LAPORAN PRAKTIKUM

GIZI BIOMOLEKULER

ANALISIS DNA DENGAN METODE PCR

DISUSUN OLEH:
NAMA : ITA SAJEK PRAYEKTI
NIM : K021171001

GIZI DAN BIOMOLEKULER

PROGRAM STUDI ILMU GIZI
FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT
UNIVERSITAS HASANUDDIN
2018
 KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya yang telah diberikan sehingga saya bisa menyelesaikan laporan
praktikum berjudul Analisis DNA dengan Metode PCR meskipun dengan sangat
sederhana. Adapun tujuan disusunnya laporan ini adalah sebagai syarat untuk
memenuhi tugas mata kuliah Gizi dan Biomolekuler.

Harapan saya semoga laporan yang telah tersusun ini dapat bermanfaat
sebagai salah satu rujukan maupun pedoman bagi para pembaca, menambah
wawasan serta pengalaman, sehingga nantinya saya dapat memperbaiki bentuk
ataupun isi laporan ini menjadi lebih baik lagi.

Demikianlah Laporan Praktikum Analisis DNA dengan Metode PCR saya

buat dengan sepenuh hati. Tidak lupa kritik dan saran saya harapkan agar laporan
ini dapat menjadi lebih baik lagi. Semoga laporan ini bisa bermanfaat bagi semua.
Terima Kasih.

Makassar, 25 November 2018

Penyusun

ii
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar ..................................................................................................... ii

Daftar Isi ............................................................................................................... iii
Bab I Pendahuluan.................................................................................................4
1.1 Latar belakang ....................................................................................................4
1.2 Rumusan masalah...............................................................................................5
1.3 Tujuan masalah ..................................................................................................5
Bab II Tinjauan Pustaka .......................................................................................6
2.1 Pengertian DNA .................................................................................................6
2.2 Pengertian Isolasi DNA .....................................................................................6
2.3 Pengertian PCR ..................................................................................................7
2.4 Pengertian Elektroforesis .................................................................................10
Bab III Alat dan Metode......................................................................................12
3.1 Waktu dan Tempat ...........................................................................................12
3.2 Alat, Bahan dan Prosedur Isolasi DNA............................................................12
3.3 Alat, Bahan dan Prosedur PCR ........................................................................18
3.4 Alat, Bahan dan Prosedur Elektroforesis .........................................................21
Bab IV Pembahasan
4.1 Isolasi DNA ......................................................................................................26
4.2 PCR ..................................................................................................................29
4.3 Elektroforesis ...................................................................................................30
Bab V Penutup .....................................................................................................31
5.1 Kesimpulan ......................................................................................................31
Daftar Pustaka ......................................................................................................33

iii
 BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan sebuah teknologi yang
mampu melipat gandakan fragmen DNA dari suatu genom makhluk hidup
menjadi 2 kali lipat secara enzimatis. Teknik ini pertama kali dikembangkan
oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam
beberapa jam.
Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-teknik
lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi
khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan
evolusi molekular. Teknologi PCR memberikan dampak yang signifikan pada
bioteknologi. Teknologi PCR juga memberikan dampak yang signifikan pada
berbagai bidang penelitian hayati. Berkat teknologi tersebut, pengurutan kode
genetika manusia berhasil dilakukan, jenis obat-obatan baru berhasil
ditemukan, spesies-spesies baru berhasil diidentifikasi dan penanganan
penyakit-penyakit berbahaya seperti kanker dan penyakit menular dapat
dideteksi lebih dini. Lebih jauh lagi, berbagai penemuan protein baru yang
penting melalui teknologi DNA rekombinan seperti insulin, hormon faktor
pertumbuhan, dan antibodi merupakan contoh nyata teknologi PCR memiliki
peranan sangat signifikan dalam proses pencapaian umat manusia.
Pengurutan kode genetika manusia yang berhasil dilakukan melalui teknologi
PCR membawa dampak besar bagi dunia kedokteran. Hal tersebut membawa
arah pengobatan berfokus pada individu pasien atau disebut personal
medicine.
Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR)
adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro.
Teknologi PCR pada bidang gizi pangan telah mampu berkontribusi nyata
seperti melakukan perbaikan varietas-varietas padi melalui rekayasa genetik,
sehingga tercipta padi dengan kualitas unggul baik dari sisi nutrisi yang

4
 dikandungnya maupun daya adaptasi yang lebih mumpuni dibandingkan padi
sejenis hasil perkawinan alami.

