Sel Host & Mikroba
Dalam Terjemahan
Penyakit Menular Mutakhir
Diagnostik dengan CRISPR
Charles Chiu 1 , 2 , *
1 Department of LaboratoryMedicine andMedicine, Division of InfectiousDiseases, University of California, San Francisco, San Francisco, CA
94107, Amerika Serikat
2 Pusat Penemuan dan Diagnostik Viral UCSF-Abbott, San Francisco, CA 91407, AS
* Korespondensi: charles.chiu@ucsf.edu
https://doi.org/10.1016/j.chom.2018.05.016
Tiga baru-baru ini Ilmu artikel ( Chen dkk., 2018; Gootenberg dkk., 2018; Myhrvold dkk., 2018 ) menjelaskan penggunaan teknologi CRISPR-Cas untuk
mengembangkan diagnostik di tempat perawatan yang secara langsung mendeteksi virus dari sampel klinis. Tes ini secara radikal dapat mengubah
pendekatan untuk mendiagnosis penyakit menular di samping tempat tidur dan di lapangan.
SARS / MERS coronavirus, 2009 pandemi H1N1 in flu,
Ebola virus (EBOV), and Zika virus (ZIKV) —setiap
beberapa tahun, virus baru muncul dari pedalaman dan
mengancam akan menghancurkan penduduk. Selama
masing-masing epidemi ini, kami sangat tidak siap
untuk memenuhi kebutuhan mendesak akan tes
diagnostik yang dapat diterapkan di lapangan untuk
memandu upaya pengawasan, pengobatan, dan
biocontainment. Tantangan yang dihadapi oleh dokter
dalam mendiagnosis infeksi secara akurat tidak hanya
meluas ke wabah di lapangan tetapi juga untuk
perawatan pasien rutin di rumah sakit dan klinik
komunitas. Pengujian molekuler individu untuk
sebagian besar patogen biasanya tidak tersedia
kecuali sebagai uji pengiriman ke laboratorium
referensi yang sangat terspesialisasi. Hingga saat ini,
platform diagnostik perawatan di tempat yang cepat,
fleksibel,
Dalam tiga makalah yang diterbitkan di Ilmu
( Chen dkk., 2018; Gootenberg dkk., 2018; Myhrvold
dkk., 2018 ), dua kelompok melaporkan penggunaan
teknologi berbasis CRISPR-Cas untuk pengembangan
tes diagnostik molekuler, dengan fokus pada penyakit
menular. Sistem CRISPR-Cas pada bakteri telah
berevolusi sebagai mekanisme untuk melawan virus
dengan membelah urutan DNA atau RNA dari fag yang
menyerang ( Hille dkk., 2018 ). Teknologi ini, sekarang
digunakan secara luas untuk aplikasi pengeditan gen,
melibatkan keluarga enzim yang mampu secara tepat
membelah DNA beruntai ganda (dsDNA) atau RNA
untai tunggal (ssRNA) pada urutan yang melengkapi
RNA pemandu. Untuk tujuan deteksi, grup di sini
memanfaatkan file
702 Sel Host & Mikroba 23, 13 Juni 2018 ª 2018 Elsevier Inc.
'' aktivitas kolateral '' baik dari enzim Cas13 dalam
membelah ssRNA tanpa pandang bulu ( Gootenberg
dkk., 2018; Myhrvold dkk., 2018 ) atau enzim Cas12a
dalam membelah DNA untai tunggal (ssDNA) ( Chen
dkk., 2018 ). Setelah RNA pemandu diaktifkan oleh
urutan pelengkap, pembelahan probe ssRNA atau
ssDNA berlabel menghasilkan sinyal yang dapat
memberikan pembacaan fluoresen dalam sejumlah
format portabel, termasuk penggunaan strip kertas
