ACARA V
PENGENALAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Oleh :
Anasya Durrotin Nasikhah
A1D022249
Rombongan 4
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Swt. yang telah memberikan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan yang
berjudul “Ekstraksi DNA Tanaman” ini tepat pada waktunya.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan tugas laporan praktikum ini tidak
lepas dari bantuan, bimbingan, dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dekan Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman.
Penulis
ii
DAFTAR ISI
PRAKATA..........................................................................................................................ii
DAFTAR ISI......................................................................................................................iii
I. PENDAHULUAN........................................................................................................4
A. Latar Belakang..........................................................................................................4
B. Tujuan.......................................................................................................................5
B. Prosedur Kerja..........................................................................................................8
A. Hasil..........................................................................................................................9
B. Pembahasan.............................................................................................................12
A. Kesimpulan.............................................................................................................16
B. Saran.......................................................................................................................16
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................................17
LAMPIRAN.......................................................................................................................17
iii
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Ilmu pengetahuan dan teknologi dalam berbagai bidang semakin berkembang dan
maju, salah satunya adalah bidang bioteknologi. Dalam bidang bioteknologi, adanya
teknik DNA rekombinan membantu percepatan penelitian teknik yang dapat digunakan
dalam bidang biologi molekuler. Perkembangan ini menuntut para peneliti untuk
menguasai teknik dasar biologi molekuler, yang dapat menjadi modal dasar bagi
pengembangan penelitian dan peningkatan kesejahteraan manusia. Teknik dasar biologi
molekuler adalah isolasi DNA, elektroforesis gel agarosa, elektroforesis SDS-PAGE
(elektroforesis sodium dodecyl sulfate polyacrylamide Fel) dan PCR (polymerase chain
reaction).
PCR pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh seorang peneliti di CETUS
Corporation yaitu Kart Mullis. Tujuan pengembangan PCR adalah untuk dapat
menggandakan fragmen DNA spesifik dalam DNA genom dengan reaksi yang analog
dengan mekanisme reproduksi organisme. Replikasi terjadi dalam siklus berulang pada
suhu, waktu dan komposisi kimia yang dilakukan pada siklus termal dan menghasilkan
banyak salinan dari fragmen DNA yang diberikan.
PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah metode
enzimatik untuk amplifikasi eksponensial dari urutan nukleotida tertentu secara in vitro.
PCR adalah salah satu teknik yang paling banyak dipelajari dan digunakan secara luas.
PCR banyak digunakan di berbagai bidang, termasuk pertanian. Di bidang pertanian, ini
dapat membantu menganalisis keefektifan pemberian pupuk dalam jumlah tertentu pada
tanaman, mendeteksi keberadaan patogen yang mempengaruhi tanaman, dan dapat
membantu pemilihan dan identifikasi keragaman genetik dalam program pemuliaan
tanaman. Oleh karena itu, penting untuk memahami teknologi PCR karena memiliki
banyak kegunaan di berbagai bidang.
4
B. Tujuan
5
I. TINJAUAN PUSTAKA
Ditemukan oleh Kary Mullid pada tahun 1985, PCR menandai era baru dalam
kemampuan menganalisis perubahan (mutase) dalam DNA dengan metode di mana setiap
segmen DNA diamplifikasi dengan perkalian berulang dengan enzim DNA polimerase.
DNA polimerase adalah produk alami dari setiap organisme hidup. Di dalam sel, enzim
ini memperbanyak DNA saat sel membelah dalam proses mitosis dan meiosis (Kusnandi
& Arumingtyas, 2020).
Metode PCR merupakan metode enzimatik untuk amplifikasi DNA secara in vitro.
Proses PCR membutuhkan beberapa komponen utama yaitu DNA template,
oligonukleotida primer, deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), enzim DNA
polimerase dan komponen pendukung lainnya seperti senyawa penyangga (Yusuf, 2010).
PCR dapat memperkuat molekul DNA dan mengisolasi gen; Kelebihan dari metode ini
adalah suhu dapat tinggi dan rendah dengan cepat, selain itu PCR juga bekerja dengan
jumlah komponen yang sedikit (Fatchiyah, 2011). Dasar keberhasilan proses PCR adalah
kesesuaian primer serta efisiensi dan optimalisasi proses PCR (Hairmansis &
Aswidinoor, 2005).
Tahapan dalam proses PCR adalah tahapan denaturasi, annealing, dan elongasi.
Pada langkah denaturasi, DNA beruntai ganda diubah menjadi untai tunggal dengan suhu
tinggi. Kesalahan pemisahan ini menyebabkan kegagalan proses PCR karena renaturasi.
Pada langkah berpasangan, primer yang dirancang khusus untuk berikatan dengan DNA
6
target berikatan dengan komplemennya. Ini memulai proses inisiasi perpanjangan DNA.
Berikutnya adalah langkah pemanjangan. Pada langkah ini, Taq polimerase memulai
aktivitasnya dengan memperpanjang primer DNA dari ujung 3'. Tingkat produksi
nukleotida enzim ini pada 72 ℃ diperkirakan 35-100 nukleotida per detik (Yuwono &
Tribowo, 2006).