1.2 Rumusan Masalah

a. Apa saja tahapan analisis DNA dengan teknik PCR ?
b. Bagaimana proses isolasi DNA ?
c. Bagaimana proses PCR ?
d. Bagaimana proses elektroforesis ?
e. Bagaimana hasil analisis DNA dengan teknik PCR ?

1.3 Tujuan Masalah

a. Untuk mengetahui tahapan analisis DNA dengan teknik PCR
b. Untuk mengetahui proses isolasi DNA
c. Untuk mengetahui proses PCR
d. Untuk mengetahui proses elektroforesis
e. Untuk mengetahui hasil analisis DNA dengan teknik PCR

5
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian DNA
DNA (asam deoksiribonukleat) merupakan tempat penyimpanan informasi
genetic. Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah polimer asam nukleat yang tersusun
secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan
kepada keturunannya. DNA tersusun dari rangkaian nukleotida yang berupa gula
deoksiribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen. Basa nitrogen DNA terdiri dari
golongan purin, yaitu adenine dan guanine, serta golongan pirimidin yaitu timin,
dan sitosin. DNA berbentuk untaian rantai ganda dari rangkaian nukleotida yang
anti parallel dan berpilin. DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas.
DNA pada nukleus berbentuk linear dan memiliki jumlah pasang basa sekitar tiga
milyar, sedangkan DNA yang berada di mitokondria (mtDNA) berbentuk sirkuler
dan memiliki jumlah pasang basa lebih sedikit yaitu sekitar 160.000. DNA dapat
di isolasi dari jaringan apapun yang mempunyai sel inti.
2.2 Pengertian Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNAmurni dari makhluk hidup
untuk keperluan bioteknologi.Isolasi DNA merupakan langkah awal yang harus
dikerjakan dalam proses rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses
selanjutnya. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber,
antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang,
daging dan sisik ikan. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi
oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan
flavonoid. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang
terpisah yaitu supernatant pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Istanti,
Annie. 1999). Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Isolasi DNA dapat dilakukan dengan tahapan-tahapan lain seperti
preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA

6
(Zubaidan dan Jamilah, 2004). Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan
berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat
memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol
dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian
DNA. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya
membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen
dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-
deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid
memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen,
sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Tahap pertama dalam isolasi DNA
adalah proses perusakan atau pengahncuran membrane dan dinding sel.
Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan
untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel
dan atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti
menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair
atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iridasi (Giacomazzi et
al., 2005).
DNA hasil isolasi perlu dimurnikan terlebih dahulu. Pemurnian DNA
bertujuan untuk memperoleh DNA yang terbebas dari kontaminasi senyawa dan
makromolekul lain. Tahapan yang dilakukan untuk memperoleh DNA murni
yaitumembebaskan DNA dari dinding dan membran sel, disosiasi kompleks
DNA-protein. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh
polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid.
Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi
dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki
dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi
tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat.
2.3 Pengertian PCR
PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis
sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang
menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Amplifikasi

