Machine Translated by Google

Lihat diskusi, statistik, dan profil penulis untuk publikasi ini di: https://www.researchgate.net/publication/11388410

Model Penilaian Risiko dan Manajemen Kontaminasi: Implikasi untuk

PCR DNA Ribosom Jangka Luas sebagai Alat Diagnostik di Bidang Medis
Bakteriologi
Artikel dalam Journal of Clinical Microbiology · Juni 2002
DOI: 10.1128/JCM.40.5.1575-1580.2002 · Sumber: PubMed

KUTIPAN BACA

236 10.692

3 pengarang, antara lain:

Cherie Millar Jiru Xu

Kepercayaan Kesehatan dan Perawatan Sosial Belfast Universitas Xi'an Jiaotong

562 PUBLIKASI 7.494 CITASI 150 PUBLIKASI 4.368 CITASI

LIHAT PROFIL LIHAT PROFIL

Beberapa penulis publikasi ini juga mengerjakan proyek terkait berikut:

Acinetobacter baumannii View project yang kebal obat antibiotik

Semua konten yang mengikuti halaman ini diunggah oleh Jiru Xu pada tanggal 22 Mei 2014.

Pengguna telah meminta peningkatan file yang diunduh.

Machine Translated by Google
JURNAL MIKROBIOLOGI KLINIS , Mei 2002, hal. 1575–1580
0095-1137/02/$04.000 DOI: 10.1128/JCM.40.5.1575–1580.2002
Hak Cipta © 2002, American Society for Microbiology. Seluruh hak cipta.
TINJAUAN MINI
Model Penilaian Risiko dan Pengelolaan Kontaminasi:
Implikasi untuk Broad-Range Ribosomal DNA PCR sebagai Diagnostik
Alat dalam Bakteriologi Medis
B. Cherie Millar, Jiru Xu, dan John E. Moore* Laboratorium
Kesehatan Masyarakat Irlandia Utara, Departemen Bakteriologi, Rumah Sakit Kota
Belfast, Belfast BT9 7AD, Irlandia Utara, Inggris Raya
Metode molekuler kini telah ditetapkan sebagai ac
metode yang diterima untuk mendeteksi agen penyebab infeksi (virus,
bakteri, jamur, dan protozoa). Secara khusus, penggunaan kombinasi
gen rRNA dari bakteri, jamur, dan protozoa, yaitu target universal
atau jangkauan luas, telah menjadi populer untuk deteksi. Namun,
pemeriksaan laboratorium spesimen klinis untuk PCR universal
berbeda secara signifikan dari PCR spesifik dalam banyak masalah,
terutama terkait dengan kontaminasi dengan DNA, ditemui. Oleh
karena itu, tinjauan ini bertujuan untuk memberikan panduan praktis
untuk membantu petugas laboratorium mengatasi masalah yang
terkait dengan penggunaan PCR DNA ribosom dalam jangkauan luas
dalam mendeteksi agen bakteri, khususnya pada infeksi kultur negatif.
Dasar tradisional untuk identifikasi organisme patogen dan
komensal adalah isolasi atau perbanyakannya di laboratorium. Tes
biokimia, morfologi, dan serologi biasanya memerlukan pertumbuhan
organisme. Ketergantungan pada parameter ini mungkin memiliki
kesadaran yang sangat terbatas tentang keanekaragaman bakteri
yang sebenarnya dan tidak praktis dalam banyak situasi. Penggunaan
sekuens 16S rRNA yang berkembang pesat untuk studi filogenetik,
evolusioner, dan diagnostik menawarkan peluang untuk pendekatan
alternatif (3). Gen 16S rRNA ditemukan di semua bakteri dan
mengakumulasi mutasi dengan kecepatan konstan yang lambat;
karenanya, gen ini dapat digunakan sebagai jam molekuler (18).
Bagian yang sangat bervariasi dari urutan 16S rRNA berisi tanda
tangan yang unik untuk setiap bakteri, serta informasi yang berguna
tentang hubungan antara bakteri yang berbeda. Alternatifnya, karena
molekul 16S rRNA memiliki kendala struktural yang krusial, wilayah
urutan tertentu yang dilestarikan ditemukan di semua bakteri yang
dikenal, termasuk eubakteria. Primer PCR jangkauan luas kemudian