sekali pakai ( Gambar 1 ).
CRISPR-Cas13 (SHERLOCK) -
berbasis ( Gootenberg dkk., 2018; Myhrvold dkk., 2018 )
dan berbasis CRISPR-Cas12a (DETECTR) ( Chen dkk.,
2018 ) pengujian yang dijelaskan dalam makalah ini
membawa beberapa keunggulan dibandingkan
diagnostik mikrobiologi tradisional seperti pengujian
pengamplian asam nukleat (misalnya, polymerase
chain reaction [PCR]) atau pengujian berbasis antigen
(misalnya, imunostrip) ( Drancourt dkk., 2016 ). Tes
ampli fi kasi asam nukleat seperti PCR umumnya
dianggap tes paling sensitif dan spesifik yang tersedia.
Namun, pengujian ini biasanya menggabungkan
beberapa langkah untuk menjalankan pengujian,
termasuk langkah ekstraksi asam nukleat di muka, dan
memerlukan instrumentasi khusus. Sebaliknya, kedua
kelompok menunjukkan di sini bahwa tes berbasis
CRISPR-Cas dapat dijalankan langsung pada sampel
klinis primer sebagai reaksi tunggal dan dilakukan
dengan menggunakan peralatan minimal atau tanpa
peralatan. Pengetesan tersebut juga dapat diterima
untuk penggunaan reagen terliofilisasi, yang
mengabaikan kebutuhan untuk pemeliharaan rantai
dingin, dan dengan demikian menarik untuk digunakan
di lapangan. Namun, tes CRISPR-Cas adalah
juga terbukti menunjukkan sensitivitas tinggi dan deteksi
spesifik, mencapai kinerja yang sebanding dengan PCR.
Menariknya, hal ini mungkin disebabkan oleh fakta
bahwa penguat isotermal masih diperlukan sebagai
bagian dari protokol pengujian berbasis CRISPR-Casb
untuk menghasilkan sinyal fluoresen yang dapat
dideteksi. Pada saat yang sama, pengujian ini serupa
dengan pengujian berbasis antigen dalam hal
kemudahan penggunaan dan kecepatan, dengan waktu
penyelesaian sampel-ke-jawaban 1–2 jam.
Dalam makalah oleh Myhrvold et al., Hasil kerja
sama dari dua peneliti terkemuka di Broad Institute
(Feng Zhang dan Pardis Sabeti), penulis
mengilustrasikan beberapa aplikasi untuk uji
SHERLOCK, termasuk (1) ZIKV dan virus dengue
(DENV). ) deteksi langsung dari cairan tubuh seperti air
liur dan urin dalam <2 jam, (2) diskriminasi spesifik di
antara empat serotipe DENV yang berbeda atau
identifikasi strain ZIKV spesifik wilayah dari pandemi
2014-2016, dan (3) deteksi singlenukleotida
polimorfisme seperti mutasi ZIKV baru-baru ini, S139N,
terkait dengan kasus mikrosefali pada bayi yang
terkena ( Yuan dkk., 2017 ). Dua contoh terakhir
memiliki relevansi khusus dengan epidemiologi
kesehatan masyarakat. Namun, kegunaan klinis dari
tes ini juga dapat secara potensial diekstrapolasi untuk
setiap pasien, seperti penentuan genotipe virus
hepatitis C (HCV) tertentu untuk memandu pilihan
terapi antivirus ( Panel Panduan NKT AASLD / IDSA,
2015 ).
Dalam Chen et al. makalah dari laboratorium
Jennifer Doudna di UC Berkeley, penulis menggunakan
uji DETECTR untuk mendeteksi virus papiloma manusia
'' berisiko tinggi ''.
Sel Host & Mikroba

