TUGAS TERSTRUKTUR CASE STUDY

MATA KULIAH TEKNIK PENELITIAN PENYAKIT

Dosen Pengampu: Luqman Qurata Aini, SP., MP., P. hD.
Instruksi:

Pilih salah satu artikel hasil penelitian (yang mengandung latar belakang, metode dan hasil
pembahasan dengan data minimal 3 data hasil penelitian) dari jurnal internasional bereputasi
tentang “penggunaan teknik NGS pada bidang patologi tumbuhan”. Buat resume dan analisis
interpretasi datanya sesuai tabel berikut.

Uraian Penilaian
Nama Lu’lu’il Maknunin
NIM 2146000123
Judul Artikel Use of Next-Generation Sequencing For The Identification and
Characterization of Maize Chlorotic Mottle Virus and Sugarcane
Mozaic Virus Causing Maize Lethal Necrosis in Kenya
DOI 10.1111/j.1365-3059.2012.02690.x
Jenis Artikel Plant Pathology (2013) 62, 741-749
Latar Belakang Pada pengendalian tanaman, dibutuhkan diagnosis yang cepat dan 10
akurat sehingga tindakan lebih tepat. Namun seringkali terkendala
etiologi penyakit seperti penyakit baru atau varian baru. Metode deteksi
umumnya dilakukan dengan PCR atau ELISA yang hanya dapat
digunakan dalam sasaran yang minim. Dewasa ini, terdapat metode
teknologi next generation sequencing (NGS) yang unggul dalam
identifikasi dan cocok untuk virus. Teknologi ini juga dapat
memungkinkan genom virus untuk diurutkan dalam asam nukleat
inang dan memungkinkan untuk identifikasi sekuens pathogen yang
mirip dengan virus. Teknik NGS ini untuk pertama kali digunakan
untuk identifikasi penyakit tanaman jagung yang baru muncul pada
musim gugue di South Rift dengan gejala yang bervariasi. Pada lahan
yang terdampak penyakit ini, tingkat infeksi bahkan mencapai 100%
yang mempenguhi hasil panen.

Gambar 1. Gejala bintik dan garis pada daun jagung dari lahan di
Kenya (a) gejala dari inokulasi eksperimental (b) jelai (c) nekrosis
Sebelumnya juga telah dilakukan upaya diagnosis dengan metode
tradisional dan gagal mendeteksi. Sehingga digunakan pendekatan
NGS. Pada teknik NGS, digunakan metode ekstraksi RNA untuk
menargetkan replikasi RNA virus dan mRNA nya. Sebagai efisiensi
biaya, dilakukan pada sampel yang dikumpulkan dari representasi
 pathogen untuk diidentifikasi. Urutan pada deteksi virus belang
klorosis jagung (MCMV) dan virus mosaic tebu (SCMV) yang telah
diidentifikasi, diduga kombinasi virus ini diketahui menyebabkan
penyakit nekrosis dan mematikan tanaman jagung. Berdasarkan hal ini,
maka dilakukan pengujian dengan PCR real-time spesifik dan
menyoroti tahap diagnostic molekuler khususnya utuk pengurutan
generasi berikutnya.
Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi agen penyebab 5
penyakit dan memberikan urutan diagnostic yang cepat dan tepat untuk
pengembangan berikutnya dengan metode NGS yang sangat berguna
dalam kasus dimana muncul varian baru atau kasus yang belum
diidentifikasi menggunakan teknik konvensional.
Metode Penelitian Metode yang digunakan pada penelitian ini diawali dengan koleksi 30
sampel dan penyaringan indikator spesies dari beberapa tanaman dan
dilakukan inokulasi serta pemeliharaan tanaman pada rumah kaca.
Selanjutnya dilakukan tes virus dengan metode DAS-ELISA.
Kemudian dilakukan preparasi celup daun dan pewarnaan untuk
dideteksi menggunakan mikroskop electron transmisi (TEM). Lalu
dilakukan 454-sequencing. Sampel daun yang digunakan, dikumpul
kan dan diekstrak dengan menggunakan metode RNA total. Secara
singkat, daun digiling pada nitrogen cair, buffer CTAB dan diektrak
kloroform. RNA dari ektraksi kemudian diendapkan dengan 4m LiCi
dan melewati ekstraksi kolom QIAGEN RNAase dengan perlakuan
DNase pada kolomnya. Pada sampel juga dilakukan ekstraksi STE
yang mengandung 16% etanol. Setelah itu, untaian RNA dielusi
dengan buffer STE. Hasil cDNA diproduksi dengan ekstrak RNA
menggunakan kit Sistem Sintesis cDNA (Roche). Hasil ini kemudian
diberi nama GS-FLX dan dilabeli MID dari setiap ekstrak RNA.