dapat dirancang untuk mengenali urutan gen 16S rRNA bakteri yang
dikonservasi ini dan digunakan untuk memperkuat daerah intervensi,
variabel, atau diagnostik (15, 17). Broad-range ribosomal DNA (rDNA)
PCR menghindari kebutuhan untuk menumbuhkan bakteri dan tidak
memerlukan informasi filogenetik yang sudah ada sebelumnya.
Perpanjangan prosedur ini untuk mempelajari jaringan mam malian
yang terinfeksi lebih lanjut menghindari kebutuhan untuk memurnikan
bakteri dan telah mengarah pada identifikasi yang sebelumnya tidak dikarakterisasi.
* Penulis yang sesuai. Alamat surat: Laboratorium Kesehatan Masyarakat
Irlandia Utara, Departemen Bakteriologi, Rumah Sakit Kota Belfast, Belfast, BT9
7AD, Irlandia Utara, Inggris Raya. Telepon: 44 (28)
9026 3554. Faks: 44 (28) 2589 2887. Email: jemoore@niphl.dnet.co.uk.
1575
Penerbangan. 40, Tidak. 5
patogen pada angiomatosis bakterial (12) dan pada penyakit Whipple
(3, 4).
Pada bakteri, ada tiga gen yang membentuk fungsi rRNA: gen 5S,
16S, dan 23S rRNA. Gen 16S rRNA secara historis paling sering
digunakan; Namun, baru-baru ini, penggunaan 16-23S rRNA di
wilayah spacer tergenik, bersama dengan gen 23S rRNA, telah
menjadi populer.
Penggunaan teknik berbasis rRNA telah mendapatkan popularitas
yang meningkat sebagai alat deteksi beragam target bakteri dari
beberapa jenis spesimen klinis yang berbeda. Sejak pengembangan
PCR dalam ilmu kehidupan pada akhir 1980-an, telah terjadi
pergeseran bertahap dari teknik fungsional ke teknik molekuler untuk
identifikasi organisme, dan ini telah tercermin secara pro rata dalam
literatur (6, 7, 8 , 13, 14). Sebagai contoh, total kumulatif makalah
yang diterbitkan dalam bidang ini pada tahun 1999 lebih besar dari
keluaran gabungan untuk periode dari tahun 1990 sampai 1994.
Namun, rDNA PCR yang luas melibatkan banyak kepraktisan dan
kerumitan, masalah yang telah menjadi masalah konstan. untuk
laboratorium yang terlibat dalam penggunaan teknik ini untuk
membantu mendeteksi bakteri dari spesimen klinis. Oleh karena itu,
tinjauan ini bertujuan untuk memeriksa masalah praktis yang terkait
dengan PCR rDNA jangkauan luas serta menawarkan berbagai saran
untuk membantu produksi data berkualitas.
KONTAMINASI DAN PENGHINDARANNYA
Masalah praktis utama yang terkait dengan penggunaan PCR
rDNA rentang luas adalah kontaminasi pengujian oleh DNA bakteri
eksogen. Konsep menggunakan primer oligonukleotida yang sangat
terkonservasi untuk berbagai gen dalam struktur rRNA mengeksploitasi
filogeni antara eubakteria. Namun, penggunaan primer semacam itu
dapat menimbulkan masalah karena koamplifikasi DNA yang
mencemari sedikit atau tidak ada signifikansi klinis bersama dengan
patogen bakteri. Komplikasi laboratorium ini telah menyebabkan
sejumlah laboratorium diagnostik mengabaikan gagasan untuk
mengadopsi teknik PCR rDNA rentang luas sebagai bagian dari
layanan diagnostik mereka. Selain itu, kontaminasi telah menimbulkan
banyak hasil positif palsu yang tidak bermanfaat bagi pasien dan
memang dapat menyebabkan komplikasi tambahan dalam interpretasi
klinis hasil molekuler. Kontrol hati-hati dari
Machine Translated by Google

1576 TINJAUAN MINI J.CLIN . MIKROBIOL.

TABEL 1. Kategorisasi penilaian risiko kontaminasi DNA yang mengorbankan penggunaan rDNA PCR jangkauan luas sebagai alat diagnostik dalam mendeteksi agen
penyebab bakteri penyakit menular

