8

3 METODE

Kerangka Penelitian

Kerangka penelitian meliputi isolasi bakteri endofit, identifikasi bakteri

endofit terseleksi berdasarkan sekuen 16S rDNA, uji antimikrob bakteri
teridentifikasi serta uji toksisitas bakteri endofit terpilih menggunakan embrio
ikan zebra (Gambar 3).

Isolasi Bakteri Endofit

Seleksi Bakteri Endofit Berdasar

Karakteristik Morfologi Koloni

Identifikasi Bakteri Endofit

Berdasar Analisis 16S rDNA

Isolat Bakteri Endofit

Teridentifikasi

Uji Aktivitas Antimikrob Bakteri

Endofit Teridentifikasi

Uji Potensi Bakteri Endofit Terpilih dalam

Menghasilkan Senyawa Toksik Menggunakan
Embrio Ikan Zebra

Gambar 3 Diagram alur penelitian

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2012 sampai April 2014 di

Laboratorium Biosistematika dan Kultur Koleksi Mikrob, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kunyit putih
(C. zedoaria), media Nutrient Agar (NA), media Water Yeast Extract Agar
 9

(WYEA) (Lampiran 1), media Nutrient Broth (NB), media Potato Dextrose Agar
(PDA), media Potato Dextrose Broth (PDB), etanol 70%, larutan natrium
hipoklorit, Gotaq Green Master Mix, bahan-bahan PCR, dan embrio ikan zebra.
Alat-alat yang digunakan antara lain inkubator, micropippet, mesin PCR, alat
elektroforesis, UV transilluminator, spektrofotometer, sentrifugasi, evaporator,
mikroskop, plate multiwell, serta alat-alat gelas.

Sampel Tanaman

Tanaman kunyit putih (C. zedoaria) diambil dari tiga lokasi yang berbeda.
Sampel tanaman diambil dari kebun pribadi di Bojong Gede (BG), kebun
percobaan Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, (CBN), dan kebun koleksi
tanaman obat, Pusat Penelitian Biofarmaka, IPB, Dramaga (DRMG) (Tabel 2).
Masing-masing sampel diambil tiga tanaman. Sampel tanaman diambil pada bulan
November 2012April 2013. Tanaman yang diambil adalah tanaman sehat bebas
kontaminasi patogen tanaman. Sampel selanjutnya dibawa ke laboratorium dan
dalam waktu 24 jam sampel sudah diisolasi. Sampel tanaman diidentifikasi di
Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI. Identifikasi dilakukan
berdasarkan karakteristik morfologi dengan mengacu pada buku identifikasi
tanaman Flora of Java (Backer dan van den Brink 1968) dan membandingkan
dengan spesimen herbarium yang terdapat di Herbarium Bogoriense.

Tabel 2 Lokasi sampel tanaman kunyit putih (C. zedoaria)

Asal tanaman Lokasi tanaman Umur tanaman Bagian tanaman
Balitro Bojong Gede 11 bulan Seluruh bagian
Rimbo Panti, Padang LIPI Cibinong 8 bulan Seluruh bagian
Cimas, Sukabumi IPB Dramaga 12 bulan Seluruh bagian

Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit Putih

Sterilisasi Permukaan Jaringan Tanaman Kunyit Putih

Sampel tanaman (rimpang, batang, dan daun) dibersihkan dari kotoran
dengan cara dicuci dengan air mengalir selama 510 menit. Tanaman dipotong-
potong dan direndam dalam larutan etanol 70% selama 3 menit. Potongan
tanaman direndam kembali dengan larutan natrium hipoklorit 3% selama 5 menit,
dibilas dengan etanol 70% selama 30 detik, dan dilanjutkan dengan akuades steril
selama 2 menit. Pencucian dengan akuades steril diulang selama tiga kali.
Potongan sampel kemudian dikeringkan menggunakan kertas tisu steril. Efisiensi
sterilisasi permukaan diuji dengan menyebar 100 L akuades hasil pencucian
terakhir pada beberapa jenis media yang sudah ditambah sikloheksamida 50
g/mL untuk menghambat pertumbuhan cendawan. Media yang digunakan adalah
NA, NA dengan 2% ekstrak tanaman kunyit putih (NAT), WYEA, WYEA
dengan 2% ekstrak tanaman kunyit putih (WYEAT). Akuades hasil pencucian
yang menunjukkan adanya pertumbuhan mikrob tidak dapat digunakan sebagai
sampel isolasi bakteri endofit.
10