Dalam Terjemahan

pengujian di awal perjalanan epidemi EBOV Afrika

Barat atau ZIKV.
sel tumor parasit bakteri jamur Namun, kecil kemungkinannya bahwa pendekatan
CRISPRCas dengan sendirinya akan sepenuhnya
menyelesaikan tantangan pengujian diagnostik di
tempat-tempat. Pada dasarnya, pengujian ini masih

membangun
merupakan uji deteksi yang ditargetkan menggunakan
panduan primer dan probe tertentu dan dengan demikian tunduk
RNA
pada batasan yang sama. Menerapkan tes untuk
investigasi wabah yang muncul mungkin tidak berguna
darah jika penyebab wabah tidak diketahui. Misalnya,
transmisi dan sirkulasi rahasia ZIKV telah berlangsung
ssDNA di Brasil selama lebih dari setahun sebelum identifikasi
• diagnosis
ditargetkan menyelidiki
penyakit menular
awal pada Mei 2015 ( Faria dkk., 2017 ), sebagian
DNA
karena ZIKV tidak pernah terlihat di Amerika sehingga
• patogen yang muncul
air seni PAM tidak dianggap sebagai kandidat patogen wabah a
pengawasan
CAS12a priori. Selain itu, tingginya spesifitas pembelahan
• genotipe virus CRISPR / Cas, meskipun bernilai untuk diagnostik
yang ditargetkan, dapat menjadi tantangan dengan
• antibiotik atau antivirus
sengau virus RNA seperti ZIKV dan EBOV yang bermutasi
perlawanan
mengepel
dengan cepat. Memang, mutasi pada genom EBOV
• Identifikasi SNP kemungkinan besar mengakibatkan penurunan
ditargetkan
ssRNA
sensitivitas dan kinerja dari deteksi PCRassay yang
• diagnostik pendamping
RNA
menyelidiki (+ pengobatan) ada

CAS13 • skrining kanker

bangku

strain Makona yang menyebabkan wabah EBOV 2014

di Afrika Barat ( Sozhamannan dkk., 2015 ).

Gambar 1. Skema Pengujian Diagnostik Molekuler Cepat Menggunakan Teknologi Berbasis CRISPR-Cas Bidang diagnosis penyakit menular juga dengan
cepat bergerak ke arah multiplexing berbasis sindrom
Molekul RNA pemandu dibangun untuk menargetkan patogen spesifik atau sel tumor (untuk skrining kanker). Setelah pengumpulan sampel klinis di
tempat perawatan, seperti di samping tempat tidur pasien, kantor medis, bangsal rumah sakit, atau di lapangan, pengujian berbasis CAS12- atau klinis
CAS13 dapat dilakukan langsung dari sampel dalam waktu kurang dari 2 jam. , tanpa perlu langkah ekstraksi DNA atau RNA terpisah. Perhatikan untuk deteksi, seperti penggunaan panel yang
bahwa protein Cas12a menargetkan dsDNA, sedangkan Cas13 menargetkan RNA. Setelah aktivasi protein Cas12a atau Cas13, pembelahan
ditargetkan untuk mendiagnosis infeksi neurologis,
sembarangan dari probe ssDNA fluoresen untuk probe Cas12a atau ssRNA untuk Cas13 menghasilkan sinyal yang dapat dideteksi. Ada banyak
