MAKALAH BIOLOGI MOLEKULER

REAL TIME PCR

Dosen pengampu : Ibu Dinna Rakhmina, S.Si.,M.Sc

Disusun Oleh :
Kelompok 4
Nama NIM
Ahmad Rizal Fauzi P07134118296
Annisa Ahla P07134118300
Annisa Jamilah P07134118302
Avissa Naila Majdina Azalia P07134118304
Devi Arianti P07134118305
Fatimah Khalda P07134118311
Nor Atika P07134118324
Sri Adha Muzdhalifah P07134118338

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTRIAN

KESEHATAN BANJARMASIN
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
2019

1
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur atas kehadirat Allah swt atas segala rahmat hidayah dan karunia-
Nya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah yang berjudul “Real Time PCR”
yang disusun untuk memenuhi tugas yang diberikan oleh dosen mata kuliah.
Dalam menyelesaikan tugas ini tidak lupa penulis sampaikan ucapan terima kasih
kepada: Ibu Dinna Rakhmina, S.Si.,M.Sc. yang telah membimbing serta memberi
pengarahan kepada kami demi terselesaikannya tugas ini. Juga pihak-pihak yang telah
ikut terlibat dan mendukung dalam penyelesaian makalah ini.
Penulis juga menyadari bahwa dalam menulis makalah ini masih terdapat
kekurangan-kekurangan, maka dengan ini kami menerima kritik dan saran yang
membangun dari semua pihak. Akhir kata kami berharap agar makalah ini dapat
mencapai maksud yang diinginkan dan dapat menjadi tulisan yang berguna bagi
semua pihak.

Banjarbaru, Oktober 2019

Kelompok 4

2
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .................................................................................................. 2

DAFTAR ISI ................................................................................................................. 3

BAB I ............................................................................................................................ 4

PENDAHULUAN ........................................................................................................ 4

A. Latar Belakang ................................................................................................... 4

B. Rumusan Masalah .............................................................................................. 5

C. Tujuan ................................................................................................................ 5

BAB II ........................................................................................................................... 6

ISI .................................................................................................................................. 6

A. Pengertian Real Time PCR ................................................................................ 6

B. Mekanisme Real Time PCR ............................................................................... 7

C. Komponen Real Time PCR dan fungsinya ........................................................ 8

D. Contoh Penerapan Dalam bidang Kesehatan ................................................... 10

BAB III ....................................................................................................................... 11

PENUTUP ................................................................................................................... 11

A. Kesimpulan ...................................................................................................... 11

B. Saran ................................................................................................................. 11

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 12

3
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Bioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam
pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk
dari makhluk hidup (enzim,alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan
barang dan jasa. Bioteknologi secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu
organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut dapat
memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari
organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut.
Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas)
serta segala seluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan,
ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pewarisan sifat,
bagaimana sifat keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi kegenerasi serta
variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya atau yang menyertainya.
Pewarisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual. Genetika berusaha
membawakan material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik),
bagaimana informasi tersebut di ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana
informasi tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain.
PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis
sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang
menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.
Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang
diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. Real-Time PCR
merupakan modifikasi dari PCR. Teknik ini dikembangkan untuk melakukan
analisis terhadap molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah
sangat sedikit di dalam sel. Real Time – PCR ini dikembangkan untuk mengatasi
kelemahan-kelemahan metode PCR yang lain.

4
B. Rumusan Masalah
1. Apa definisi dari Real Time PCR?
2. Bagaimana mekanisme Real Time PCR?
3. Apa fungsi setiap komponen dari Real Time PCR?
4. Apa contoh aplikasi dibidang medis Real Time PCR?

C. Tujuan
1. Untuk mengetahui definisi dari Real Time PCR
2. Untuk mengetahui mekanisme Real Time PCR
3. Untuk mengetahui fungsi setiap komponen dari Real Time PCR
4. Untuk mengetahui contoh aplikasi dibidang Real Time PCR

5
 BAB II
ISI

A. Pengertian Real Time PCR

Real Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi
PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR adalah suatu teknik
pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak)
sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil
amplifikasi tersebut menggunakan probe ber-fluoresense.
Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi
(sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah
dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan)
sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa. Real Time
PCR atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau PCR kinetik
adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk
mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu
atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan
deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah
salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang
dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.
Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada
akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel
agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan
Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi
berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang
muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Serta pada
Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis,
sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide
(EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.