Kategori Risiko Bahaya Contoh kontaminasi Tindakan perbaikan

A High High Employment botol koleksi darah yang tersedia secara komersial yang Produksi laboratorium botol pengumpul darah bebas DNA yang
mengandung EDTA mengandung EDTA dengan menggunakan air dan bahan kimia
tingkat molekuler
B Tinggi Rendah Penyalahgunaan pipet, menyebabkan kontaminasi laras pipet Peduli dengan pemipetan dan penggunaan ujung pipet yang terpasang

C Rendah Tinggi Akuisisi spesimen klinis dari pasien Pendidikan dan pelatihan staf bangsal untuk menghindari pengumpulan
flora kulit komensal dari pasien
D Rendah Rendah Penggunaan reagen PCR tingkat molekuler, misalnya Taq polimerase, Penggunaan polimerase Taq yang disaring sebelumnya untuk memastikan
terkontaminasi dengan DNA bakteri status bebas DNA

kontaminasi dari sumber apapun adalah kunci keberhasilan dari prosedur normal memerlukan evaluasi ulang proses dalam
penerapan teknik ini dalam layanan mikrobiologi. hal bahaya dan/atau risiko tambahan dan tindakan pengendalian
yang sesuai ditetapkan untuk mengkompensasi bahaya dan/atau
EVALUASI BAHAYA KONTAMINASI risiko tambahan ini. Karena setiap laboratorium memiliki praktik
MELALUI MODEL PENILAIAN RISIKO kerja dan lingkungannya sendiri yang unik, tidak ada strategi
tunggal untuk analisis bahaya dan koreksi titik kontrol kritis yang
Penggunaan PCR rDNA rentang luas selalu dikaitkan dengan sesuai untuk diadopsi oleh semua laboratorium kerja, dan oleh
risiko amplifikasi DNA kontaminasi yang tidak memiliki signifikansi karena itu semua laboratorium harus melakukan penilaian risiko
klinis. Karena risiko ini tidak dapat dihindari dalam kondisi mereka sendiri dan mengadopsi strategi kontrol yang tepat.
laboratorium normal, upaya harus dilakukan untuk membantu sepadan dengan tingkat bahaya yang dihitung. Hanya ketika
menghitung bahaya dan risiko yang dihadapi selama prosedur semua bahaya dan risiko teridentifikasi, tindakan pengendalian
diagnosis lengkap. Langkah paling penting dalam membangun yang tepat dapat diadopsi (i) untuk mengurangi bahaya dan/atau
protokol untuk PCR rDNA jangkauan luas adalah melakukan risiko atau (ii) untuk menghilangkan bahaya dan/atau risiko.
penilaian risiko untuk memeriksa cara mengurangi atau Mekanisme yang tersedia untuk mencapai yang pertama atau
menghilangkan kontaminasi. Dalam hal ini, bahaya kontaminasi yang terakhir dibahas secara rinci di bawah ini.
dapat didefinisikan sebagai masuknya DNA yang mengkontaminasi Spesimen klinis. (i) Jenis spesimen. Amplifikasi PCR rDNA
dari berbagai sumber, misalnya dari pasien atau selama manipulasi jangkauan luas dapat dilakukan hanya pada spesimen klinis yang
laboratorium tahap akhir. Ada dua jenis bahaya, yang dapat biasanya dianggap steril, misalnya darah, cairan sere brospinal
diklasifikasikan sebagai tinggi dan rendah. Bahaya tinggi dapat (CSF), cairan pleura, atau bahan biopsi steril.
didefinisikan sebagai sejumlah besar DNA yang mencemari yang Penggunaan teknik ini dengan spesimen dari tempat yang tidak
memasuki uji diagnostik, sedangkan bahaya rendah dapat steril, misalnya feses, kulit, sputum, atau bahan biopsi yang tidak
