TUGAS TERSTRUKTUR CASE STUDY

MATA KULIAH TEKNIK PENELITIAN PENYAKIT

Instruksi:

Pilih salah satu artikel hasil penelitian (yang mengandung latar belakang, metode dan hasil
pembahasan dengan data minimal 3 data hasil penelitian) dari jurnal internasional bereputasi
tentang “metode deteksi atau identifikasi patogen tanaman (pilih salah satu jenis patogen
tanaman) menggunakan teknik PCR, real time PCR atau sequensing. Buat resume dan analisis
interpretasi datanya sesuai tabel berikut.

Uraian Penilaian
Nama Lu’lu’il Maknunin
NIM 2146000123
Judul Artikel Early Detection of Cercospora Species in Soybean Plants:
Immunologic and Molecular Methods
Penulis Maria Gabriela Latorre Rapela, Maria Cristina Lura, Ivan Marcipa
DOI http://dx.doi.org/10.4236/ajps.2015.618289
Latar Belakang Penyakit siklus sering terjadi menjadi masalah pada tanaman 10
kedelai sehingga menimbulkan penurunan hasil. Salah satu sumber
penyebab penyakit yang terjadi di Argentina adalah hawar daun
dan spot biji ungu yang disebabkan Cercospora kikuchii. Faktor
patogenisitas cendawan ini adalah dari cercosporin atau senyawa
racun yang dikeluarkan. Pengendalian yang umum dilakukan
umunya ketika tanaman sudah bergejala. Akan tetapi, seiring
berkembangnya ilmu bioteknologi, maka deteksi akurat dari
adanya pathogen dapat dilakukan sejak dini agar pengendalian
yang akan dilakukan tidak terlambat dan tepat sasaran. Teknik
identifiaksi yang dapat dilakukan seperti dengan Dot-ELISA atau
Dot-Blot sebagai metode diagnosis, namun disisi lain, PCR
memiliki keunggulan besar dalam identifikasi jamur karena
merupakan metode yang cepat dengan proses cepat. (uraikan latar
belakang penelitian dengan singkat dan padat)
Tujuan Penelitian Menganalisis kecepatan, ketepatan dari metode deteksi pathogen 5
spesies Cercospora dengan teknik Dot-Blot dan PCR
Metode Penelitian Teknik yang digunakan pada deteksi pathogen Cercospora pada 30
isolat dari tanaman kedelai diawali dengan pemberian perlakuan
pada tanaman yaitu tanaman sehat (control), sehat dan diberi
perlakuan air steril, tanaman yang diinokulasikan pathogen
CK611, CS6715, CK15 dan CK32. Kemudian untuk menentukan
seberapa cepat jamur dapat dideteksi maka waktu pengambilan
sampel dilakukan pada 4 jam, 24 jam, 2 hari, 4 hari, dan 6 hari.
Langkah berikutnya adalah melakukan teknik dot-blot untuk
mendapatkan protein CFP rekombinan dan antibody anti-CFP
sebagai primer reverse dan mundur dengan yang diambil dari
 proses ekstraksi protein CFP, adsorpsi antibody nonspesifik dari
serum kelinci, dan penentuan cut-off line. Primer dari bahan ini
disarankan oleh pemrogram karena memiliki skor tertinggi untuk
memperkuat keakuratan hasil pengkodean nantinya karena
disesuaikan dengan urutan sequence pada GenBank (nomor aksesi
GenBank: AF091042)

