurasi yang lebih tinggi daripada set primer konvensional (Supplementary Fig.
S2). Menurut urutan nukleotida yang diamplifikasi dari sampel terinfeksi yang terpisah dan isolat
TYLCV, probe DNA yang dikonjugasikan dengan AuNP dirancang (Gambar. 1a).

Gambar 2. Ilustrasi skematis diagnosis DNA visual TYLCV dalam satu tabung.
SsDNA pelengkap buatan juga dirancang sama dengan amplikon yang teridentifikasi TYLCV
yang dapat dihibridisasi dengan probe AuNP (Gbr. 1b ).
Untuk mengklarifikasi efektivitas dan sensitivitas amplikon target yang terdeteksi probe-
AuNP, cDNA dengan konsentrasi bervariasi berturut-turut dihibridisasi dengan probe AuNP.
Warna pertumbuhan AuNP diubah dari merah jambu ke warna lain secara berurutan, biru tua,
biru tua, nila, ungu, ungu-merah, ungu muda, yang mencirikan konsentrasi cDNA 10, 5, 1, 0,5,
0,1 μM, 50nM, masing-masing. Konsentrasi kurang dari 10nM menjadi warna yang tidak jelas;
bahkan endapan muncul pada reaksi kurang dari 0,5-nM (Gbr. 1c ). Oleh karena itu, uji
kolorimetri dari
AuNP yang teridentifikasi TYLCV dapat dilakukan; variasi warna larutan memberikan
interpretasi semi-kuantitatif dari konsentrasi cDNA. Tidak seperti di karya sebelumnya,
pengujian ini menggunakan cDNA panjang (60 nt) untuk berhibridisasi dengan probe AuNP
pendek (20 nt). Peningkatan panjang cDNA memenuhi persyaratan identifikasi DNA. CDNA
yang lebih panjang tampaknya menghasilkan variasi warna yang luas dari larutan AuNP
pertumbuhan, cocok untuk pengamatan visual karena distribusi warna dan konsentrasi cDNA
yang lebih baik.
Optimasi kondisi RPA.
Dalam kondisi optimal, reaksi RPA (TwistAmp ® Kit Dasar) bekerja pada suhu konstan
(37-39°C) selama 20–40 menit berdasarkan rekomendasi pabrikan. Hasil amplikon RPA yang
dihasilkan pada 39 °C selama 40 menit lebih banyak daripada PCR konvensional (Gbr. 3a ).
Reaksi RPA dapat beroperasi dengan baik pada kisaran suhu 25–45°C, terutama pada panas
tubuh manusia (33°C). Reaksi dapat dideteksi hanya dalam 5 menit. Untuk menghemat waktu
dan tenaga, kami mempelajari kondisi terbaik dari reaksi RPA untuk mendeteksi TYLCV.
Reaksi RPA dilakukan berturut-turut pada 33, 35, 37 dan 39°C selama 5, 10, 20 dan 30 menit.
Sebagai hasil elektroforesis gel, amplikon RPA memiliki hasil maksimum pada 37°C dan hasil
minimum pada 33°C selama 30 menit. Pengaruh variasi durasi menunjukkan bahwa batas rendah
deteksi dihasilkan pada 10 menit (Gbr. 3b ).
Deteksi kolorimetri kemudian diperiksa untuk memahami kelayakan kondisi terdeteksi
rendah yang sesuai dengan reaksi RPA yang terintegrasi dengan probe AuNP. Warna
pertumbuhan AuNP yang dihibridisasi dengan berbagai reaksi RPA adalah ungu, biru-violet,
biru laut, yang mencirikan suhu reaksi dari 33, 35, 37 hingga 39°C, masing-masing. Bahkan
warna sedikit (10 menit) dan tidak jelas (5 menit) deteksi reaksi RPA sama-sama ungu. Warna
probe AuNP yang terdeteksi dalam berbagai reaksi RPA mirip dengan berbagai macam
konsentrasi ssDNA pelengkap buatan (Gbr. 3c ). Hasil ini mengungkapkan bahwa kondisi efisien
yang terdeteksi untuk reaksi RPA adalah inkubasi pada 33°C selama 10 menit, yang dapat
diterapkan pada deteksi DNA dengan probe AuNP.