didefinisikan sebagai sejumlah kecil DNA yang memasuki uji steril, harus dihindari karena keanekaragaman flora komensal di
diagnostik. Risiko dapat didefinisikan sebagai kemungkinan tempat ini akan mempersulit analisis PCR.
Amplifikasi DNA dari situs tersebut akan menghasilkan banyak
terjadinya bahaya. Parameter ini dapat dikualifikasikan lebih lanjut
dengan menetapkan kategori kontaminasi untuk setiap manipulasi amplikon PCR untuk setiap taksa yang ada dalam spesimen klinis,
yang diberikan (Tabel 1). Mengingat empat kategori, kategori A sehingga memerlukan pemisahan amplikon tersebut dengan
hingga D, dengan penurunan tingkat risiko terkait, semua prosedur lebih lanjut, seperti kloning, sebelum mengurutkan anal
manipulasi dalam kategori A sebagian besar akan mengakibatkan ysis. Untuk spesimen dari tempat yang tidak steril, akan lebih tepat
masuknya DNA yang terkontaminasi ke dalam proses, sedangkan untuk menggunakan pendekatan molekuler yang lebih terarah
prosedur dalam kategori D pada umumnya tidak akan menghasilkan dengan menggunakan tes PCR yang spesifik untuk target gen
masuknya mencemari DNA, meskipun masih ada kemungkinan tertentu, yang unik untuk organisme tertentu, misalnya lokus recA
untuk deteksi Burkholderia . cepacia pada pasien dengan cystic
kecil hal ini terjadi. Tujuan dari melakukan penilaian risiko adalah
untuk secara hati-hati mempertimbangkan semua bahaya dan fibrosis (10). (ii) Pengumpulan spesimen. Seperti uji
risiko yang terkait dengan penggunaan diagnostik molekuler konvensional, uji molekuler mengharuskan tindakan pencegahan
secara empiris dalam kondisi yang diperiksa sehingga risiko dapat aseptik dilakukan dalam pengumpulan spesimen klinis. Namun,
dikurangi sebanyak mungkin. Selain itu, penilaian risiko harus karena peningkatan sensitivitas uji molekuler dibandingkan dengan
dilakukan oleh sekelompok pekerja yang mewakili semua staf uji kultur, pengetatan tambahan harus dilakukan dalam
yang berpotensi berinteraksi dengan (i) proses diagnostik (yaitu, pengumpulan spesimen untuk setiap pemeriksaan molekuler hilir,
staf bangsal dan personel laboratorium) dan (ii) lingkungan misalnya, dalam pengumpulan darah vena, tempat tusukan harus
diagnostik (yaitu, laboratorium). personel yang tidak terlibat dicuci terlebih dahulu dengan yodium. Semua personel yang
langsung dengan pemrosesan spesimen, porter, dan staf pemeliharaanterlibat dalam pengumpulan spesimen klinis, termasuk staf medis
dan pembersihan).
Langkah pertama dari setiap penilaian risiko tersebut harus dan perawat, serta ahli flebotomi, harus dididik sehubungan
mendefinisikan prosedur diagnostik melalui diagram alur yang dengan tindakan pencegahan tambahan yang diperlukan untuk menghindari ko
sesuai (contohnya ditunjukkan pada Gambar. 1). Protokol untuk Perhatian harus dilakukan dengan semua peralatan dan
penanganan dan pemrosesan berbagai jenis spesimen instrumen yang berpotensi bersentuhan dengan spesimen klinis
yang diperiksa oleh PCR, karena instrumen ini, meskipun
membutuhkan pembuatan diagram alir terstruktur. Setiap penyimpangan
Machine Translated by Google