Tahap berikutnya adalah penggunaan teknik PCR dalam deteksi

yang diawali dengan proses ekstraksi DNA dari sampel. Proses
ekstraksi DN dari jamur dan jaringan tanaman dilakukan dengan
mengekstrak bagian tanaman dan menumbuhkan pada gel agarosa.
Miselia yang telah berkembang, diambil dan dimasukkan dalam
tabung mikro dan ditambahkan EDTA 0,5 M (pH 8) serta enzim
litikase. Selanjutnya, dilakukan inkubasi selama 1 jam kemudian
disentrifuge. Endapan yang diperoleh dari proses sentrifugasi,
selanjutnya ditambahkan larutan Nuclei lysis solution dan Protein
precipitation solution untuk mendapatkan supernatan mengandung
DNA jamur. Disamping menjalankan proses ini, primer yang telah
dirancang untuk meningkatkan spesifisitas dengan tanaman juga
harus dipersiapkan kembali agar selaras & hasil analisis computer
nantinya dari urutan tersebut dapat disimpan di GenBank. Pada
proses ini juga dilakukan identifikasi CFP atau program start DNA
menggunakan Sequence Analysis Software dengan memilih CFP
tertinggi atau urutan basa paling mirip seperti CFP-1 dan CFP-2.
Dilanjutkan dengan proses setelah ekstraksi DNA, dilakukan
amplifikasi dengan volume total 50 µl yang terdiri dari 5 µl
sampel DNA, 10 µl buffer, 1.5 mM MgCl2, 25 µl U Taq DNA
polymerase dan sisanya diberi air steril. Amplifikasi ini dilakukan
dengan setiap satu siklus melalui denaturalisasi 3 menit pada suhu
95oC, siklus annealing dijalankan selama 1 menit pada suhu 58oC,
dilanjutkan dengan proses elongasi atau perpanjangan dengan
durasi 5 menit pada 72oC. Proses ini akan berlangsung kurang
lebih 30 siklus dan selanjutnya produk amplifikasi dipisahkan
dengan elektroforesis. Elektroforesis dilakukan dengan menaruh
DNA yang telah di PCR pada gel agarosa dan direndam dengan
Tris-borat 0,089 M dan EDTA 0,002 M. Waktu yang dibutuhkan
pada elektroforesis memakan waktu 180 menit dengan tegangan
100 V. Pewarnaan gel dilakukan dengan pemberian etidium
bromide dan 100-bp DNA Ladder sebagai penanda gen. Hasil
elektroforesis kemudian difoto dengan Gel Doc XR System
dengan software Quantity One.