Gambar 3. Optimalisasi kondisi RPA. ( Sebuah) Perbandingan produk PCR dan RPA
konvensional. ( b)
Amplifikasi temperatur RPA yang bervariasi selama 30 menit dan variasi durasi RPA pada 33 °
C. ( c) Deteksi kolorimetri pada variasi suhu RPA selama
30 menit dan variasi durasi RPA pada 33 ° C. Gel dengan panjang penuh disajikan pada Gambar
Tambahan S4.

Gambar 4. Uji sensitivitas diagnosis TYLCVDNA melalui PCR dan RPA konvensional. (a) Plot
korelasi antara jumlah amplikon PCR dan konsentrasi template. (b) Gambar elektroforesis gel
PCR. (c) Plot korelasi antara jumlah amplikon RPA dan konsentrasi template. (d) Gambar
elektroforesis gel RPA. NTC, tanpa kontrol template. Bilah kesalahan mewakili ± sd, n = 4. Gel
dengan panjang penuh disajikan pada Gambar Tambahan S5.

Sensitivitas diagnosis DNA visual.

Untuk memahami batas keberhasilan prosedur diagnosis DNA visual, kami memeriksa
sensitivitas diagnosis DNA TYLCV. Sensitivitas RPA dibandingkan dengan PCR konvensional
menggunakan jumlah yang sama dari isolat TYLCV 82-2-1 DNA. Berdasarkan elektroforesis
gel, terdapat korelasi positif antara efek amplifikasi dan konsentrasi template pada kedua PCR
konvensional ( R2 = 0,9438) dan RPA ( R2 = 0,8909). RPA (1 salinan / μL) jelas satu juta kali
lebih sensitive dari PCR konvensional (10 6 salinan/μL) (Gbr. 4 ) dan lebih cepat daripada PCR
waktu nyata kuantitatif (qPCR) (Gambar S3).
Setelah itu, sensitivitas amplikon RPA yang dideteksi-probe-AuNP direalisasikan pada
penemuan warna dan spektrum UV / tampak dari larutan AuNP pertumbuhan. Warna-warna
yang berasal dari amplikon RPA pada kisaran konsentrasi templat diubah secara jelas dari merah
jambu (NTC) menjadi warna-warna berurutan, seperti ungu muda (1–10 3 salinan/μL), ungu (104–
105 salinan/μL), biru-ungu (106–107 salinan/μL) dan biru tua (108–109 salinan/μL) (Gbr. 5a ).
Penyerapan maksimum pertumbuhan AuNP yang diubah dari merah muda (530nm, A530)
menjadi biru (570nm, A570) (Gbr. 5b ) adalah fenomena pergeseran biru (Fang dkk.). Untuk
memperjelas secara akurat hubungan antara warna dan template konsentrasi, rasio penyerapan R
(A570/A530) dari pertumbuhan AuNP telah diperkirakan. Hubungan antara rasio absorpsi R dan
konsentrasi template menunjukkan distribusi linier ( R2 = 0,9239) (Gbr. 5c ). Penting bahwa 1
salinan/μ L dari TYLCV dapat dideteksi dengan diagnosis DNA visual, sedangkan jumlah virus
yang mencapai 106 salinan/μ L menunjukkan warna yang beragam.