VOL. 40, 2002 TINJAUAN MINI 1577

Machine Translated by Google
1578 TINJAUAN MINI
dianggap steril, dapat mengandung DNA dari sel mati yang telah
mati dalam proses sterilisasi. Baru-baru ini Keay et al. (5)
mendemonstrasikan bahwa cold-cup biopsy steril untuk ceps
merupakan sumber kontaminasi DNA Escherichia, Propionobacterium,
Stenotro phomonas, dan Pseudomonas dan oleh karena itu tidak
tepat menggunakan PCR untuk mencari keberadaan bakteri patogen
dalam spesimen jaringan yang memiliki telah diperoleh dengan
instrumen ini.
Bahan klinis yang cukup harus diambil untuk memungkinkan
kultur dan analisis molekuler, dan jika memungkinkan, dua spesimen
harus diambil secara bersamaan. Dalam kasus di mana bahan
klinis terbatas dapat dikumpulkan (misalnya, spesimen CSF atau
jaringan katup jantung), analisis pada awalnya harus bersifat
molekuler untuk menghindari potensi kontaminasi yang mungkin
timbul dari penggunaan peralatan plastik nonsteril selama analisis
konvensional, misalnya penggunaan pipet nonsteril. tips dalam
penentuan konsentrasi glukosa dan protein serta jumlah sel darah
putih pada spesimen CSF dari pasien meningitis.
Botol pengumpul spesimen merupakan sumber kontaminasi
DNA. DNA tersebut dapat dikaitkan dengan plastik dan lingkungan
fisiologis transportasi. Studi sebelumnya telah menunjukkan adanya
DNA dari pseudomonad lingkungan nonviable dalam botol koleksi
darah standar yang mengandung EDTA yang digunakan di bangsal
rumah sakit. Oleh karena itu, perlu untuk menghilangkan sumber
kontaminasi potensial ini melalui adopsi persiapan botol koleksi
darah steril yang diobati dengan EDTA bebas DNA untuk tujuan
sampel klinis yang memerlukan analisis molekuler luas. Untuk
membantu meminimalkan kontaminasi tersebut, disarankan untuk
menggunakan peralatan plastik kultur jaringan perawan berkualitas
tinggi, bersama dengan EDTA dan air yang bebas DNA. Semua
bets yang disiapkan harus disaring untuk keberadaan DNA yang
terkontaminasi sebelum didistribusikan ke bangsal.
Sumber lain dari kontaminasi DNA bakteri adalah bahan biakan
darah yang tersedia secara komersial untuk digunakan dengan
instrumen biakan darah otomatis yang terus memantau, misalnya
sistem BacTec dan BacT/Alert. Bahan biakan darah semacam itu
dianggap steril; yaitu, tidak mengandung kultur atau ganisme.
Berbagai penelitian telah menunjukkan adanya kontaminasi DNA
dalam bahan kultur darah dari pemasok yang berbeda. Asal DNA
bakteri ini bergantung pada pemasok dan nomor batch (lot).
Beberapa sumber DNA bakteri telah diidentifikasi dengan analisis
urutan molekul dan termasuk DNA dari Lactococcus lactis dan
Bacillus coagulans (9), serta Streptococcus sp. (2).
Organisasi lingkungan kerja. Salah satu persyaratan mendasar
dari PCR rDNA rentang luas adalah pemisahan area kerja
laboratorium untuk menghindari amplifikasi DNA kontaminasi
artifaktual. Minimal, area di mana manipulasi sebelum dan sesudah
PCR dilakukan harus dipisahkan secara fisik. Manipulasi pra-PCR
mencakup semua prosedur sebelum siklus termal, dan akibatnya,
manipulasi pasca-PCR mencakup semua tahapan hilir dan termasuk
siklus termal (Gbr. 2). Namun, pengaturan fisik yang ideal akan
memungkinkan dua ruang pra-PCR yang terpisah, dengan satu
ruangan didedikasikan untuk penerimaan spesimen klinis dan
ekstraksi DNA genom dan ruang kedua digolongkan sebagai ruang
bersih, tempat campuran master PCR disiapkan. Ara.
2). Dalam setiap ruangan, manipulasi sehubungan dengan analisis
PCR jangkauan luas dan spesifik harus dipisahkan secara fisik
J.CLIN . MIKROBIOL.
terjaga keamanannya. Segregasi tersebut dapat diimplementasikan