7
DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang
disebut amplimers. Primer DNA suatu sekuens oligonukleotida pendek yang
berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. PCR memungkinkan dilakukannya
pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang digunakan pada PCR
terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang
akan dilipat gandakan dan berasal dari patogen yang terdapat dalam spesimen
klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri
termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel
pada ujung 3‟ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium
menstimulasi aktivasi polimerase. Keuntungan yang terdapat dalam PCR yaitu
hanya memerlukan DNA target dalam jumlah yang sangat sedikit. Selain itu juga
dapat memperbanyak jumlah fragmen DNA yang digunakan untuk mendeteksi
suatu gen. Tujuan dalam PCR yaitu digunakan untuk membuat fragmen DNA
spesifik untuk diinsersikan secara langsung pada vektor.
Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan
DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap
urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada
setiap siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama
pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada
urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. PCR adalah
teknologi canggih yang dapat mendeteksi DNA dengan cara amplifikasi DNA.
Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk menegakkan diagnose sepanjang
pemeriksaan tersebut dikerjakan dengan cara yang benar dan sesuai dengan
standar internasional. Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini
didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Masalah yang berkenaan
dengan PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi. Metode PCR dapat
dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit,
misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5μg, oligonukliotida yang
digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-
100 μl.

8
 Adapun teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya:
1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), metode ini digunakan
untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model derifat dari
perbedaan DNA.
2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal
yangdiketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang memotong
bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi yang dihasilkan
ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan menggunakan sekuen
primer yang memiliki titik ujung yang memiliki jarak yang jauh satu sama lain
dengan segmen eksternal yang telah tergabung. Metode ini khusus digunakan
untuk mengidentifikasi ”sekuen antara” dari beragam gen.
3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada
produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan. Dua
set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set kedua mengamplifikasi
target kedua selama proses pertama berlangsung. Sekuens DNA target dari satu
set primer yang disebut primer inner disimpan di antara sekuens target set
kedua dari primer yang disebut sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi
pertama dari PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua dilakukan
dengan inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk reaksi
yang pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer akan menyatu dengan
produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk yang lebih pendek
daripada produk yang pertama.
4. Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil produk
PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur kuantitas,
dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode ini juga
menampilkan copydari sampel
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk amplifikasi,
isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA. Metode ini dibantu
oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup
pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen diekspresikan.

9
6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) bertujuan untuk mendeteksi
polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh Welsh and
Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan teknik PCR menggunakan
primer – primer dengan sequens acak untuk keperluan amplifikasi lokus acak
dari genom.
2.4 Pengertian Elektroforesis
Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah
molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul
yang serupa. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung
sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan
muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan
negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium,
kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan
muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan
terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Ada dua jenis elektroforesis, yaitu elektroforesis kertas dan elektroforesis
gel. Elektroforesis kertas merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion
kompleks) sebagai fase gerak. Pemisahan tersebut terjadi karena adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Sementara itu, elektroforesis gel
merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita yang
masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang sama.
Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan suatu makromolekul dengan
cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi
gel yang dibantu dengan tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan
berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan
listrik. Media atau gel yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis
DNA) dan poliakrilamid gel (elektroforesis protein).

10
 Elektroforesis akan menghasilkan gambaran pita-pita DNA yang dapat
diamati melalui alat UV doct. Gambaran pita yang diperoleh pada elektroforesis
berasal dari sampel DNA dan marker. jika sampel yang digunakan memiliki berat
molekul yang sama maka posisi pita dari sampel dan pita-pita dari marker pada
gel akan terlihat membentuk garis lurus yang sejajar. Hal ini disebabkan karena
molekul dengan berat yang sama akan bergerak menempuh jarak yang sama
sehingga membentuk garis lurus (Suranto, 2006). Pita-pita bisa terbentuk atau
nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel sampel yang tersangkut pada
titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada sampel yang
bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki berat molekul sama akan
terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk beberapa pita dengan
panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat molekulnya (Hames, 2004).
Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan Elektroforesis yaitu ukuran
dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage.
a. Ukuran dan Bentuk Molekul : . Semakin besar ukuran molekul maka
pergerakan akan semakin lambat, bentuk molekul sekunder atau tersier
mempunyai pergerakan yang lebih lambat dari pada protein primer.
b. Konsentrasi Gel : Pada konsentrasi gel yang rendah maka pergerakan protein
lebih cepat dan sebaliknya pada konsentrasi gel yang lebih tinggi maka
pergerakan protein akan lebih lambat.
c. pH : Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein
karena akan mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat
mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan protein.
d. Suhu : suhu akan mempengaruhi denaturasi protein dimana pada Elektroforesis
digunakan suhu 90-95oC untuk mendenaturasi protein.
e. Voltage : voltage yang digunakan juga mempengaruhi pergerakan protein
dimana dengan voltage yang tinggi maka pergerakan protein dalam gel
elektroforesis akan lebih cepat, sebaliknya jika voltage yang digunakan rendah
maka pergerakan protein dalam gel akan lambat.

