BAB III

METODE PENELITIAN

Berikut ini adalah metode penelitian yang dilakukan pada jurnal Deteksi Secara Serologi
Dan Molekuler Beberapa Jenis Virus Yang Berasosiasi Dengan Penyakit Mosaik Tanaman
Nilam (Pogostemon cablin Benth) dan Jurnal Further evidence of true seed transmission of
Piper yellow mottle virus in black pepper (Piper nigrum L.)
2.1 Bahan dan Metode Jurnal Deteksi Secara Serologi Dan Molekuler Beberapa Jenis
Virus Yang Berasosiasi Dengan Penyakit Mosaik Tanaman Nilam (Pogostemon
cablin Benth).
2.1.1 Deskripsi Gejala Mosaik
Sampel daun tanaman nilam diambil dari kebun benih nilam KP Cicurug,
KP Manoko, dan lahan pertanian di Cijeruk, baik pada tanaman yang sehat
maupun sakit. Di lapangan, dilakukan dokumentasi gejala untuk keperluan
deskripsi gejala mosaik, yaitu lemah sampai parah, dan gejala penebalan daun
ataupun daun mengecil, seperti yang diuraikan oleh Noveriza et al (2012a)
penyakit mosaic diketahui menjadi kendala utama pada pertanaman nilam di Jawa
dan Sumatera Barat. Kejadian penyakit mosaik akibat infeksi Potyvirus
diperkirakan berkisar Antara 30-50%, sedangkan di Jawa Tengah akibat infeksi
Broad bean wilt virus 2/BBWV2 (anggita genus Fabavirus berkisaran 40%.
Sampel ini selanjutnya digunakan untuk deteksi serologi dan molekuler.
2.1.2 Deteksi Serologi
Deteksi ini menggunakan empat antiserum yaitu antiserum universal Potyvirus
dengan prosedur indirect-ELISA mengikuti cara Koenig (1977) dibuat oleh
produsen antiserum (DSMZ) Jerman, antiserum spesifik BBWV2 dan dan
Cymbidium mosaic virus/CymMV dengan prosedur direct-ELISA mengikuti cara
(Clark dan Adam, 1977) dibuat oleh produsen antiserum (DSMZ) Jerman, serta
antiserum spesifik CMV dengan prosedur indirect-ELISA mengikuti cara Koenig
(1977) dibuat oleh agdia (USA). Sampel didapatkan dari setiap lokasi dibuat
menjadi beberapa sampel komposit, penggunaan sampel komposit bertujuan
untuk meminimalkan sampel yang dideteksi dan penggunaan bahan-bahan
 ELISA, khususnya antiserum. Apabila sampel komposit menunjukkan hasil
positif maka uji serologi dilanjutkan setiap individu sampel dari sampel komposit
positif tersebut. Mengikuti penelitian Matthews (1993) dalam Damayanti (2004).
Akumulasi virus secara kuantitatif dibaca dengan ELISA READER pada panjang
gelombang 405 nm. Hasil pembacaan dinilai positif apabila nilai absorbannya 1,5-
2 kali lebih besar daripada nilai absorban sampel dari tanaman sehat.
2.1.3 Deteksi Molekuler
Dilakukan terhadap BBWV2 dan CymMV mengikuti prosedur Naidu dan
Hugnes (2003) Setelah dilakukan proses identifikasi virus CMV, dan deteksi
serologi dengan metode ELISA selanjutnya diagnosis penyebab mosaik pada
tanaman nilam tersebut dilakukan dengan teknik reverse transcription-
polymerase chain reaction (RT-PCR) yaitu :
Ekstraksi DNA diperoleh Hasil ekstraksi total RNA pada tanaman nilam
menggunakan Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT-Philekorea Technology).
Konstruksi cDNA Diperoleh cDNA pada reaksi reverse transcriptase.
Selanjutnya cDNA yang telah terbentuk akan digunakan sebagai template.
Amplifikasi DNA dengan PCR cDNA yang dihasilkan digunakan pada
pasangan primer BBWVVSSP dan BBMWVKMRM untuk mendeteksi awal
BBMWV2 pada tanaman nilam, dengan urutan basa 5’-
GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’ dan 5’-
TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3’, ukuran DNA yang didapatkan sebesar
323 bp (Tabel 1) (Kondo et al., 2005). Program PCR yang diatur 95° C (5
menit); 35 siklus terdiri dari 95° C (1 menit), 51° C (1 menit), dan 72° C (1 menit);
diakhiri 72° C (5 menit) (Tabel 2) (Miglino et al., 2011). Dan kontrol positif yang
digunakan CymMV dari anggrek dengan pasangan primer Potex 4 dan Potex 5,
dengan urutan basa 5’-AGCATGGCGCCATCTTGTGACTG-3’ dan 5’-
CTGAAGTCACAATGGGTGAAGAA-3’, ukuran DNA 280 pb (Tabel 1)
Kondo et al., 2005). Program PCR yang diatur 94° C (2 menit); 35 siklus terdiri
dari 94° C (30 detik), 55° C (1 menit), dan 72° C (1 menit); diakhiri 72° C (5 menit)
(Tabel 2) (Miglino et al., 2011).
 Visualisasi DNA sampel DNA hasil amplifikasi di elektroforesis pada 50
Volt, hasil visualisasi dilihat di bawah transilluminator ultraviolet dan
dikomentasi dengan kamera digital.
Perunutan Susunan Neuklotida Hasil sekuen dianalisis menggunakan
software BLAST (www.ncbi.nml.niv.gov) (Altshul et al., 1990).