pada dua tingkat: (i) segregasi infrastruktur dan (ii) penahanan
lokal. Pemisahan infrastruktur melibatkan pemisahan fisik melalui
dinding partisi atau dinding padat. Selain itu, fasilitas terpisah harus
ditempatkan secara geografis di area dengan lalu lintas manusia
yang minimal.
Penahanan lokal melibatkan penggunaan lemari pengaman
biologis untuk disinfeksi spesimen awal dan ekstraksi DNA. Kabinet
semacam itu tidak boleh digunakan untuk penyiapan PCR, karena
prosedur ini harus dilakukan terpisah dari desinfeksi dan ekstraksi
yang disebutkan di atas untuk meminimalkan kontaminasi.
Inovasi baru-baru ini dengan produsen peralatan laboratorium
adalah kabinet penyetelan PCR, atau yang disebut kotak udara mati.
Kabinet ini telah dirancang secara eksklusif untuk tujuan penyetelan
PCR dan tidak boleh digunakan bersama untuk manipulasi ekstraksi
DNA. Kabinet semacam itu bervariasi dalam kompleksitas
spesifikasinya dari kotak udara mati sederhana hingga yang memiliki
sirkulasi udara berfilter HEPA (setara dengan aliran udara dalam
kabinet keamanan biologis kelas II, misalnya, kabinet PCR Omni
(Microflow Ltd. Weston-super-mare). , United Kingdom), serta
fasilitas lampu UV untuk dekontaminasi internal area kerja, udara,
tong pipet, dan campuran master PCR. Kabinet ekstraksi dan PCR
pada dasarnya harus meminimalkan peluang kontaminasi spesimen.
Untuk perlindungan spesimen, kelas II lemari pengaman, di mana
udara yang disaring disirkulasikan kembali di dalam lemari melalui
filter HEPA, harus digunakan, berbeda dengan lemari pengaman
kelas I, di mana udara ambien ditarik ke dalam lemari untuk
memaksimalkan keselamatan staf.
Namun, penggunaan jenis kabinet sebelumnya dapat menimbulkan
masalah kesehatan dan keselamatan tertentu, misalnya, selama
ekstraksi DNA dari darah atau bahan biopsi yang mengandung
Myco bacterium tuberculosis. Direkomendasikan bahwa lemari
penyiapan kelas II dan PCR masing-masing dilengkapi dengan
lampu UV untuk mendegradasi DNA eksogen apa pun sebelum amplifikasi PCR.
Baru-baru ini, kami telah mencatat pentingnya menjaga efisiensi
kerja lemari tersebut, karena dapat menjadi sumber kontaminasi
jika filter HEPA tidak diservis secara teratur. Selanjutnya, efisiensi
produksi sinar UV harus dipantau secara teratur.
Risiko dari petugas laboratorium. Bahaya yang terkait dengan
petugas laboratorium dapat berasal dari kontaminasi spesimen oleh
staf yang berdedikasi pada manipulasi diagnostik molekuler, di
mana kontaminan kulit yang umum, termasuk stafilokokus koagulase-
negatif, dapat masuk. Untuk mengurangi risiko terjadinya jenis
kontaminasi ini, staf harus mengenakan sarung tangan karet atau
lateks steril serta jas putih terpisah, yang masing-masing
didedikasikan untuk ekstraksi DNA jarak jauh, penyiapan master
mix, dan manipulasi pasca-PCR.
Reagen dan peralatan plastik habis pakai. Kontaminasi dapat
memasuki protokol diagnostik jangkauan luas dengan penambahan
setiap reagen (6) selama prosedur ekstraksi dan amplifikasi DNA.
Secara khusus, kami telah mencatat empat area masalah untuk
kontaminasi DNA bakteri, sebagai berikut: (i) enzim litik yang
digunakan untuk ekstraksi DNA dari ragi dan bakteri, (ii) primer
oligonukleotida, (iii) Taq polimerase (11), dan (iv) air. Sebagian
besar produsen reagen yang dapat dikonsumsi tidak menjamin
produk mereka bebas DNA, meskipun sebagian besar akan
memberikan jaminan bahwa reagen tersebut steril (yaitu, tidak
mengandung organisme yang dapat hidup) dan bahkan bebas
DNase (untuk sebagian besar reagen molekuler). Akibatnya, reagen ini dapat me
Machine Translated by Google