aplikasi potensial untuk pengujian berbasis CRISPR-Cas, seperti yang tercantum di sebelah kanan dan dijelaskan dalam teks. pernapasan, dan gastrointestinal ( Ramanan dkk., 2017 ).
Metode yang sangat multipleks atau bahkan
sepenuhnya tidak bertarget (mis., Pengurutan generasi
berikutnya metagenomik) ( Schlaberg dkk., 2017;
tipe 16 dan 18, terkait dengan tumor genital invasif, secara bersamaan membuat genotipe dan mengedit file Somasekar dkk., 2017 ) mungkin lebih baik untuk
dengan akurasi keseluruhan 96%. Demonstrasi yang APC gen dari garis sel ginjal embrionik manusia diagnosis penyakit demam akut yang tidak diketahui
berhasil ini memperluas aplikasi potensial teknologi (HEK293) yang mengandung sisipan. yang mungkin disebabkan oleh berbagai patogen
CRISPR-Cas dari penyakit menular ke bidang lain. berbeda. Misalnya, sebagian besar pasien selama
Deteksi cepat polimorfisme nukleotida tunggal dari sel Jadi, apakah teknologi ini siap untuk prime time? wabah EBOV Afrika Barat 2014 mengalami infeksi lain,
tumor yang bersirkulasi dalam darah, misalnya, dapat Sekilas, CRISPR-Casbased assay tampaknya memiliki seperti demam Lassa atau malaria, atau koinfeksi.
mengantarkan era baru diagnostik di tempat perawatan semua karakteristik yang diinginkan dalam diagnostik Sebagai catatan, metode diagnostik ini dapat saling
untuk kanker dini. Pengujian berbasis CRISPR-Cas titik perawatan: (1) implementasi sebagai reaksi melengkapi. Tes berbasis CRISPR-Cas dapat
juga dapat dimanfaatkan untuk digunakan sebagai tunggal; (2) kesesuaian dengan reagen liofilisasi; (3) digunakan untuk skrining awal resistensi antibiotik,
diagnostik dan pengobatan pendamping. Misalnya, waktu penyelesaian di bawah 2 jam; (3) fleksibilitas misalnya, dengan sekuensing refleks untuk
grup Broad Institute menjelaskan perbaikan mutasi di desain, dengan menghasilkan pengujian baru dari awal mengkarakterisasi gen spesifik dan mekanisme yang
dalam waktu kurang dari seminggu; (4) mudah dibawa terlibat.
tanpa perlu listrik atau instrumentasi yang mahal; (5)
deteksi langsung dari sampel klinis; dan (6)
pembacaan fluorescent kolorimetri. Tes semacam itu
APC gen yang telah dikaitkan dengan poliposis akan sangat membantu, misalnya, jika diterapkan
adenomatosa familial, kondisi bawaan yang sangat dengan cepat dan tersedia untuk diagnosis Tantangan lain yang dapat diperkirakan untuk
meningkatkan risiko kanker kolon dan rektal pada implementasi rutin CRISPR-Cas-basedas-
individu yang terkena. Menggunakan SHERLOCK, termasuk masalah kinerja, biaya, dan peraturan. Sejak
mereka penguat target