Selanjutnya dilakukan analisis data hasil sequencing. Urutan data DNA

dirakit dengan perangkat lunak Roche yang menghasilkan urutan yang
belum dirakit dan dibandingkan dengan data lokal dari database NCBI
nr GenBank. Untuk membangun genom virus dari sequens baru,
rakitan referensi terhadap genom paling mirip dipakai untuk
pembanding terhadap de novo. Selanjutnya dilakukan PCR- real time
dengan menggunakan primer ekspress dari genom virus yang
diidentifikasi selama 454-sekuensing.
Hasil  Persentase identitas antara protein dari virus belang klorosis jagung 15
dari isolate penelitian ini dan dari GenBank

Berdasarkan data menunjukkan persentase identitas antara isolat

MCMV baru dan yang sudah ada. Tabel tersebut menunjukkan bahwa
isolate baru adalah MCMV dan lebih dari 96% mirip dengan stain
Yunan dan Cina. Data ini didapatkan dari hasil 454-sequencing dan
analisis hasil yang dilakukan perbandingan dengan data dari GenBank.
Pada data tersebut juga dapat dilihat bahwa SCMV mirip dengan gen
yang sudah ada. Virus ini berasal dari Potyvirus yan mirip dengan gen
mosaic virus yang ditemukan di Cina. Sehingga dapat disimpulkan
bahwa benar, bahwa kedua jenis penyakit belang klorosis pada jagung
yang ditemukan merupakan virus MCMV dan SCMV.
 Gambar urutan pohon tetangga menggunakan 500 ulangan boot strap 15
untuk protein dari berbagai anggota genus Potyvirus

Berdasarkan gambar tersebut menunjukkan perbandingan di persentase

identitas untuk protein P1, NIA-Pro dan CP individu antar isolat
SCMV yang baru. Pada gambar tersebut juga diketahui pada pemeriksa
an MCMV, tidak menunjukkan bukti SNP dari beberapa isolate virus.
Urutan protein diduga lengkap diproduksi untuk P1, Nia-Pro dan CP
dengan nomer aksesi JX286706-8 seperti pada gambar. Dari sekuens
tersebut, menunjukkan bahwa Potyvirus adalah virus baru dari anggota
spesies virus mozaik pada tebu dengan yang paling mirip pada strain
Cina tetapi berbeda dari strain lainnya. Hasil ini didapatkan dari
metode PCR-real time yang dilakukan sehingga menghasilkan basepair
yang digunakan untuk mengurutkan data menggunakan software
Roche. Sehingga dapat disimpulkan bahwa identifikasi dengan NGS
pada Potyvirus ini berhasil menunjukkan bahwa penyebab penyakit
pada jagung ini disebabkan oleh SCMV.
 Hasil uji virus dengan RT-PCR real time pada RNA dari tanaman 15
jagung dan barley
 Berdasarkan tabel tersebut dapat dilihat bahwa MCMV ditemukan di
seluruh sampel jagung Kenya dan pada tanaman yang diinokulasikan
dengan getah jagung dan jelai. SCMV ditemukan pada sembilan dari
11 sampel jagung dari Kenya, namun tidak terdeteksi pada jagung atau
jelai yang diinokulasikan getah. Ternyata, ditemukan bahwa pada
tanaman jagung dan barley memiliki kontrol negative. Hasil ini didapat
dari metode perhitungan dengan ELISA dan analisis data. Sehingga
dapat disimpulkan bahwa tidak semua yang diinokulasikan dengan
virus tersebut dapat berkembang.
Kesimpulan  Penyakit MCMV adalah penyakit baru di Kenya, sedangkan SCMV 10
umum sebelumnya telah terdeteksi di Kenya
 Penelitian ini menunjukkan adanya dua virus yaitu MCMV & SCMV
yang berkombinasi dan menyebabkan jagung letal nekrosis (MLN)
 Penelitian ini menunjukkan keunggulan NGS untuk mengidentifikasi
virus secara cepat
 Teknik NGS memfasilitasi pengembangan diagnostic dengan output
yang tinggi untuk tanaman baru maupun pathogen baru.
 Teknik NGS meminimalisir adanya kegagalan deteksi dibandingkan
dengan menggunakan pengujian konvensional
Total 100