Amplifikasi DNA dengan metode PCR terdiri dari tiga tahap. Proses amplifikasi
tahap pertama adalah denaturasi untai DNA, kemudian primer dihubungkan dengan
fragmen DNA target (annealing) dan tahap terakhir proses ekstensi yaitu proses
pemanjangan sekuens DNA (Sulistyaningsih, 2007).
Teknik PCR memungkinkan DNA diproduksi dalam jumlah banyak dalam waktu
yang relatif singkat sehingga memudahkan penggunaan beberapa teknik lain yang
menggunakan DNA. PCR banyak digunakan dalam bidang biokimia dan biologi
molekuler karena relatif murah dan hanya membutuhkan sedikit sampel. PCR
(polymerase chain reaction) adalah metode in vitro untuk mensintesis sekuens DNA
spesifik menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi kelompok
berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingkat keberhasilan yang
tinggi dalam mengamplifikasi urutan DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini
semakin sering digunakan. Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian
spesifik dari sekuen DNA yang akan diamplifikasi harus diketahui terlebih dahulu
sebelum proses amplifikasi dapat dilakukan. Urutan yang diketahui penting untuk
menyediakan primer, yaitu urutan oligonukleotida pendek yang memulai sintesis rantai
DNA dalam reaksi berantai polimerase.
7
II. METODE PRAKTIKUM
Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum acara V yaitu mikropipet, microtube,
thermocycler, larutan master mix red taq, DNA template, larutan primer forward, larutan
primer reverse dan nuklease free water.
B. Prosedur Kerja
8
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
9
5. Kemudian larutan primer
reverse juga ditambahkan
sebnyak 2 µl
Thermocycler dinyalakan
10. Kemudian setting alat
dengen menekan menu
create. Pada alat ini
terdapat lima tahapan:
1. Predenaturasi
dibutuhkan suhu 95℃
selama 1 menit
2. Denaturasi Thermocycler disetting alat dengan
dibutuhkan suhu menekan menu create
95℃ selama 2 menit
10
3. Annealing
dibutuhkan suhu
55℃ selama 15
detik
4. Extension
dibutuhkan suhu
72℃ selama 10
detik
5. Final dibutuhkan
suhu 72℃ selama 2
menit
11. Setelah itu setting siklus
sebanyak 30 kali/siklus
dan dijalankan dengan
menekan tombol F1.
Proses ini memakan waktu
± 1 jam 30 menit
Thermocycler disetting siklus sebanyak
30 kali/siklus
12. Jika proses sudah selesai,
maka langsung tekan
tombol OFF dibagain
belakang alat
B. Pembahasan
11
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi
DNA dengan cara invirto. Muladno (2010) mengemukakan bahwa PCR merupakan
reaksi yang menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu, dengan cara
mensintesis molekul DNA yang baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target
tersebut. PCR digunakan untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu
dengan menganalisis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA
target melalui enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle.
Annealing adalah dasar untuk kemampuan untaian asam nukleat tunggal untuk
mengikat secara khusus ke untai pasangannya. Ketika DNA beruntai ganda mengalami
denaturasi, untaian tersebut terpisah. Saat panas dihilangkan atau suhu diturunkan, utas
terhubung kembali. Jika suhu turun selama proses PCR, untaian oligonukleotida saling
menempel. Proses ini dipengaruhi oleh faktor-faktor yang mempengaruhi proses
pembentukan ikatan hidrogen antar basa nukleotida pasangannya yaitu suhu, pH, larutan
garam, dll.
Secara umum, panjang primer yang ideal adalah 18-30 oligonukleotida. Panjang ini
diharapkan cukup untuk mengikat template pada suhu annealing dan memberikan urutan
yang spesifik (Borah, 2011). Jika primer terlalu pendek, ini dapat mengurangi spesifisitas
primer, membuatnya lebih mudah menempel pada model pada suhu anil yang tidak
diinginkan. Di sisi lain, jika introduksi terlalu panjang, hal ini tidak mempengaruhi
spesifisitas secara signifikan (Handoyo & Rudiretna, 2001).
12
pertanian, ekspresi gen, deteksi genotipe, kloning, mutagenesis, dan analisis metilasi.
PCR memiliki beberapa keunggulan, antara lain:
PCR juga memiliki beberapa kelemahan, antara lain DNA dari sel bakteri mati ikut
terdeteksi (Prayoga et al., 2014). PCR memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
PCR adalah cara yang selektif dan sangat cepat untuk memperkuat urutan DNA yang
diinginkan. Prinsip dasar PCR adalah:
A. Denaturasi
Denaturasi DNA adalah proses di mana DNA beruntai ganda dipecah menjadi DNA
beruntai tunggal. Langkah ini biasanya memakan waktu sekitar 3 menit untuk
memastikan bahwa molekul DNA didenaturasi menjadi DNA beruntai tunggal.