Sel Host & Mikroba 23, 13 Juni 2018 703


langkah masih dimasukkan sebagai bagian dari
pengujian, masih ada kemungkinan kontaminasi silang
dan / atau kontamina-
dari laboratorium, reagen, atau lingkungan. Selain itu,
kinerja dan akurasi '' kehidupan nyata '' dari pengujian
diagnostik berbasis CRISPRCas belum diketahui,
terutama di luar batasan lingkungan laboratorium yang
terkontrol. Juga masih harus dilihat apakah tes
berbasis CRISPR-Cas dapat distandarisasi untuk
pengujian diagnostik throughput tinggi dan bagaimana
pengujian tersebut akan dilihat oleh badan pengatur
seperti Badan Pengawas Obat dan Makanan AS.
Mungkin ada masalah terkait ketersediaan dan biaya
pengujian berbasis CRISPR-Cas di negara
berkembang, terutama mengingat banyak kasus
penggunaan yang dimaksudkan untuk teknologi
tersebut telah dipatenkan. Akhirnya, pertimbangan
utama adalah seberapa setuju pendekatan ini untuk
multiplexing. Dalam makalah saat ini, multiplexing
hanya satu atau beberapa target secara paralel telah
didemonstrasikan, dan tidak diketahui apakah ada
batas atas jumlah target yang dapat berhasil
dimasukkan dalam pengujian. Namun demikian,
terlepas dari kekhawatiran ini, teknologi berbasis
CRISPR-Cas-
ogy sekarang telah memberi kita hal baru yang kuat
704 Sel Host & Mikroba 23, 13 Juni 2018
Dalam Terjemahan
alat dalam perjuangan terus-menerus kami melawan penyakit
menular.
REFERENSI
AASLD / IDSA HCV Guidance Panel (2015). Panduan Hepatitis C:
Rekomendasi AASLD-IDSA untuk menguji, mengelola, dan merawat
orang dewasa yang terinfeksi virus hepatitis C. Hepatologi 62, 932–954 .
Chen, JS, Ma, E., Harrington, LB, Da Costa, M., Tian, X., Palefsky, JM,
dan Doudna, JA (2018). CRISPR-Cas12a target binding melepaskan
aktivitas DNase untai tunggal tanpa pandang bulu. Ilmu
360, 436–439 .
Drancourt, M., Michel-Lepage, A., Boyer, S., dan Raoult, D. (2016).
Laboratorium tempat perawatan dalam mikrobiologi klinis. Clin. Mikrobiol.
Putaran. 29,
429–447 .
Faria, NR, Quick, J., Claro, IM, Thézé, J., de Jesus, JG, Giovanetti, M.,
Kraemer, MUG, Hill,
SC, Black, A., da Costa, AC, dkk. (2017). Pembentukan dan penularan
samar virus Zika di Brasil dan Amerika. Alam 546, 406–410 .
Gootenberg, JS, Abudayyeh, OO, Kellner, MJ, Joung, J., Collins, JJ, dan
Zhang, F. (2018). Platform deteksi asam nukleat multipleks dan portabel
dengan Cas13, Cas12a, dan Csm6. Ilmu
360, 439–444 .
Hille, F., Richter, H., Wong, SP, Bratovic, M., Ressel, S., dan
Charpentier, E. (2018). Biologi CRISPR-Cas: maju dan mundur. Sel 172,
1239–1259 .
Myhrvold, C., Freije, CA, Gootenberg, JS, Abudayyeh, OO, Metsky, HC,
Durbin, AF, Kellner,
Sel Host & Mikroba
MJ, Tan, AL, Paul, LM, Parham, LA, dkk. (2018). Diagnostik viral yang
dapat diterapkan di lapangan menggunakan CRISPR-Cas13. Ilmu 360, 444–448
.
Ramanan, P., Bryson, AL, Binnicker, MJ, Pritt,
BS, dan Patel, R. (2017). Pengujian berbasis panel sindromik dalam
mikrobiologi klinis. Clin. Mikrobiol. Putaran. 31, e00024-17 .
Schlaberg, R., Chiu, CY, Miller, S., Procop, GW, dan Weinstock, G .;
Komite Praktik Profesional dan Komite Praktik Laboratorium dari
American Society for Microbiology; Komite Sumber Daya Mikrobiologi
dari College of American Pathologists (2017). Validasi tes sekuensing
generasi mendatang metagenomik untuk deteksi patogen universal.
Lengkungan. Pathol. Laboratorium. Med. 141,
776–786 .
Somasekar, S., Lee, D., Rule, J., Naccache, SN, Stone, M., Busch, MP,
Sanders, C., Lee, WM, dan Chiu, CY (2017). Surveilans virus dalam
sampel serum dari pasien dengan gagal hati akut dengan urutan
metagenomik generasi berikutnya. Clin. Menulari. Dis. 65, 1477–1485 .
Sozhamannan, S., Holland, MY, Hall, AT, Negrón, DA, Ivancich, M.,
Koehler, JW, Minogue,
TD, Campbell, CE, Berger, WJ, Christopher,
GW, dkk. (2015). Evaluasi erosi tanda tangan pada virus Ebola akibat
penyimpangan genom dan dampaknya terhadap kinerja tes diagnostik.
Virus
7, 3130–3154 .
Yuan, L., Huang, XY, Liu, ZY, Zhang, F., Zhu,
XL, Yu, JY, Ji, X., Xu, YP, Li, G., Li, C., dkk. (2017). Mutasi tunggal pada
protein prM virus Zika berkontribusi pada mikrosefali janin. Ilmu 358, 933–936
.