11
 BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Waktu dan Tempat

A. Waktu : 17 – 18 November 2018
B. Tempat : Laboratorium Hama dan Penyakit Fakultas Ilmu Kelautan
dan Perikanan Universitas Hasanuddin
3.2 Alat, Bahan dan Metode Isolasi DNA
A. Alat dan Bahan
a. Sampel/Buah Naga
b. Neraca analitik
c. Spatula
d. Aluminium Foil
e. Cawan Petri
f. Micropastle
g. GT Buffer 200 µL
h. Protenase K 20 µL
i. Vortex
j. GBT Buffer 200 µL
k. TE Buffer/ RNA & Free water 100 µL dihangatkan pada suhu
60˚C
l. Ethanol absolute 200 µL
m. GD Column + tabung koleksi
n. Tabung Eppendorf (mikrosentrifus 1,5 mL)
o. Alat Sentrifuge
p. WI Buffer 400 µL
q. Wash bufffer 600 µL
r. Freezer
B. Metode
a. Siapkan sampel (buah naga) sebanyak 0,03 gram pada tabung
Eppendorf (tabung mikrosentrifus 1,5 mL)

12
b. Haluskan sampel menggunakan micropastle

c. Tambahkan 200 µL GT Buffer

d. Tambahkan 20 µL Protenase K

13
e. Vortex lah dengan kencang

f. Inkubasi pada suhu 60˚C selama 30 menit (setiap 5 menit tabung

di bolak-balik sebanyak 10 kali)

14
g. Tambahkan 200 µL GBT Buffer
h. Inkubasi pada suhu 60˚C selama 20 menit (setiap 5 menit tabung
di bolak-balik sebanyak 10 kali). Pada tahap ini TE Buffer/ RNA
& Free water dihangatkan pada suhu 60˚C

i. Sentrifius pada kecepatan 13000 rpm

j. Pindahkan supernatan yang dihasilkan pada tabung Eppendorf

(mikrosentrifus 1,5 mL) yang baru

15
k. Tambahkan 200 µL ethanol absolute, kemudian vortex dengan
kencang selama 10 detik

l. Pindahkan pada GD Column yang terpasang pada tabung koleksi 2

mL

16
m. Sentrifius pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit

n. Buang tabung koleksi, lalu pindahkan GD Column pada tabung

koleksi yang baru.
o. Tambahkan 400 µL WI Buffer pada GD Column lalu sentrifius
pada kecepatan 13000 rpm selama 30 detik
p. Buang cairan yang ada pada tabung koleksi, letakkan GD Column
pada tabung koleksi tersebut
q. Tambahkan 600 µL wash bufffer pada GD Column, sentrifius
pada kecepatan 13000 rpm selama 30 detik
r. Buang cairan yang ada pada tabung koleksi, lalu letakkan GD
Column pada tabung tersebut
s. Sentrifuge padab kecepatan 1300 rpm selama 3 menit
t. Pindahkan GD Column pada tabung Eppendorf (mikrosentrifus
1,5 mL) yang baru
u. Tambahkan 100 µL TE Buffer/RNA se free water yang telah
dihangatkan pada suhu 600 C pada GD Column
v. Biarkan selama 5 menit