Isolasi Bakteri Endofit

Isolasi bakteri endofit dilakukan dengan metode plant piece untuk potongan
sampel dan metode spread plate untuk sampel yang dihaluskan. Sampel yang
telah steril, bagian rimpang, batang dan daun dipotong menjadi potongan-
potongan kecil (46 mm). Sampel kemudian diletakkan di atas media yang telah
ditambah sikloheksamida 50 g/mL. Cawan Petri selanjutnya diinkubasi selama
215 hari pada suhu 28 oC (Araujo et al. 2002). Isolasi menggunakan metode
spread plate dilakukan dengan sampel dihaluskan terlebih dahulu menggunakan
mortar steril. Sebanyak 1 g sampel yang sudah dihaluskan dimasukkan ke tabung
reaksi yang berisi 9 mL akuades steril, kemudian dilakukan pengenceran secara
berseri. Sebanyak 100 L dari pengenceran 10-1 dan 10-2 disebar di atas
permukaan media. Media selanjutnya diinkubasi selama 215 hari pada suhu 28
o
C. Koloni bakteri yang tumbuh dari metode spread plate dihitung dan data
populasi ditransformasikan dalam nilai log (CFU per gram sampel). Bakteri yang
tumbuh dari metode spread plate dan plant piece diisolasi dan dipurifikasi.
Selanjutnya bakteri endofit yang memiliki karakteristik morfologi berbeda dipilih
untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Karakteristik morfologi yang diamati
adalah warna, tepian, permukaan dan juga penentuan sifat Gram menggunakan uji
KOH. Interpretasi uji KOH yaitu bakteri merupakan Gram negatif apabila
campuran sel dengan larutan KOH 3% berubah menjadi kental dan berlendir,
Gram positif apabila campuran sel dan larutan KOH 3% tidak berubah menjadi
kental dan berlendir setelah satu menit (Powers 1995).

Pemurnian Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit Putih

Koloni bakteri yang telah tumbuh dimurnikan pada media NA dengan
digores berdasarkan metode kuadran. Pemurnian dilakukan beberapa kali sampai
diperoleh koloni tunggal. Koloni yang telah murni selanjutnya ditanam dalam
tabung reaksi yang berisi agar miring NA dan disimpan pada suhu 4 oC. Isolat
murni selanjutnya dipelihara dengan baik dan digunakan pada uji selanjutnya.

Penyimpanan Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit

Bakteri endofit yang sudah murni disimpan dalam media NA miring.
penyimpanan jangka panjang dilakukan dalam bentuk gliserol 10% kemudian
disimpan dalam suhu 80 oC.

Identifikasi berdasar sekuen 16S rDNA

Isolasi DNA Bakteri Endofit

Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode PCR koloni (Packeiser et
al. 2013). Sel dari koloni tunggal pada permukaan media padat diambil
menggunakan tusuk gigi steril dan disuspensikan ke dalam 50 L air bebas
nuklease. Lisis sel dilakukan dengan suspensi divortex selama 10 detik dan
diinkubasi pada suhu 98 oC selama 5 menit. Lisat selanjutnya di spin down untuk
memisahkan supernatan dan debris sel. Supernatan diambil dan digunakan sebagai
cetakan DNA pada amplifikasi PCR.
 11

Amplifikasi PCR 16S rDNA

Amplifikasi fragmen 16S rDNA dilakukan menggunakan GoTaq (Promega)
dengan primer 27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) dan 1492R (5-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3) (Palaniappan et al. 2010). Komposisi
amplifikasi fragmen 16S rDNA terdiri dari 9.75 L Ultrapure water, 12.5 L
GoTaq Green Master Mix 2x, 0.625 L primer 27F (10 M), 0.625 L primer
1492R (10 M), 0.5 L DMSO, dan 1 L sampel DNA dengan total volume 25
L. Amplifikasi dilakukan dengan kondisi PCR: denaturasi awal 95C selama 90
detik, dilanjutkan (95 C, 30 detik denaturasi; 50 oC, 30 detik annealing; 72 oC, 90
detik pemanjangan) selama 30 siklus dan final extension pada 72 oC selama 5
menit, 4 oC selama 20 menit.

