Laporan Praktikum Pengantar Genetika Ikan

POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)

Di susun oleh :

Nama : Nanda Maulidia

Nim : 2111102010078

Kelompok : 06

Asisten : Abdul Rahman Siregar

PRODI BUDIDAYA PERAIRAN

FAKULTAS KELAUTAN DAN PERIKANAN

UNIVERSITAS SYIAH KUALA

09 NOVEMBER

2022

i
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang dengan rahmat dan

hidayahnya kami dapat menyelesaikan penulisan tugas laporan praktikum ini untuk

memenuhi dalam bidang penilaian mata pelajaran pengantar genetika ikan yang

berjudul “POLYMERASE CHAIN REACTION”

Mungkin dalam pembuatan laporan praktikum ini masih banyak kekurangan

baik itu dari segi penulisan, isi dan lain sebagainya. Maka saya sangat mengharapkan

kritikan dan saran guna perbaikan untuk pembuatan laporan praktikum untuk hari yang

akan datang

Demikianlah sebagai pengantar kata, dengan iringan serta harapan semoga

tulisan sederhana ini dapat diterima dan bermanfaat bagi pembaca, atas semua ini kami

mengucapkan terima kasih sebanyak-banyaknya. Semoga segala bantuan dan semua

pihak mudah-mudahan dapat amalan baik yang diberikan oleh Allah SWT

Banda Aceh, November 2022

Praktikan

i
 DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR.............................................................................................. ii

DAFTAR ISI ............................................................................................................ iii

DAFTAR TABEL .................................................................................................... iv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ v

BAB I PENDAHULUAN......................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.2 Tujuan Praktikum .................................................................................... 2
1.3 Manfaat praktikum ................................................................................... 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 3

BAB III METODE PENELITIAN ......................................................................... 5

3.1 Waktu Dan Tempat .................................................................................. 5

3.2 Alat Dan Bahan ........................................................................................ 5

3.3 Cara Kerja ................................................................................................ 8

BAB IV HASIL DAN PEMBAHSAN .................................................................... 9

4.1 Pembahsan ............................................................................................... 9

BAB V PENUTUP ................................................................................................... 13

5.1 Kesimpulan .............................................................................................. 13

5.2 Saran ........................................................................................................ 13

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 14

LAMPIRAN ............................................................................................................. 15

ii
 DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 3.2.1 Alat ........................................................................................................ 5
Tabel 3.2.2 Bahan ...................................................................................................... 5

iii
 DAFTAR LAMPIRAN
Halaman

Lampiran Dokumentasi.............................................................................................. 15

iv
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan

tenting DNA. muncullah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern

merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA.

Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan

memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda,

seperti bakteri, hewan dan tumbuhan.

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintetis

molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut.

Prosesnya dilakukan dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer

dalam suatu termosikler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai

ribuan nukelotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada pada

daerah sebelum daerah target disebut sebagai primer forward, dan yang berada

setelah daerah target disebut reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak

rangkaian molekul DNA baru dikenal dengan enzim polymerase. Untuk dapat

mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang

mencakup dATP (nukleotida berbasa adenine), dCTP (sitosin), guanine, dGTP

(guanin), dan dTTP (timin).

Pada proses PCR menggunakan alat Termosiklus Sebuah mesin yang memiliki

kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan

mengatur temperature untuk tiap tahapan reaksi Ada tiga tahapan penting dalam

1
 proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan

cepat yaitu denaturasi, anneling dan pemanjangan untaian DNA. Produk PCR

dapat di identifikasi melalu ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel

agarosa. Beberapa aplikasi metode PCR diantaranya human genome project,

diagnosis penyakit genetic, analisis filogenetik dan lain-lain Oleh karena itu,

dilakukanlah praktikum teknik PCR sebagai modal awal sebelum

mengaplikasikannya dalam bidang genetika yang lainnya.