17
 w. Sentrifuge pada kecepatan 13000 rpm selama 30 detik

x. Simpan DNA pada freezer -200C sebelum digunakan

3.3 Alat, Bahan dan Metode PCR

A. Alat dan Bahan :
a. Mesin PCR
b. Tube PCR/tabung PCR
c. Frame cetakan
d. UVP doc-it
e. Vortex
f. Sentrifuge
g. Gel agaros
h. Buffer TAE
i. Aquades
j. Primer 1
k. Primer 2
l. Konstar
m. DNA sampel
n. NFW/DW
B. Prosedur Kerja
a. Menyiapkan alat dan bahan.

18
a. Melakukan pencampuran bahan atau master mix menggunakan tube
PCR dengan memasukkan 1 µL primer 1, 1 µL primer 2, 10 µL
konstar, 1 µL DNA sampel, dan 7 µL RNA se free water (DW).
Penambahan primer 1 dan 2 berfungsi untuk mengawali sintesis

rantai DNA yang terdapat pada sampel. Penambahan RNA se free

water (DW) berfungsi untuk melarutkan DNA.
b. Memvortex larutan selama 20 detik untuk menghomogenkan.

19
c. Mencentrifuge larutan dalam laminari selama 15 detik agar larutan
yang berada di dinding-dinding tabung turun dan tercampur rata,
selain itu juga berguna untuk memisahkan antara supernatan dengan
larutan lainnya.

d. Merunning larutan dalam alat PCR selama 30 kali siklus, dimana 1

siklus terbagi dalam 5 tahap yaitu,
e. Predenaturasi, suhunya 950C selama 5 menit
f. Denaturasi, suhunya 940C selama 30 detik
g. Annealling, suhunya 560C selama 1 menit 30 detik
h. Ekstention, suhunya 720C selama 1 menit
i. Final ekstention, suhunya 720C selama 5 menit

20
3.4 Alat, Bahan dan Metode Elektroforesis
A. Alat dan Bahan:
a. Agarose
b. Kontrol Positif/Negatif
c. DNA sampel
d. Aquades
e. Buffer TAE
f. Loading D
g. Sumur Gel Agarose
B. Prosedur Kerja
a. Agar ditimbang konsentrasi 1,5% sebanyak 1,5 gr
b. Kemudian dilarutkan dengan 100 mL Buffer TAE
c. Masukkan agar ke dalam Erlenmeyer lalu dihomogenkan
d. Masukkan agar tersebut ke dalam microwave, tunggu sampai warna
putih menjadi bening

21
e. Setelah warnanya menjadi bening dan tidak ada lagi yang
menggumpal maka masukkan pada cetakan, lalu masukkan ke dalam

alat elektroforesis

f. Letakkan sisir pada cetakan yang telah berisi agar, kemudian tunggu
hngga mengeras

g. Setelah agarnya mengeras sisirnya dilepas, agar akan membentuk

sumur lalu rendam agar ke dalam buffer TAE pada wadah
elektroforesis. Selanjutnya sumur diisi dengan:

22
 Sumur ke-3 diisi dengan kontorol negatif yang telah dicampur
dengan loading D
 Sumur ke-2 diisi dengan sampelyang telah dicampur dengan
loading D
 Sumur ke-1 diisi dengan marker

23
h. Tutup wadah elektroforesis, pasangkan kabael merah hitam sesuai
dengan kutub positif dan negatif, kemudian tekan tombol power di
bagian belakang alat, atur tegangan 120 V dengan waktu 20 menit
kemudian tekan start maka proses elektroforesis telah dimulai.
Perhatikan gelembung-gelembung yang terbentuk pada dinding-dinding
wadah.

24
i. Setelah 20 menit, matikan alat kemudian cabut kabel dan buka penutup.
j. Setelah itu agar ditiriskan dan direndam ke gel rate 15-20 menit
k. Selanjutnya pindahkan ke UV doct dimana akan tampak pita-pita
DNA.