6
B. Mekanisme Real Time PCR
Real Time-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen dengan
sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut
kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan
menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya
mengikuti amplifikasi logaritmik. RT-PCR meliputi tiga tahap utama yaitu :
1. Tahap pertama adalah denaturasi, denaturasi merupakan proses memisahkan
DNA menjadi utas tunggal. Pada temperatur tinggi double strand pada DNA
akan diputus menjadi single strand DNA. Biasanya suhu pada tahap ini cukup
tinggi yaitu 94 – 96oC. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan
siap menjadi template bagi primer. Denaturasi yang tidak berlangsung secara
sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Tahap denaturasi yang
terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase.
2. Tahap berikutnya adalah penempelan atau annealing, primer menempel pada
bagian DNA template. Merupakan tahapan yang sangat penting karena jika
ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi
kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang
mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu optimal
sekitar 45 – 60oC, suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan
timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi
dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi.
3. Tahap akhir adalah pemanjangan atau elongasi, elongasi merupakan proses
pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim
polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer
lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari
satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA.
Suhu untuk proses ini berkisar pada 70-76oC, tergantung dari jenis DNA
polimerasenya.

7
 Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :
1. Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA
rantai ganda misalnya SYBR Green (pewarna yang mengikat DNA rantai
ganda dan setelah mengikat terjadi peningkatan flourensensi lebih dari
seratus kali lipat)
2. Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida
yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA
komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) (sistem yang hanya
mendeteksi produk tertentu) dan probe TaqMan (mendapatkan sinyal
flouresensi dari hidrolisis probe).

C. Komponen Real Time PCR dan fungsinya

Komponen utama alat Real Time PCR yaitu Thermal Cycler (mesin PCR),
Optical Modul (pendeteksi fluoresensi selama reaksi), komputer (membaca dan
memindahkan data fluoresensi ke layar monitor, serta dapat disimpan dalam
berkas). Sedangkan komponen utama dalam proses Real Time PCR yaitu :
1. Konsentrasi magnesium, pada Real Time PCR, magnesium klorida atau
magnesium sulfat biasanya digunakan pada konsentrasi firal 3 mM.
Konsentrasi ini bekerja dengan baik untuk sebagian besar target: namun
konsentrasi magnesium yang optimal dapat bervariasi antara 3 dan 6 mM.
2. DNA Cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi
DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk
pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa
DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam
DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.

8
3. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25
basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA.
Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang
mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada
ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada
ujung 3’OH rantai DNA cetakan yang lain.
4. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), Shanghai Shine Gene Molecular
Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP adalah larutan air
pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-
masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap
digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan
untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR
dan lainnya.
5. DNA Polimerase, pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang
digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang
berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow
adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’
→ 3’)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa
enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan
nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari
komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai
prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer-
DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu
perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan
ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.

9
D. Contoh Penerapan Dalam bidang Kesehatan
1. Alat deteksi berbagai penyakit : Diagnostic penyakit berbahaya seperti
Salmonella sp. Pada pangan ,Mycobacterium tuberculosis pada darah dan
urin, serta Plasmodium sp. Pada darah ; Diagnostic penyakit keturunan
seperti Down’s syndrome, kelainan kromosom 48, XXYY syndrome dan ret
syndrome; Diagnostik kanker contohnya kanker payudara
2. Optimalisasi Real Time PCR untuk Diagnosis Filariasis Bancrofti pada
Sediaan Hapus Darah Tebal
3. Analisis transkripsi secara kuantitatif
4. Analisis pada mikrobiologi pada bahan makanan dan minuman, misalnya
cemaran daging babi pada olahan makanan
5. Analisis sidik jari

10
 BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction
(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu
sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. PCR merupakan suatu teknik atau
metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan
organisme. Adapun komponen dari PCR yaitu DNA cetakan, Oligonukleutida
primer, DNA polymerase, dan Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP).
Prinsip dasar dari proses PCR yaitu Tahap pertama Denaturasi. Tahap 2
penempelan. Tahap 3 elongasi. Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai
dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada siklus pertama dua untai tunggal DNA
cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda. Pada siklus kedua, 2 DNA
cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai cetakan sehingga
pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus berikutnya
akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga
DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30
menjadi 1.073.741.824 dan seterusnya. Contoh aplikasi PCR antara lain yaitu
proses Isolasi Gen, DNA Sequencing, Forensik dan Diagnosa penyakit.

B. Saran
Penyusun menyarankan setiap prosedur kerja harus dipatuhi sehingga tidak
menimbulkan kesalahan dalam pemeriksaan. Makalah ini masih jauh dari
sempurna maka dari itu penyusun mengharapkan agar pembaca mencari literatur
atau referensi yang banyak dalam penyusunan isi dari materi makalah ini.

11
 DAFTAR PUSTAKA
Thermo Fisher Scientific. 2014. Real-time PCR Handbook. Applied Biosystems
Rasmussen,Randy,Ph.D. 2015. Real Time PCR Detection Chemistry. Idaho
Technology, COO.

Ahamad. (2016, November 2). blogspot.com. Retrieved from RT PCR:

http://ahamad22.blogspot.com/2016/11/makalah-rt-pcr-ahmad-
binhus.html?m=1
Ferlianti.Rika. (2012). Optimalisasi Real time PCR. Jurnal Kedokteran Yarsi, 9.

12
13