VOL. 40, 2002 TINJAUAN MINI 1579

ARA. 2. Usulan tata letak ruang laboratorium yang terkait dengan PCR 16S rDNA jangkauan luas untuk deteksi bakteri agen penyebab infeksi
penyakit. RFLP, polimorfisme panjang fragmen restriksi; SSCP, polimorfisme konformasi beruntai tunggal.

kontaminasi yang dapat dihilangkan melalui penyaringan isme, misalnya kultur darah yang dibubuhi Escherichia coli. Dalam
sebelumnya dari masing-masing reagen sebelum digunakan kasus di mana spesimen jaringan klinis yang benar-positif mungkin
dalam uji diagnostik. Peralatan plastik yang digunakan selama sulit untuk ditiru, kontrol positif internal, seperti amplifikasi gen
penyaringan awal harus berkualitas tinggi dan tidak boleh -globin setelah ekstraksi DNA, seperti yang dijelaskan
digunakan kembali dalam pengujian molekuler. Untuk tujuan sebelumnya (8), dapat digunakan. Sehubungan dengan kontrol
pemipetan, tiga set pipet khusus harus tersedia masing-masing PCR, kontrol positif harus berupa DNA bakteri yang diekstraksi
untuk ekstraksi DNA, penyiapan master mix, dan manipulasi pasca dari kultur murni. Idealnya, kontrol positif harus mencakup dua
PCR, di mana dua set pipet sebelumnya harus disinari UV komponen, yaitu, (i) spesimen yang menghasilkan sinyal lemah,
setidaknya selama 2 jam setelah digunakan. Selain itu, sangat karena jumlah salinan target yang rendah, dan (ii) spesimen yang
penting bahwa hanya ujung pipet yang disaring yang digunakan selamamenghasilkan
manipulasi ini.sinyal kuat, karena jumlah salinan target yang tinggi.
Menggunakan kontrol ini, terutama kontrol negatif, memudahkan
MANAJEMEN KONTROL untuk mengidentifikasi titik kontaminasi dalam pengujian diagnostik,
misalnya, untuk memverifikasi bahwa prosedur ekstraksi DNA
Keberhasilan penggunaan PCR rDNA rentang luas dalam bebas kontaminasi tetapi kontaminasi mungkin terjadi selama
mendeteksi agen penyebab penyakit menular sangat bergantung penyiapan PCR.
pada kuantitas dan kualitas kontrol yang terkait dengan pengujian. Kontrol positif, terutama yang termasuk dalam prosedur
Perlu dicatat bahwa, untuk setiap pengujian berbasis PCR, ekstraksi DNA, juga penting karena berfungsi untuk mengidentifikasi
sensitivitas harus dievaluasi untuk setiap jenis spesimen, sebelum kemungkinan penghambatan PCR karena agen penghambat
implementasi rutin. Sangat penting bahwa beberapa kontrol negatif dalam spesimen biologis yang berpadu dengan DNA yang
dan positif diatur selama setiap proses diagnostik. Kontrol negatif diekstraksi, misalnya natrium polianetholesulfonat dalam bahan
dan positif harus mencakup (i) kontrol ekstraksi DNA, (ii) kontrol kultur darah (2, 8). Untuk ulasan komprehensif tentang
penyiapan PCR, dan (iii) kontrol amplifikasi PCR. penghambatan PCR sehubungan dengan spesimen biologis, lihat
studi oleh Wilson di referensi 16.
Untuk tujuan ekstraksi DNA, kontrol positif harus menyertakan Baru-baru ini, kemajuan teknologi dalam peralatan yang
spesimen klinis yang dibubuhi organ buatan digunakan untuk PCR telah terjadi, dan proses yang dihasilkan lebih baru
Machine Translated by Google
1580 TINJAUAN MINI
lebih umum diterapkan dalam diagnosis penyakit menular. Meskipun
kemajuan tersebut, termasuk real-time PCR, mungkin telah
meningkatkan sensitivitas dibandingkan dengan PCR konvensional,
ada beberapa masalah dengan menggunakan platform ini bersama
dengan PCR 16S rDNA jangkauan luas. Baru-baru ini Corless et al. (1)
menggambarkan banyak masalah yang terkait dengan penggunaan
sistem Taq man dan PCR 16S rDNA. Para pekerja ini menyimpulkan
bahwa sensitivitas tambahan berarti bahwa kontaminan yang terkait
dalam seluruh pengujian diagnostik, lebih mudah dideteksi, meskipun
tidak memiliki signifikansi klinis, dan bahwa salah satu cara potensial
untuk mengatasi masalah kontaminasi tersebut adalah dengan
menggunakan agen ultraclean reagen dan peralatan plastik.
Sebagai kesimpulan, keberhasilan implementasi PCR rDNA
jangkauan luas yang menargetkan lokus yang sangat terkonservasi