25
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi DNA
4.1.1 Hasil

4.1.2 Pembahasan
Pada praktikum yang telah dilakukan yaitu isolasi (Ekstraksi) DNA
diperoleh hasil ekstraksi DNA dari buah naga yang disimpan dalam lemari
es untuk digunakan pada tahapan berikutnya. Dengan melalui beberapa
proses yang terdiri dari sentrifugasi dan presipitasi maka diperoleh hasil
sampel DNA. Proses sentrifugasi yang dilakukan merupakan proses
pemisahan campuran berdasarkan berat molekulnya. Diketahui bahwa
sampel buah naga terlebih dahulu dicampurkan dengan beberapa bahan
kemudian melalui proses sentrifuge beberapa kali maka diperoleh hasil
akhir sampel ekstraksi DNA. Kemudian proses presipitasi yang dilakukan
bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA
tidak lagi menggulung (coiling) sehingga DNA menjadi terlihat.
Issolasi DNA pada sampel buah naga dimulai dengan membelah
buah naga menjadi dua bagian kemudian dipotong beberapa bagian

26
menjadi lima potong (lima kelompok) dan meletakkannya ke dalam cawan
petri. Siapkan sampel (buah naga) sebanyak 0,03 gram dengan
menggunakan neraca analitik. Sampel buah naga diambil menggunakan
spatula, lalu meletakkannya ke alumunium foil yang telah ada diatas
neraca analitik. Akan tetapi, sebelumnya dikalibrasikan dengan menekan
tompa zero dan masukkan sampel hingga beratnya 0,03 gram, lalu sampel
dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf (tabung mikrosentrifus 1,5 mL).
Setelah itu, haluskan sampel menggunakan micropastle agar sampelnya
lebih halus, dalam hal ini dari wujud padat akan lebih cair.
Pada laminar sampel yang telah halus, kemudian ditambahkan 200
µL GT Buffer dengan menggunakan mikropipet 200 µL dengan mengatur
skalanya hingga 200 µL dan tipnya berwarna kuning. Setiap selesai
memipet tip bekas kemudian dibuang ditempat yang telah disediakan.
Kemudian, tambahkan lagi 20 µL Protenase K dengan menggunakan
mikropipet 20 µL yang tipnya berwarna putih. Vortexlah dengan kencang
selama 10 detik. Setelah selesai divorteks, proses selanjutnya akan
dilakukan di shaker water bath. Dengan menginkubasi pada suhu 60˚C
selama 30 menit (setiap 5 menit tabung di bolak-balik sebanyak 10 kali).
Dalam hal ini, perlu memperhatikan waktunya agar sesuai. Selanjutnya,
praktikan akan kembali ke laminar untuk menambahkan 200 µL GBT
Buffer dengan menggunakan mikropipet 200 µL dengan tipnya yang
berwarna kuning.
Proses selanjutnya menginkubasi kembali pada suhu 60˚C selama
20 menit (setiap 5 menit tabung di bolak-balik sebanyak 10 kali). Pada
tahap ini TE Buffer/ RNA & Free water dihangatkan pada suhu 60˚C.
Kemudian, mengoprasikan menggunakan alat sentrifius dengan menekan
tombol power, buka tututpnya dengan menekan tombol door, masukkan
sampel (dengan posisi seimbang), tutup kembali, atur waktunya, atur
kecepatan 13000 rpm dengan memutar tombolnya sampai menunjukkan
1300 rpm. Setelah itu, tunggu sampai berbunyi untuk yang kedua kalinya,
yang menandakan bahwa sampel telah selesai disentrifius. Sehingga,