1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum kali ini adalah mahasiswa dapat mengetahui prinsip

kerja PCR, memahami Teknik dasar PCR dan dapat mengoperasikan alat

SensoQuest Lab cycler Spin

1.3 Manfaat praktikum

Adapun manfaat yang didapatkan pada praktikum kali ini adalah

1. Mahasiswa dapat mengetahui cara kerja PCR

2. Mahasiswa dapat menggunakan alat PCR

3. Mahasiswa dapat meeahami Teknik kerja PCR

4. Mahasiswa mampu mengoperasikan alat SensoQuest Lab cycler Spin

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Pada proses PCR menggunakan alat Termosiklus. Sebuah mesin yang
memilikikemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi
dan mengaturtemperature untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam
proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat
yaitu denaturasi, annelingdan pemanjangan untaian DNA. Produk PCR dapat di
identifikasi melalui ukurannya denganmenggunakan elektroforesis gel agarosa.
Beberapa aplikasi metode PCR diantaranya humangenome project, diagnosis penyakit
genetic, analisis filogenetik dan lain-lain. Oleh karena itu,dilakukanlah praktikum
teknik PCR sebagai modal awal sebelum mengaplikasikannya dalambidang genetika
yang lainnya (Joshi Mohini, Deshpande, 2011).

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang
(siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda.
Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi
termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk
memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari
target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend
primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang
sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang
diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah
siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier
seperti tampak pada bagan di atas (Newton and Graham, 2015).

Tahap pengujian dengan PCR umumnya terdiri dari isolasi DNA, denaturasi
DNA menjadi untai tunggal, annealing primer sekuens spesifik dan penyambungan
siklus polymerase 25 – 40. Hasil PCR adalah produk berupa 50-10000 bp bagian
spesifik genome yang dapat dianalisis dengan elektroforesis gel atau sekuensing
DNA (Mufty, 2018).

Pada proses PCR menggunakan alat Termosiklus. Sebuah mesin yang

memilikikemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi

3
dan mengaturtemperature untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam

proses PCR yangselalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat

yaitu denaturasi, annelingdan pemanjangan untaian DNA. Produk PCR dapat di

identifikasi melalui ukurannya denganmenggunakan elektroforesis gel agarosa.

Beberapa aplikasi metode PCR diantaranya humangenome project, diagnosis penyakit

genetic, analisis filogenetik dan lain-lain. Oleh karena itu,dilakukanlah praktikum

teknik PCR sebagai modal awal sebelum mengaplikasikannya dalambidang genetika

yang lainnya (Feldman, 2013).

(Polymerase chain reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah teknik

yangdigunakan di laboratorium untuk membuat jutaan salinan bagian tertentu dari

DNA. PCRadalah alat yang biasa digunakan di laboratorium penelitian medis

dan biologi. Hal inidigunakan pada tahap awal pengolahan DNA untuk sequencing

(penentuan urutan DNA),untuk mendeteksi ada atau tidak adanya gen untuk

membantu mengidentifikasi patogenselama infeksi, dan saat membuat profil DNA

forensik dari sampel kecil DNA (Dian Pertiwi, 2015.)

4
 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu Dan Tempat
Praktikum ini telah dilaksanakan pada hari selasa tanggal 09 November 2022

pada pukul 12.00 WIB sampai dengan selesai di laboratorium Biologi Genetika,

Fakultas Kelautan dan perikanan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh.

3.2 Alat Dan Bahan

Tabel 3.2.1 Alat
No Nama alat Jumlah Fungsi
(unit)
1. Cool Rack 1 unit Sebagi wadah Sampel dari
mikrotube
2. Microtube 1,5 ml 1 unit Sebagai analisis pemeriksaan
kecocokan dalam darah
3. PCR Tube 1 unit Sebagai wadah preparat
4. Micropipet 4 unit Memindahkan larutan atau
cairan dari satu tempat ke
tempat yang lainnya
5. Tip Mikropipet 1 unit Mengambil larutan dalam
jumlah yang sangat kecil
6. Tisu 1 unit Membersihkan
7. Senso Quest Lab Cycler 1 unit Mendeteksi keberadaan atau
Spin
tidak adanya gen
8. Vortex 1 unit Penghancuran substansi pada
saat persiapan pembuatan
reagen
9. Tissue Handuk 1 unit Membersihkan
10. Gloves 1 unit Melindungi tangan dari panas
11. Gelas Ukur 4 unit Mengukur volume larutan atau
zat cairdengan tepat

