MAKALAH BIOTEKNOLOGI

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Diajukan untuk memenuhi tugas mata kuliah Bioteknologi

Tahun akademik 2021

Oleh
Kelompok 2/Perikanan B
Haztry Hakkinia Dewi 230110190044
Jasmine Priyanka B 230110190045
Silvana Wahyu Nurkartika 230110190048
Raihan Ichsan Riswandi 230110190059
Ahmad Syahid 230110190061
Arkan Naufal Rasyiq 230110190063
Abiomi Ciptoning Bentali 230110190068
Eka Muhammad Rizaldi 230110190073
Valenda Pringgandani 230110190079

UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI PERIKANAN
JATINANGOR

2021
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami haturkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, sehingga
kami dapat menyelesaikan makalah yang berjudul “Polymerase Chain Reaction
(PCR)”. Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk memenuhi salah satu tugas
mata kuliah Bioteknologi.
Di dalam makalah ini membahas mengenai Polymerase Chain Reaction
(PCR) yang merupakan salah satu hasil dari berkembangnya zaman yang
dihasilkan oleh Bioteknologi, sehingga pada makalah ini akan diberikan informasi
Polymerase Chain Reaction (PCR).
Pada kesempatan ini kami tidak lupa mengucapkan terima kasih kepada :
1. Dosen mata kuliah Bioteknologi;
2. Seluruh anggota kelompok 2;
3. Pihak-pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
Demikianlah harapan kami, semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi
kami dan juga pembaca tentunya. Adanya saran yang membangun dari pembaca
untuk perbaikan makalah selanjutya sangat dihargai, kami ucapkan terima kasih.

Cimahi, 21 Februari 2021

Kelompok 2
 DAFTAR ISI

BAB Halaman

KATA PENGANTAR..................................................................................ii
DAFTAR GAMBAR...................................................................................iv
I PENDAHULUAN.........................................................................................1
1.1 Latar Belakang......................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah.................................................................................2
1.3 Tujuan...................................................................................................2
II PEMBAHASAN............................................................................................3
2.1 Sejarah PCR..........................................................................................3
2.2 PCR Perikanan......................................................................................4
2.3 Prinsip PCR...........................................................................................7
2.4 Teknik PCR.........................................................................................11
2.5 Kelebihan dari PCR…………………………………………………16
2.6 Kekurangan dari PCR……………………………………………….16
III PENUTUP...................................................................................................17
3.1 Kesimpulan.........................................................................................17
3.2 Saran....................................................................................................17
DAFTAR PUSTAKA...................................................................................v
 DAFTAR GAMBAR

No. Judul Halaman

1. Prinsip PCR..................................................................................................7
2. Denaturasi DNA Template...........................................................................8
3. Penempelan Primer (Annealing)..................................................................8
4. Polimerisasi DNA (Extention).....................................................................9
5. Siklus PCR.................................................................................................10
6. Thermal Cycler..........................................................................................10
7. Nested PCR................................................................................................14
8. In situ PCR.................................................................................................15
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Semakin pesatnya perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi pada
saat ini dapat kita rasakan bersama, dimana dengan perkembangan ilmu
pengetahuan dan teknologi membawa banyak kemajuan dalam berbagai aspek
kehidupan. Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering
diterapkan adalah bioteknologi. Sebagaimana kita ketahui bersama bahwa
bioteknologi adalah pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah serta rekayasa terhadap
organisme, sistem, atau proses biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan
potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup
manusia.
Bioteknologi dapat dikelompokan menjadi dua, yaitu bioteknologi
tradisional dan bioteknologi modern. Dalam kehidupan sehari-hari mungkin kita
sudah tidak asing dengan istilah bioteknologi tradisional karena dalam
penerapannya telah banyak dilakukan dalam kegiatan sehari-hari. Bioteknologi
tradisisonal merupkan bioteknologi yang memanfaatkan mikroba, proses
biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Beberapa produk pangan
hasil dari penerapan bioteknologi tradisional adalah tempe, oncom, yoghurt, dan
keju. Seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan kemajuan teknologi,
maka terbentuklah istilah bioteknologi modern dimana bioteknologi modern
merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA
yang dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada
organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan.
Salah satu bentuk dari bioteknologi moderen yang tengah berkembang saat
ini adalah teknik PCR atau Polymerase Chain Reaction. PCR (Polymerase Chain
Reaction) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro.
Dengan diketemukannya teknik PCR dan teknik-teknik lain yang erat kaitannya
dengan DNA, mampu menjadi sebuah revolusi pada bidang sains dan teknologi

1
khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran naytaafnforensik dan
evolusi

2
 3

molekular. Melihat dari banyaknya manfaat yang dapat tercipta maka diperlukan
pemahaman dan pengembangan ilmu pengetahuan pada bidang tersebut.