27
hasilnya akan diperoleh cairan dan supranatan. Dengan hanya mengambil
supranatan. Pindahkan supernatan yang dihasilkan pada tabung Eppendorf
(mikrosentrifus 1,5 mL) yang baru. Kemudian buanglah cairan yang sudah
tidak digunakan lagi. Selain itu, tetap memerhatikan dalam pemberian
label pada sampel dan bagian atas dari tabung Eppendorf. Tambahkan 200
µL ethanol absolute, dengan menggunakan mikropipet 200 µL dan tip
yang berwarna kuning, kemudian vortex dengan kencang selama 10 detik,
agar tidak ada cairan sampel yang berada didinding-dinding
tabung/merata.
Pindahkan pada GD Column yang terpasang pada tabung koleksi 2
mL yang sebelumnya telah diberi label/tanda terlebih dahulu. Dengan
perlakuan yang sama ketika disentrifius, kemudian Sentrifius kembali
dengan kecepatan 13000 rpm selama 2 menit. Buang tabung koleksi, lalu
pindahkan GD Column pada tabung koleksi yang baru agar hasilnya lebih
akurat. Tambahkan 400 µL WI Buffer dengan menggunakan mikropipet
400 µL yang tipnya berwarna biru. Pada setiap selesaoi menggunakan tip,
pada tip tersebut akan dibuang pada tempat pembuangan tip yang tersedia.
Pada GD Column lalu sentrifius pada kecepatan 13000 rpm selama 30
detik (dengan alat sentrifius).
Pada tahap selanjutnya dilakukan di laminar dengan membuang
cairan yang ada pada tabung koleksi karena sudah tidak digunakan, dengan
meletakkan GD Column pada tabung koleksi tersebut. Dengan
penambahkan 600 µL wash buffer yang diambil menggunakan mikropipet
600 µL yang tipnya berwarna biru yang sebelumnya skalanya telah diatur
terlebih dahulu pada GD Column, sentrifius pada kecepatan 13000 rpm
selama 30 detik dengan alat sentrifius. Kemudian, Buang cairan yang ada
pada tabung koleksi, lalu letakkan GD Column pada tabung tersebut.
Sentrifuge kembali dengan perlakuan yang sama dengan kecepatan 1300
rpm selama 3 menit agar menghomogenkan cairan sampel. Ambillah
tabung Eppendorf, lalu pindahkan CD Column pada tabung Eppendorf
(mikrosentrifus 1,5 mL) yang baru. Pada tahap sebelumnya telah

28
 mempersiapkan terlebih dahulu larutan dengan menambahkan 100 µL TE
Buffer/RNA se free water yang telah dihangatkan pada suhu 600 C pada
GD Column. Kemudian, biarkan selama 5 menit dalam suhu ruang.
Selanjutnya, sentrifuge kembali untuk keterkhir kalinya untuk
menghomogenkan sampel dengan kecepatan 13000 rpm selama kurang
lebih 30 detik dengan memperhatikan posisikan agar seimbang dan
mengunakan alat sentrifuge sesuai alurnya. Tahap yang paling terakhir dari
isolasi/ekstraksi DNA yaitu menyimpan sampel DNA pada freezer dengan
suhu -200C sebelum digunakan agar pada saat ingin melakukan tahap
selanjutkan lebih mudah dan sesuai.
4.2 PCR
4.2.1 Hasil

4.2.2 Pembahasan
Tahapan PCR dilakukan untuk mengamplifikasi gen tunggal,
bagian gen, atau urutan non-kode DNA. Pengamplifikasian tersebut
dilakukan dengan melalui beberapa tahapan mulai dari tahapan master mix
atau pencampuran bahan yang akan dilanjutkan dengan proses running
PCR. Pada tahapan running PCR dilakukan lima langkah yang dimulai
dari tahap pre denaturasi dan denaturasi yang berguna untuk menjamin
banyak cetakan DNA dan primer terdenaturasi yaitu putusnya ikatan
hidrogen basa-basa komplemen rantai DNA untuk menghasilkan rantai
tunggal DNA. Kemudian dilanjutkan dengan proses anneling dengan
menurunkan suhu agar orimer dapat menempel pada cetakan DNA rantai