dalam gen 16S rRNA menyajikan sejumlah kompleksitas dan tantangan.
Secara konseptual dan fisik, PCR rDNA rentang luas harus dianggap
sebagai protokol terpisah dalam diagnostik molekuler daripada sebagai
tambahan untuk PCR spesifik. Keberhasilan dapat dicapai melalui
pengelolaan lingkungan kerja dan reagen yang hati-hati, yang dapat
dicapai dengan lebih mudah dengan mengidentifikasi risiko dan bahaya
kontaminasi melalui pendekatan penilaian risiko terstruktur.
UCAPAN TERIMA KASIH
BCM, XJ, dan JEM didukung oleh Primary Immunodeficiency Association,
Action Cancer, Cancer Research Campaign, dan Departemen Kesehatan dan
Layanan Sosial (Belfast, Irlandia Utara).
REFERENSI
1. Corless, CE, M. Guiver, R. Borrow, V. Edwards-Jones, EB Kaczmarski, dan AJ
Fox. 2000. Masalah kontaminasi dan sensitivitas dengan PCR 16S rRNA universal
waktu-nyata. J.Clin. Mikrobiol. 38:1747–1752.
2. Fredricks, DN, dan DA Relman. 1998. Peningkatan amplifikasi DNA mikroba dari
kultur darah dengan menghilangkan penghambat PCR sodium polyanetholesulfonate.
J.Clin. Mikrobiol. 36:2810–2816.
Lihat statistik publikasi
J.CLIN . MIKROBIOL.
3. Fredricks, DN, dan DA Relman. 1999. Penerapan reaksi berantai polimerase untuk
diagnosis penyakit menular. Klinik. Menulari. Dis. 29:475–486.
4. Gao, SJ, dan PS Moore. 1996. Pendekatan molekuler untuk mengidentifikasi agen
infeksius yang tidak dapat dibiakkan. Muncul. Menulari. Dis. 2:159–167.
5. Keay, S., CO Zhang, BR Baldwin, RB Alexander, dan JW Warren.
1998. Amplifikasi reaksi berantai polimerase gen 16S rRNA bakteri dari tang biopsi
cawan dingin. J.Urol. 160:2229–2231.
6. Kotilainen, P., J. Jalava, O. Meurman, OP Lehtonen, E. Rintala, OP
Seppälä, E. Eerola, dan S. Nikkari. 1998. Diagnosis ingitis pria meningokokus
dengan PCR bakteri luas dengan cairan serebrospinal. J.Clin. saya crobiol. 36:2205–
2209.
7. Meier, A., DH Persing, M. Finken, dan EC Bottger. 1993. Penghapusan kontaminasi
DNA dalam reagen reaksi berantai polimerase: implikasi untuk pendekatan umum
untuk mendeteksi patogen yang tidak berbudaya. J.Clin. saya crobiol. 31:646–652.
8. Millar, B., J. Moore, P. Mallon, J. Xu, M. Crowe, R. McClurg, D. Raoult, J.
Earle, R. Hone, dan P. Murphy. 2001. Diagnosis molekuler endokarditis infektif—
kriteria Duke yang baru. Pindai. J. Menginfeksi. Dis. 33:673–680.
9. Millar, BC, X. Jiru, JE Moore, dan JAP Earle. 2000. Metode sederhana dan sensitif
untuk mengekstraksi DNA bakteri, ragi dan jamur dari bahan biakan darah. J. Mikrobiol.
Metode 42:139–147.
[ PubMed ] 10. Moore , JE , Millar BC , X .
2001. Karakterisasi cepat genomovar kompleks Burkholderia cepacia dengan analisis
polimorfisme konformasi untai tunggal (PCR SSCP) PCR. J. Hosp. Menulari. 48:129–
134.
11. Petershofen, EK, R. Fislage, R. Faber, H. Schmidt, WK Roth, dan E.
Seifried. 2000. Deteksi urutan asam nukleat dari spesies bakteri dengan metode
genetika molekuler. Transfusi. Sains. 23:21–27.
12. Relman, DA, JS Loutit, TM Schmidt, S. Falkow, dan LS Tompkins.
1990. Agen angiomatosis bacillary. Pendekatan untuk mengidentifikasi patogen yang
tidak berbudaya. N.Engl. J.Med. 323:1573–1580.
13. Rolph, HJ, A. Lennon, MP Riggio, WP Saunders, D. MacKenzie, L.
Coldero, dan J. Bagg. 2001. Identifikasi molekuler mikroorganisme dari infeksi
endodontik. J.Clin. Mikrobiol. 39:3282–3289.
14. Trotha, R., T. Hanck, W. Konig, dan B. Konig. 2001. Ribosequencing cepat—alat
diagnostik yang efektif untuk mendeteksi infeksi mikroba. Menulari. 29:12–16.
15. Weisburg, WG, SM Barns, DA Pelletier, dan DJ Lane. 1991. Amplifikasi DNA ribosom
16S untuk studi filogenetik. J.Bakteriol. 173:697– 703.
16. Wilson, IG 1997. Penghambatan dan fasilitasi amplifikasi asam nukleat.
Aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 63:3741–3751.
17. Wilson, KH, RB Blitchington, dan RC Greene. 1990. Amplifikasi DNA ribosom 16S
bakteri dengan polymerase chain reaction. J.Clin. saya crobiol. 28:1942–1946.
18. Woese, CR 1987. Evolusi bakteri. Mikrobiol. Wahyu 51:221–271.