Denaturasi yang tidak lengkap menyebabkan renaturasi DNA yang cepat (reformasi
menjadi DNA untai ganda), yang menyebabkan kegagalan proses PCR (Murray et al.,
2006). Pada tahap ini, semua reaksi enzim dihentikan, misalnya reaksi polimerisasi pada
siklus sebelumnya. Denaturasi biasanya terjadi antara 90℃ dan 95℃
Secara umum, kriteria untuk mendesain primer yang baik adalah: primer harus
mengandung 18-25 basa, mengandung 50-60% G+C, dan kedua primer harus sama.
Selain itu, urutan DNA dari masing-masing primer tidak boleh saling melengkapi, karena
13
hal ini menyebabkan pembentukan struktur sekunder primer dan mengurangi efisiensi
PCR. Waktu annealing yang biasa digunakan pada PCR adalah 30-45 detik. Semakin
panjang ukuran primer, semakin tinggi suhunya. Kisaran suhu ikatan yang digunakan
adalah 36 °C sampai 72 °C, tetapi suhu biasa adalah 50 sampai 60 °C (Handoyo dan
Rudiretna, 2000).
Pada titik ini Taq polimerase memulai aktivitasnya dan memperluas ujung 3' primer
DNA. Tingkat perakitan nukleotida enzim pada 72 °C diperkirakan 35-100 nukleotida per
detik, tergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Jadi,
untuk produk PCR 2000 bp, satu menit sudah lebih dari cukup untuk langkah ekstensi
primer ini. Biasanya, pada akhir siklus PCR, waktu yang dihabiskan dalam langkah ini
ditambah menjadi 5 menit, sehingga semua produk PCR diharapkan membentuk DNA
beruntai ganda. Reaksi di atas berulan 25-30 kali (siklus), sehingga pada akhir siklus
terbentuk molekul DNA beruntai ganda baru, yang dihasilkan melalui polimerisasi dalam
jumlah yang jauh lebih besar daripada jumlah DNA cetakan yang digunakan. Jumlah
siklus amplifikasi bergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi.
Produk PCR dapat diidentifikasi berdasarkan ukurannya menggunakan elektroforesis gel
agarosa. Dalam metode ini, DNA disuntikkan ke dalam gel agarosa dan gel tersebut
dilapisi. Hasilnya untaian kecil DNA bergerak cepat dan untaian besar menunjukkan hasil
positif antar gel (Yusuf, 2010) .
Proses PCR tidak selalu berjalan mulus dan tidak memberikan hasil yang optimal.
Keberhasilan dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain jenis primer yang
digunakan, enzim polimerase, DNA, suhu dan konsentrasi. Primer bersifat spesifik untuk
DNA karena primer nonspesifik dapat menyebabkan primer yang salah atau bahkan gagal
mengamplifikasi DNA. Primer berukuran nukleotida berukuran 18-30 nt dan digunakan
untuk membingkai fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. Agar primer dapat
berikatan secara spesifik dan efisien dengan fragmen DNA target, perlu dilakukan
perancangan primer. Primer DNA (oligonukleotida pendek) terlibat dalam proses ini,
yang, setelah memisahkan untaian ganda DNA, tetap melekat pada untaian ketika suhu
menurun,
14
Kemurnian atau proses ekstraksi menentukan ketebalan pita DNA. Pita DNA yang
tebal dan tidak teragregasi menunjukkan konsentrasi tinggi dan DNA yang diekstraksi
utuh. Meskipun pita DNA yang tampak menyebar menunjukkan adanya ikatan antar
molekul DNA yang putus selama proses ekstraksi, namun genom DNA dipotong menjadi
bagian yang lebih kecil. Gangguan ikatan dapat disebabkan oleh agitasi fisik yang
berlebihan, seperti inversi, sentrifugasi, atau suhu tinggi, serta aksi bahan kimia tertentu.
15
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
B. Saran
Saran untuk praktikum acara ini adalah asisten praktikum diharapkan tidak terlalu
cepat pada saat menjelaskan Teknik PCR agar dapat dipahami oleh mahasiswa. Pada saat
melakukan praktikum, praktikan tidak membuat kegaduhan didalam laboratorium dan
selalu mendengarkan arahan dari asisten praktikum agar tidak terjadi kesalahpahaman
mengenai materi yang disampaikan. Serta menjaga sikap baik dengan mahasiswa maupun
asisten praktikum.
16
DAFTAR PUSTAKA
17
Wardani, A. K., Alirsyah, A., & Fauziah, A. (2017). Identifikasi Gen Transgenik
pada Produk Susu Bubuk Kedelai dan Susu Formula Soya dengan
Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). agriTECH, 37(3), 237-245.
Widayat, W., Agustini, T. W., Suzery, M., Al-Baarri, A. N. M., Putri, S. R., &
Kurdianto, K. (2019). Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
sebagai Alat Deteksi DNA Babi dalam Beberapa Produk Non-
Pangan. Indonesia Journal of Halal, 2(1), 26-33.
18
LAMPIRAN
19
Lampiran 2. Dokumentasi kegiatan
20
21
Lampiran 3. Jurnal
22
23
24
25
26
27