*Note: Pengujian ini diterapkan pada tanaman yang diinokulasikan

dengan isolat pathogen CK32 dan CK15 dan menggunakan DNA
CK6711 dan CS6715 sebagai kontrol.
Hasil Data 1 15
 Keterangan gambar data
Dot-Blot ekstrak tanaman dan kontrol positif. Baris 1-8: tanaman
dengan penyakit, baris 9-15: tanaman sehat, baris 16: kontrol
positif (Cercospora kikuchii NBRC 6711)
 Metode mendapatkan hasil
Hasil Dot-Blot tersebut didapatkan dari pemberian primer spesifik
CFP dengan hasil tertinggi yaitu dengan CFP-1 dan CFP-2 pada
ekstrak tanaman berpenyakit maupun kontrol sehingga akan
menunjukkan kemunculan spesies Cercospora di perlakuan mana
saja berupa warna pekat hingga bening transparan.
 Interpretasi data
Berdasarkan visualisasi yang didapatkan dari eksperimen diatas,
didapat bahwa ekstrak tanaman yang diberi strain CK6711 dan
CS6715 menunjukkan warna paling gelap dibandingkan dengan
strain pada ekstrak lainnya. Pada pengamatan 4 hari setelah
inokulasi, setiap sampel yang diinokulasi dengan isolate CK32
menunjukkan skor 32 yang berarti terdapat protein CFP pada
jaringan daun. Sedang–kan pada pengamatan 4 jam, 24 jam, dan 2
hari pasca-inokulasi hanya menunjukkan nilai kurang dari 2 serta
tanaman yang hanya diberi air steril tidak menunjukkan adanya
protein.
 Kesimpulan data
Kesimpulan dari hasil data tersebut adalah primer spesifik yang
diberikan pada perlakuan yang berbeda akan hanya akan bereaksi
dengan protein sasaran sehingga yang akan tereplikasi dan muncul
juga sesuai dengan target. Sedangkan yang tidak muncul, artinya
tidak terdapat DNA target sehingga primer tidak bekerja untuk
menggandakan DNA sasaran.
Data 2 15
 Keterangan gambar data
Dot-Blot diterapkan pada ekstrak tanaman yang terinfeksi
Cercospora kikuchii NBRC 6711 pada waktu yang berbeda pasca
inokulasi. 1: tanaman diinokulasi dengan air steril; 2: tanaman
yang tidak diinokulasi; 3, 4, 5, & 6: tanaman yang diinokulasi
dengan Cercospora kikuchii NBRC 6711 masing-masing pada
waktu 4 jam, 24 jam, 4 hari dan 6 hari; 7: kontrol positif (ekstrak
CK NBRC 6711); 8: kontrol negatif (ekstrak Penisilium sp.)
 Metode mendapatkan hasil
Hasil Dot-Blot tersebut didapatkan dari pemberian primer spesifik
CFP pada ekstrak tanaman terinfeksi CK NBRC 6711 maupun
kontrol sehingga akan menunjukkan banyaknya kemunculan strain
di perlakuan mana saja berupa warna pekat hingga bening
transparan sebagai bentuk deteksi.
 Interpretasi data
Berdasarkan visualisasi yang didapatkan dari eksperimen, didapat
bahwa ekstrak tanaman yang diberikan oligonukleotida CFP-1 dan
CFP-2 akan memungkinkan amplifikasi pada bagian dalam protein
sehingga pada waktu 4 jam setelah inokulasi tanaman dengan
strain rujukan yaitu CK6711 dan CS6715 serta isolate CK32 akan
cepat terlihat. Sinyal ini akan terus meningkat seiring berjalannya
waktu sehingga visual lebih jelas. Hasil yang didapatkan pada
perlakuan ini serupa dengan data yang diperoleh dari ekstrak
tanaman yang terinfeksi CS6715.
 Kesimpulan data
Kesimpulan dari hasil data tersebut adalah primer spesifik yang
diberikan dengan sensitifitas tinggi akan mempercepat munculnya
hasil deteksi.
Data 3 15
  Keterangan gambar data
Hasil elektroforesis dari amplifikasi CFP oleh PCR pada tanaman
kedelai dengan waktu yang berbeda pasca-inokulasi. Keterangan
M; penanda 100 bp DNA ladder; B: reagen kosong; 1: tanaman
diberi air steril; 2 & 3: tanaman diinokulasi dengan CK32; 4 & 5
tanaman diinokulasi dengan Cercospora sojina NBRC 6715; 6:
kontrol positif (Cercospora kikuchii NBRC 6711)
 Metode mendapatkan hasil
Cara mendapatkan hasil tersebut adalah dengan melakukan PCR
untuk menggandakan DNA target yang selanjutnya dilakukan
analisis dengan elektroforesis untuk membuktikan adanya spesies
target pada sampel jaringan tanaman yang digunakan pada setiap
perlakuan.
 Interpretasi data
Pada gambar diatas dapat dilihat bahwa amplifikasi pada tanaman
kedelai yang diberi air steril tidak menunjukkan adanya DNA
pathogen sedangkan pada gel sampel yang diperoleh dari tanaman
yang diinokulasi dengan CK15, CK32, CK6715, dan CK6711
sebagai kontrol menunjukkan adanya DNA target.
 Kesimpulan data
Dapat disimpulkan bahwa pada teknik PCR pun juga menunjuk-
kan bahwa pembentukan primer yang telah disesuaikan dengan
GenBank dapat menjadi petunjuk dalam penandaan gen pada
spesies yang sama sehingga akan terlihat keberadaan pathogen di
tanaman dengan perlakuan yang dibedakan.
Kesimpulan umum  Pada teknik Dot-Blot dan PCR, pathogen dapat terdeteksi ketika 10
konsentrasi cercosporin yang dihasilkan jamur tinggi
 Sensitivitas proses pada kedua teknik berbeda, PCR selalu dapat
digunakan untuk deteksi pada tahap awal infeksi tanpa gejala
atau tanda penyakit yang terlihat
 Dot-Blot memungkinkan deteksi penyakit pada 4 hari setelah
inokulasi, PCR mendeteksi dengan durasi 4 jam bahkan tanpa
gejala penyakit.
 Metode ini harus divalidasi dengan sampel lapangan
 Infeksi pada perlakuan pemberian primer spesifik terjadi lebih
 cepat pada tanaman
 Sampel ekstrak tanaman yang terdeteksi adanya DNA target
(CFP) hanya pada tanaman yang diinokulasikan
Total 100