5
12. Microwave 1 unit Menghangatkan atau
memanaskan dengan
menggunakan gelombang
mikro melalui aliran listrik
13. Tray 1 unit Pengering yang bertingkat
dengan menggunakan udara
panas dalam ruang tertutup
14. Tank Elektroforesis, cetakan 1 unit Pemisahan,
pemurnian,persiapan sampel
agarose dan sisir agar
asam nukleat dan protein
berdasarkan ukurannya
15. GeLDoc UVITEC 1 unit Melakukan dokumentasi gel
menggunakan tingkat
sensitivitas yang tinggi
sehingga dapat mempermudah
peneliti dalam
mengoperasikannya
16. Parafilm 1 unit Menutup mulut tabung reaksi
agar cairan yang ada dalam
tabung tidak tumpah sewaktu
menghomogenkan cairan

Tabel 3.2.2 Bahan

no Nama alat Jumlah Fungsi
(unit)
1. Cool Rack 1 unit Sebagi wadah Sampel dari
mikrotube
2. Microtube 1,5 ml 1 unit Sebagai analisis pemeriksaan
kecocokan dalam darah
3. PCR Tube 1 unit Sebagai wadah preparat

6
4. Micropipet 4 unit Memindahkan larutan atau
cairan dari satu tempat ke
tempat yang lainnya
5. Tip Mikropipet 1 unit Mengambil larutan dalam
jumlah yang sangat kecil
6. Tisu 1 unit Membersihkan
7. Senso Quest Lab Cycler 1 unit Mendeteksi keberadaan atau
Spin
tidak adanya gen
8. Vortex 1 unit Penghancuran substansi pada
saat persiapan pembuatan
reagen
9. Tissue Handuk 1 unit Membersihkan
10. Gloves 1 unit Melindungi tangan dari panas
11. Gelas Ukur 4 unit Mengukur volume larutan atau
zat cairdengan tepat
12. Microwave 1 unit Menghangatkan atau
memanaskan dengan
menggunakan gelombang
mikro melalui aliran listrik
13. Tray 1 unit Pengering yang bertingkat
dengan menggunakan udara
panas dalam ruang tertutup
14. Tank Elektroforesis, cetakan 1 unit Pemisahan,
pemurnian,persiapan sampel
agarose dan sisir agar
asam nukleat dan protein
berdasarkan ukurannya
15. GeLDoc UVITEC 1 unit Melakukan dokumentasi gel
menggunakan tingkat
sensitivitas yang tinggi
sehingga dapat mempermudah
peneliti dalam
mengoperasikannya

7
 16. Parafilm 1 unit Menutup mulut tabung reaksi
agar cairan yang ada dalam
tabung tidak tumpah sewaktu
menghomogenkan cairan

3.3 Cara Kerja

Cara kerja pada praaktikum kali ini adalah :

1. Gunakan jas lab sangat melakukan kegiatan

2. Pastikan selalu menggunakan glove dan masker

3. Bersihkan meja kerja menggunakan ethanol teknis 70%

4. Isi Form pemakaian alat yang tertempel didekat alat PCR

5. Isi Form PCR yang telah tersedia

6. Isi log book penelitian sesuai dengan format penelitian

7. Keluarkan sampel hasil ekstraksi yang akan di analisis

8. Siapkan reagen berupa Red Master Mix, Primer Reverse, Primer Forward,

DDH20

9. Pastikan meletakkan tube reagen didalam Cooler rack agar suhu dingin tetap

terjaga

10. Beri label pada pada tube PCR sesuai dengan label ekstraksi

11. Setelah memasukkan semua komposisi, set program PCR sesuai dengan

sampel yang akan dianalisis

12. Running

13. Setelah selesai pengerjaan, pastikan meletakkan reagen kembali ke freezer

14. Letakkan kembali pippete dan rak tip kembali ke raknya

15. Standarisasi pippet dengan mengembalikan ke angka 0

16. Bersihkan meja kerja dengan ethanol teknis 70%

8
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHSAN
4.1 Pembahasan

PCR (Polymerase chain reaction) adalah teknik yang digunakan di

laboratorium yang berguna untuk memperbanyak DNA atau membuat jutaan salinan

bagian tertentu dari DNA. PCR adalah alat yang biasa digunakan di laboratorium

penelitian medis dan biologi. Hal ini digunakan pada tahap awal pengolahan

DNA untuk sequencing (penentuan urutan DNA),untuk mendeteksi ada atau

tidak adanya gen untuk membantu mengidentifikasi patogenselama infeksi, dan

saat membuat profil DNA forensik dari sampel kecil DNA.