2.2 Bahan dan Metode dan Jurnal Further evidence of true seed transmission of Piper
yellow mottle virus in black pepper (Piper nigrum L.)
2.2.1 Identifikasi Tanaman Asal
Tanaman lada hitam dikumpulkan dari tanaman yang sehat dan terinfeksi
dari lokasi Panniyur-1, IISR-Thevam dan Subhakara kemudian dilakukan :
Pemisahan bagian buah menjadi bagian-bagian komponen yaitu
terdiri embrio, endosperm dan perisperm.
Budidaya Bibit, bibit yang berkecambah dipindahkan ke tempat lain dan
disimpan di rumah kaca anti serangga untuk dilakukan pengamatan
Pengumpulan kepala sari, kepala sari bunga lada hitam dipisahkan dari
tangkai kemudian di ekstrasi, diperoleh hasil ekstraksi kepala sari bunga lada
hitam
 Semua bagian buah lada hitam (embrio, endosperm dan perisperm), bibit
dan kepala sari bunga diidentifikasi dengan PCR menggunakan primer spesifik
PYMoV AIB 35/AIB 36, dengan urutan TAACAGACTAGGGATCG dan
CAGCTGGTCTTGATAATAG, wilayah diperkuat ORF-1 dengan suhu 52 ° C
menampilkan ukuran pita DNA 480 bp (Tabel 1).

2.2.2 Deteksi Virus Dengan PCR

Dilakukan ekstraksi DNA, isolasi DNA dari semua bagian tanaman lada
hitam (embrio, endosperm dan perisperm), kepala sari, dan bibit menggunakan
CTAB yang dimodifikasi metode seperti yang dijelaskan oleh Hareesh dan Bhat
(2008). Total DNA yang diisolasi tiap sampel diuji dengan PCR dilakukan dengan
empat metode berbeda kombinasi primer spesifik PYMoV pada bagian buah
(embrio, endosperm dan perispem), kepala sari bunga dan bibit diuji awalnya
dengan PCR pasangan primer spesifik PYMoV AIB 35 dan AIB 36 dan hasil
yang diperoleh dikonfirmasi lebih lanjut oleh PCR menggunakan tiga primer
spesifik PYMoV yang berbeda kombinasi AIB 36/AIB 107, AIB 104/AIB 105
dan AIB 35/AIB 159, dengan ukuran pita DNA 350-900 bp (Tabel 1).