29
 tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan proses ekstensi dan final ekstensi
dimana polymerase memperpanjang rantai DNA yang komplemen dengan
rantai cetakan. Tahap elongasi akhir setelah siklus terakhir digunakan
untuk menjamin DNA rantai tunggal sisa diperpanjang seluruhnya.
4.3 Elektroforesis
4.3.1 Hasil
Pada praktikum yang telah dilakukan, dengan melalui tahapan
elektroforesis diperoleh gambaran pita DNA dari sampel buah naga yang

digunakan. Gambar hasil elektroforesis terkait pita DNA adalah sebagai

berikut :
4.3.2 Pembahasan

Pada proses elektroforesis dilakukan pengisian pada beberapa

sumur yang terdiri dari marker, sampel, dan kontrol negatif. Diketahui
bahwa marker yang digunakan adalah marker 100 bp, sementara itu pada
praktikum diperoleh gen target DNA 566 bp. Berdasarkan gambar pita
DNA yang diperoleh dapat dilihat bahwa pita dari sampel dan pita-pita
dari marker pada gel tidak membentuk garis yang sejajar.

Berdasarkan teori yang telah dijelaskan pada bab sebelumnya,

tidak sejajarnya pita sampel DNA dengan pita marker pada gel
menunjukkan bahwa adanya perbedaan komponen antara sampel DNA
dengan marker. Hal tersebut juga menunjukkan adanya perbedaan berat
molekul antara sampel DNA dan marker. Hal ini juga dapat didukung

30
dengan berbedanya hasil base pairs yang diperoleh dari sampel DNA.
Sampel DNA diperoleh 566 bp sementara marker yang digunakan hanya
100 bp. Berdasarkan hasil yang diperoleh pada elektroforesis, percobaan
yang dilakukan terkait analisis DNA dimulai dari tahap isolasi DNA, PCR,
dan elektroforesis berahasil karena pita DNA dari sampel buah naga dapat
terlihat.

31
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil yang telah diperoleh dari praktikum, dapat
disimpulkan bahwa pita DNA dari sampel buah naga dapat terlihat
sehingga menunjukkan berhasilnya tahapan isolasi DNA, PCR, dan
elektroforesis. Isolasi DNA merupakan tahapan paling awal yang harus
dikerjakan dalam proses rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses
selanjutnya. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi
DNA biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer
ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2018).
Setelah isolasi DNA dilanjutkan dengan tahapan PCR. PCR adalah
teknologi canggih yang dapat mendeteksi DNA dengan cara amplifikasi
DNA. Pada tahapan ini dilakukan running dengan melalui 5 proses
dimulai dari pre denaturasi, denaturasi, annealing, ekstention dan final
ekstention. Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk menegakkan
diagnosa sepanjang pemeriksaan tersebut dikerjakan dengan cara yang
benar dan sesuai dengan standar internasional. Selanjutnya tahapan
elektroforesis yang merupakan teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan
listrik. Tahapan ini yang pada akhirnya akan memperlihatkan pita DNA
dari sampel.

32
33
 DAFTAR PUSTAKA

Firmansyah, W.E,2014. Laporan Praktikum dan Analisis Pangan Elektroforesis

SDS-Page. Malang : Universitas Brawijaya

Tangian, R. V. dan S. J. Martian, 2012. Isolasi DNA, Teknik PCR dan

Eletroforesis Agarose. www.scribd.com. Diakses pada hari Minggu 25
November 2018, pukul 21.10 WITA

Syafruddin, R. Enny, T. J. Santoso, 2011. Efektivitas dan Efisiensi Teknik Isolasi

dan Purifikasi DNA pada Jambu Mete, Buletin RISTRI, vol 2(2) : hal 151-160

Kusumawaty, Diah, 2008. Isolasi DNA Skala Kecil. www.library.upi.ac.id.

Diakses pada hari Minggu 25 November 2018, pukul 22.30 WITA
Handoyo, Darmo dan Rudiretna Adi, 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan
Polymerase Chain Reaction (PCR). Diakses pada hari Senin 26 November
2018, pukul 17.00 WITA

34