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat

menaikkandan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR.

Penggunaan metodePCR diperlukan empat komponen utama, yakni DNA

cetakan, oligonukleotida primer,deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri

dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan enzimpolimerase yang digunakan untuk

mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. PCR melibatkan proses pemanasan dan

pendinginan yang disebut siklus termal yang dilakukan oleh mesin.

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30- 40

siklus dan berlangsung dengan cepat :

9
 1. Denaturasi

Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq

polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses

pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung

sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA

untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami

renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan

gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi

aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh

lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC.

2. Annealing (penempelan primer)

Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah

bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan

untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing

primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan

mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi

efisiensi PCR.. Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45

detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran

temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36oC sampai dengan 72oC,

namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60oC.

3.Pemanjangan Primer (Extention)

Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA

primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu

10
72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi

garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang

2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan

primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini

diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk

DNA untai ganda.

Konsep dasar PCR digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat

banyaksalinan (amplify atau memperkuat) bagian kecil dari DNA atau gen. PCR

memungkinkan untuk menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan bagian tertentu dari

DNA dari jumlah yangsangat kecil dari DNA. Metode PCR ini digunakan untuk

melipat gandakan molekul DNA,akan tetapi dalam perkembangannya dapat

digunakan untuk melipat gandakan molekul RNA. Metode PCR dapat melipat

gandakan fragmen molekul DNA menjadi molekul DNA(110 bp/5×10-19) sebesar

200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit.

Reagent ada 4,yaitu Red Master Mix yang berfungsi untuk mensintesis 2 untai

DNA baru.Primer F dan R yang berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang

akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3'

yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA.Ddh2O berfungsi agar DNA tidak

berada dalam kondisi kering yang dapat menganggu proses sintesis DNA oleh enzim

Taq Polimerase.

Control (-) sangat dibutuhkan dalam pengerjaan PCR karena untuk melihat

apakah pekerjaan yang kita lakukan steril atau tidak.Apabila tidak steril tidak akan

11
muncul band DNA dan harus dilakukan pengulangan dalam percobaan.Selain itu juga

berfungsi untuk menvisualisasikan DNA,dan mengurangi kerugian.

12
 BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat di ambil adalah :

1. PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim
polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah
proses pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal
2. Metode identifikasi genetik menggunakan metode pcr telah banyak
berkembang, serta telah dilakukan pada berbagai organisme laut, antara lain
berbagai karang keras, serta berbagai invertebrata laut
3. Real time pcr adalah teknik yang digunakan untuk memonitor progress reaksi
pcr pada waktu yang sama. Rt-pcr juga dikenal sebagai quantitative pcr (qpcr)
4. Metode berbasis pcr sering kali digunakan di dalam identifikasi organisme,
baik melalui DNA fingerprinting maupun melalui DNA barcoding
5. Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction
(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipat gandakan
suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro.

5.2 Saran
Pada praktikum kali ini sudah sangat bagus, penjelasannya mudah dimengerti

dan juga cara mengajarnya asik. Semoga kedepannya tetap seperti ini

13
 DAFTAR PUSTAKA

Joshi Mohini, Deshpande 2011. Polymerase Chain Reaction: Methods, Principles and

Application. International Journal of Biomedical Research Vol 2 No. 81-97

Department of Anatomy, Rural Medical College, Pravara Institute of Medical
Sciences, Loni, Maharashtra, India

Mufty MM. 2018. Application of a real time PCR methode for detection of
Salmonella spp. in shrimp and scallop and its partial validation. Fisheries
Training Programme. The United Nation University. Iceland.

Newton, C.R. and A. Graham. 2015. PCR. UK: Bios Scientific Publisher.

Don R, Cox P, Wainwright B, Baker K, Mattick J. 2013 "'Touchdown' PCR to

circumventspurious priming during gene amplification". Journal of Nucleic

Acids ResVol.19 (14): 4008.

14
 LAMPIRAN
Lampiran dokumentasi

Gambar 1.Vortex Gambar 2. Ddh2O Gambar 3. Sensoquest

Gambar 5. Suhu Tahapan PCR

Gambar 6. Red Stain

Gambar 7. Primer F Gambar 8. Primer R

15