Elektroforesis
Sebanyak 3 l dari produk PCR dianalisis menggunakan gel agarosa 1%
dengan aliran listrik bertegangan 100 V selama 25 menit. Setelah selesai, gel
direndam dalam larutan ethidium bromide 5 g/mL selama 30 menit dan dibilas
menggunakan bufer TAE 1x. Hasil elektroforesis dilihat menggunakan alat UV
transilluminator. DNA dikatakan teramplifikasi apabila pada hasil elektroforesis
diperoleh 1 pita tunggal berukuran 1500 pb.

Sekuensing 16S rDNA, Analisis Bioinformatika dan Konstruksi Pohon

Filogenetik
Produk PCR disekuensing secara parsial menggunakan primer 27F di
Laboratorium Macrogen Korea menggunakan automated DNA sequencer (ABI
PRISM 3130 Genetic Analyzer) (Applied Biosystems). Data hasil sekuensing
selanjutnya diolah dengan program Bioedit. Homologi sekuen 16S rDNA dicari
menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide
(BLASTN) pada website National Centre for Biotechnology Information (NCBI).
Sekuen referensi diperoleh dari bank data DNA NCBI secara online melalui
internet www.ncbi.nlm.nih.gov. Konstruksi pohon filogenetik dianalisis dengan
metode neighbor-joining (Saitou & Nei 1987) yang terimplementasi dalam
program MEGA 5.05 (Tamura et al. 2011) dan nilai bootstrap 1000x.

Bioassay Antimikrob

Persiapan Seed Culture

Mikrob uji yang digunakan adalah B. subtilis InaCCB1, P. aeruginosa
InaCCB3, S. aureus InaCCB4, E. coli InaCCB5, C. albicans InaCCY116, dan
S. cerevisiae InaCCY728. Seed culture mikrob uji dibuat dengan
menginokulasikan 1 ose mikrob uji pada media cair. B. subtilis, P. aeruginosa,
S. aureus, E. coli diinokulasi pada media NB, sedangkan C. albicans dan
S. cerevisiae diinokulasi pada media PDB. Bakteri diinkubasi pada suhu 37 oC
dan yeast diinkubasi pada suhu 30 oC selama 20 jam.

Pembuatan Media Bioassay

Media yang digunakan untuk uji antimikrob adalah media dua lapis terdiri
atas 20 mL lapisan bawah dan 4 mL lapisan atas. Bioassay terhadap bakteri
menggunakan media NA, dan bioassay terhadap yeast menggunakan media PDA.
12

Komposisi media lapisan atas sama dengan komposisi media lapisan bawah tetapi
dengan konsentrasi bacto agar lapisan atas adalah setengah dari konsentrasi bacto
agar lapisan bawah. Seed culture ditumbuhkan pada media NB selama 20 jam.
Pada jam ke-20, dilakukan pemeriksaan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 625 nm untuk bakteri dan 530 nm untuk yeast. Konsentrasi
bakteri dan yeast yang digunakan adalah 106 dan 105 CFU/ml. Setelah diperoleh
konsentrasi yang diinginkan, seed culture ditambahkan pada media lapisan atas
sebelum media tersebut dituangkan ke permukaaan cawan Petri.

Uji Antimikrob
Uji antimikrob dilakukan berdasarkan metode antagonisme langsung.
Bakteri endofit terlebih dahulu ditumbuhkan pada media NA selama 5 hari.
Bakteri endofit pada media agar selanjutnya dibuat dalam bentuk lempengan bulat
menggunakan sedotan steril. Lempengan kemudian diletakkan di atas permukaan
media bioassay. Cawan Petri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk
bakteri, dan suhu 30 oC selama 48 jam untuk yeast. Zona hambat yang terbentuk
diamati pada jam ke-24 dan 48. Uji antimikrob masing-masing bakteri endofit
dilakukan tiga pengulangan. Kriteria kekuatan daya hambat bakteri yang
digunakan adalah sangat kuat (zona hambat >20 mm), kuat (zona hambat1020
mm), sedang (zona bening 510 mm), lemah (<5 mm) (Davis dan Stout 1971).