Gambar 5. Uji sensitivitas diagnosis DNA visual menggunakan isolat referensi.(a) Deteksi
kolorimetri dan ( b) Spektrum absorpsi larutan AuNP pertumbuhan berasal dari amplikon RPA.
▼ menunjukkan daya serap maksimum dari setiap larutan AuNP pertumbuhan. (c) Plot korelasi
antara rasio penyerapan R (A570/A530) dan konsentrasi template. NTC, tanpa kontrol template.
Bilah kesalahan mewakili ± sd, n = 4.
Reliability assessment DNA diagnosis visual.
Ekstraksi asam nukleat patogen selalu disertai dengan sejumlah besar DNA genom
inang (gDNA), karena konsentrasi asam nukleat dari suatu patogen diencerkan dengan banyak
gDNA inang, yang akan mengganggu diagnosis DNA. Untuk alasan ini, keandalan diagnosis
DNA visual diverifikasi dengan cara tanaman tomat terinfeksi dengan berbagai gejala. Tujuh
sampel yang terinfeksi didiagnosis dengan PCR konvensional (Gambar Tambahan. S2b, c) dan
sekuensing nukleotida (Gambar. 1a ). Reaksi RPA tanaman terinfeksi dikonfirmasi dengan
elektroforesis gel, uji kolorimetri dan rasio absorpsi R (A570/A530), masing-masing (Gbr. 6 ).
Hasil elektroforesis gel menunjukkan jumlah virus pada sampel, namun tidak terdapat perbedaan
yang signifikan antara sampel dengan jumlah virus yang besar. Warna AuNP sampel 1 dengan
tampilan yang sehat menunjukkan warna ungu sedangkan sampel 2-7 dan isolat referensi 57-2
menunjukkan warna ungu-biru atau biru-ungu. Rasio penyerapan R (A570/A530) jelas
menunjukkan bahwa sampel 1 (R = 0,95) membawa 10 eksemplar/μL ( R = 0,94) dari TYLCV;
jumlah virus sampel 2 ( R = 1,55) lebih dari 109 salinan/μL (R=1.31). Sampel dengan jumlah
virus yang besar diharapkan menunjukkan warna yang kaya, yaitu biru atau biru-ungu, dan rasio
penyerapan yang besar R (>1), kecuali sampel 7 yang memiliki rasio absorpsi sangat besar
kemungkinan disebabkan oleh pengendapan AuNP. Selain itu, isolat referensi 57-2 dengan
polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) (Gbr. 1a ) masih menunjukkan kinerja yang buruk dalam
rasio warna dan penyerapan R di bawah konsentrasi template yang besar (10 9 salinan/μL).
Fenomena ini diungkap oleh Fang dkk., tetapi hasil diagnostik tetap ada diskriminasi. Secara
umum, hasil diagnostik dari uji kolorimetri dan rasio absorpsi konsisten; diagnosis DNA visual
karenanya dapat diterapkan untuk identifikasi TYLCV.
Kesimpulan
Pengembangan diagnosis DNA visual dengan RPA terintegrasi dan probe AuNP.
Pekerjaan ini menunjukkan bahwa sistem yang sangat baik ini dapat memperkuat dan
mendeteksi DNA dengan prosedur yang cepat dan sederhana serta mempertahankan sensitivitas
yang tinggi. DNA yang diperkuat dengan RPA pada suhu rendah untuk durasi yang lebih sedikit
mencapai penghematan waktu dan tenaga. Amplikon RPA yang didiskriminasi dengan probe
biosensor AuNP membentuk larutan terlihat dengan warna bervariasi, yaitu ungu muda, ungu,
biru-ungu, biru tua. Seluruh prosedur hanya memakan waktu 20 menit dan kebutuhan peralatan
yang sederhana. Berdasarkan uji kepekaan diagnosis visual TYLCV DNA ini, diperoleh hasil
bahwa sistem ini lebih cepat dan lebih sensitif daripada PCR dan qPCR konvensional.
Khususnya, 1 salinan/μL virus dan tanaman yang terinfeksi dengan penampilan yang sehat masih
dapat diidentifikasi. Warna reaksi dapat memproses secara kualitatif dan kuantitatif analisis
virus. Sistem ini dapat dengan jelas mendeteksi virus pada tanaman tomat yang terinfeksi
meskipun terdapat gangguan dari DNA genom tanaman sesuai dengan penilaian reliabilitas.
Berdasarkan keunggulan uraian di atas, maka sistem ini dapat diaplikasikan langsung untuk
pemantauan kesehatan di lapangan. Karena prosedur dan reagen sistem ini sederhana dan
nyaman, maka dapat dikombinasikan dengan system mikrofluida untuk mencapai diagnosis
multipleks atau tunggal.
Gambar 6. Penilaian keandalan diagnosis DNA visual menggunakan tanaman yang terinfeksi.
(a) Gambar elektroforesis gel RPA, (b) Deteksi kolorimetri, dan (c) Rasio penyerapan R
(A570/A530) larutan AuNP pertumbuhan yang berasal dari tanaman yang terinfeksiTYLCV dan
isolat 57-2.
Bilah kesalahan mewakili ± sd, n = 4. Sampel 1 berpenampilan sehat. Sampel 2-7 rusak parah.
Rasio penyerapan R dari NTC=0,79. Gel dengan panjang penuh disajikan pada Gambar
Tambahan S6.