Produksi Filtrat Kultur Bakteri Endofit dan Ekstraksi Senyawa Aktif

Produksi filtrat dilakukan pada empat bakteri endofit terseleksi yaitu

bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan lebih dari satu mikrob
patogen dan memiliki ukuran daya hambat yang besar (>10 mm). Satu ose penuh
biakan bakteri endofit diinokulasikan ke dalam 5 mL media NB dan diinkubasi
selama 24 jam. Kultur bakteri yang sudah berumur 24 jam diinokulasikan ke
dalam 100 mL media NB dan diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan
kecepatan 120 rpm suhu 28 oC selama 5 hari. Kultur kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang
diperoleh selanjutnya diekstrak menggunakan pelarut organik etil asetat
(Arunachalam dan Gayathri 2010). Etil asetat kemudian dievaporasi
menggunakan evaporator suhu 40 oC. Ekstrak kering yang diperoleh ditimbang
dan dilarutkan dalam akuades apabila akan digunakan.

Uji Toksisitas Akut Ekstrak Terhadap Embrio Ikan Zebra

Uji Toksisitas
Larutan fase ekstrak etil asetat dan fase air dibuat dalam konsentrasi 50,
100, 150, 200, dan 250 ppm. Satu telur embrio ikan zebra dalam 150 L air tawar
dan 150 L ekstrak dimasukkan ke dalam plate multiwell. Satu ulangan dibuat
dalam lima sumur dan ulangan dilakukan sebanyak 3 kali. Multiwell ditutup dan
diinkubasi selama 72 jam pada suhu ruang (Lampiran 2).

Pengamatan Embrio Ikan Zebra

Embrio ikan zebra yang telah terpapar dengan ekstrak aktif selama 72 jam
diamati morfologinya setiap 24 jam inkubasi menggunakan mikroskop stereo.
 13

Bagian organ larva ikan zebra yang diamati meliputi sumbu tubuh, panjang tubuh,
pigmentasi, kantong kuning telur, jantung, warna mata, telinga, dan sirkulasi
darah (Kumar et al. 2013)

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Identitas Sampel Tanaman Kunyit Putih

Identifikasi sampel tanaman dilakukan untuk mengkonfirmasi kembali

kebenaran dari identitas sampel yang digunakan. Karakteristik morfologi yang
diamati antara lain warna rimpang, bentuk rimpang, aroma rimpang, bentuk daun,
dan warna tulang tengah daun. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa ketiga
sampel tanaman tersebut adalah C. zedoaria (Christm.) Roscoe, yang termasuk
dalam genus Curcuma dalam famili Zingiberaceae (Tabel 3).

Tabel 3 Hasil identifikasi sampel tanaman kunyit putih di Herbarium Bogoriense

Lokasi sampel Nama koleksi Famili Species
Bojong Gede Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.)
Roscoe
LIPI, Cibinong Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.)
Roscoe
IPB, Dramaga Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.)
Roscoe

Kelimpahan Bakteri Endofit

Isolasi bakteri endofit dilakukan dari tanaman kunyit putih yang diambil
dari lokasi tanam yang berbeda berdasarkan metode sterilisasi permukaan. Metode
sterilisasi permukaan yang digunakan pada penelitian ini dikatakan berhasil
karena tidak ada pertumbuhan mikrob pada cawan Petri kontrol. Hasil isolasi
menunjukkan bahwa bakteri endofit ditemukan pada semua bagian tanaman
kunyit putih meliputi bagian rimpang, batang dan daun. Keberadaan bakteri
endofit ditemukan hampir pada semua bagian tanaman inang termasuk akar,
batang, daun, biji, buah, umbi, dan juga dalam nodul tanaman legum (Sturz et al.
1997; Jalgaonwala dan Mahajan 2011). Struktur populasi bakteri endofit pada
suatu tanaman dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya adanya rotasi tanaman,
kondisi tanah, umur tanaman, musim ketika dilakukan isolasi, jaringan tanaman,
dan keberadaan patogen tanaman.
Populasi bakteri endofit berbeda antar lokasi, umur, bagian tanaman
(rimpang, batang, daun), dan hal ini juga dipengaruhi oleh jenis media isolasi
yang digunakan. Tiga sampel tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi
berbeda diisolasi menggunakan empat macam media dan dua jenis metode
menunjukkan kelimpahan bakteri endofit yang berbeda. Sampel tanaman dari
CBN menunjukkan kelimpahan bakteri 3 log (CFU/g) sampel, sampel dari BG
adalah berkisar 2 sampai 3 log (CFU/g) sampel, dan sampel dari DRMG adalah
3 sampai 4 log (CFU/g) sampel (Gambar 4).