1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dari makalah ini adalah:
1 Apa yang dimaksud dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)?
2 Bagaimana sejarah terciptanya PCR (Polymerase Chain Reaction)?
3 Bagaimana prinsip dari PCR (Polymerase Chain Reaction)?
4 Bagaimana teknik dari PCR (Polymerase Chain Reaction)?
5 Kelebihan dari PCR
6 Kekurangan dari PCR

1.3 Tujuan
Tujuan dari penyusunan makalah ini adalah untuk memberikan
pengetahuan dan pemahaman yang lebih terkairt dengan PCR (Polymerase Chain
Reaction) pada bidang perikanan guna menambah wawasan pada mahasiswa
perikanan dalam bidang bioteknologi. Pembahasan yang tercantum dalam
makalah ini terkait pada pengertian, sejarah, perinsip, dan teknologi dari PCR
(Polymerase Chain Reaction).
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Sejarah PCR

Pada mulanya teori dasar Polymerase Chain Reaction pertama kali telah
dikemukakan secara rinci oleh Kleppe dkk pada tahun 1971. Tetapi teori tersebut
tidak membangkitkan perhatian dan tidak menarik kepentingan umum. Sampai
pada pertengahan tahun 1980 ketika sarjana Kary B Mullis dan kawan –
kawannya di Cetus mengembangkan PCR ke dalam suatu cara yang dapat
digunakan untuk menghasilkan sejumlah besar kopi gen dari DNA tunggal
(Kumala 1999).
Enzim yang pertama – tama digunakan dalam proses PCR yaitu DNA
polimerase dari fragmen Klenow yang dipanen dari bakteri E coli. Enzim tersebut
digunakan oleh Saiki et al pada tahun 1985, Mullis et al pada tahun 1986, Mullis
dan Faloona pada tahun 1987. Tetapi karena enzim ini tidak tahan terhadap suhu
yang panas. Sedangkan proses PCR memerlukan suhu yang tinggi, sehingga perlu
terus ditambahkan enzim tersebut selama proses berlangsung (Kumala 1999).
Kemudian pada tahun 1988 Saiki dan kawan – kawan menemukan enzim
lain yang lebih stabil yaitu DNA polimerase yang diekstraksi dari bakteri
Thermus aquaticus yang bersifat termofilik. Enzim ini dikenal dengan sebutan
Taq Polymerase, bekerja optimal pada suhu 75ºC dan masih stabil pada suhu 94ºC
- 95ºC, dengan penemuan enzim ini, proses PCR menjadi lebih mudah.Selain
enzim tersebut juga ditemukan enzim polimerase lain yang lebih tahan panas yaitu
Vent DNA Polymerase yang diisolasi dari Thermococcus litoralis (Kumala 1999).
Pada tanggal 10 Desember 1993, Kary Mullis menerima hadiah Noble
bidang Kimia dari Raja Carl XVI Gustaf dari Swedia atas penemuannya tentang
reaksi berantai polimerase. Mullis telah menerbitkan dan mematenkan karyanya
pada tahun 1985. Aplikasi metode ini telah merevolusi ilmu dasar dan ilmu
terapan, yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR) menyediakan cara yang sangat
sensitif untuk memperkuat sejumlah kecil DNA. Perkembangan teknik ini
menghasilkan ledakan teknik baru dalam biologi molekuler karena semakin

4
banyak aplikasi metode ini diterbitkan. Teknik itu dimungkinkan oleh penemuan
Taq polimerase

5
 6

diperoleh dari Thermus auquaticus. DNA polimerase ini stabil di suhu tinggi perlu
melakukan amplifikasi, sedangkan polimerase DNA lainnya menjadi
terdenaturasi. Mullis mendefinisikan PCR bukan sebagai teknik spesifik
melainkan sebagai sebuah konsep. Karena teknik ini melibatkan amplifikasi DNA,
penerapan metode yang paling jelas adalah dalam mendeteksi jumlah DNA
spesifik yang sangat kecil. Ini penting dalam pendeteksian level rendah infeksi
bakteri atau perubahan cepat dalam transkripsi pada tingkat sel tunggal, serta
deteksi DNA individu tertentu. Ini juga dapat digunakan dalam pengurutan DNA,
skrining untuk kelainan genetik, situs mutasi spesifik DNA, atau kloning atau
subkloning Cdna (Mousumi et al, 2010).
Pengklonaan DNA dalam setiap sel merupakaan metode terbaik untuk
mempersiapkan gen tertentu atau skuens DNA lain dalam kuantitas besar. Akan
tetapi, ketika sumber DNA hanya sedikit atau tidak murni, reaksi berantai
polimerase, atau polymerase chain reaction (PCR), lebih cepet dan lebih selektif.
Dalam teknik ini, segmen sasaran spesifik apapun di dalam satu atau banyak
molekul DNA dapat dengan cepat diamplifikasi (diperbanyak atau disalin berkali
– kali) dalam tabung reaksi. Dengan otomatisasi, PCR dapat membuat miliaran
salinan segmen sasaran DNA dalam beberapa jam, jelas jauh lebih cepat daripada
waktu berhari – hari yang dibutuhkan untuk memperoleh jumlah salinan yang
sama dengan menapis pustaka DNA untuk menemukan klona dengan gen yang
dikehendaki dan membiarkan gen itu bereplikasi di dalam sel inang. Bahkan, PCR
semakin banyak digunakan untuk membuat cukup banyak fragmen DNA spesifik
yang disipkan secara langsung ke dalam vektor, sepenuhnya melewatkan langkah
– langkah pembuatan dan penapisan pustaka (Campbell 2008).

2.2 PCR Perikanan

Suatu proses sintesis enzimatik untuk melipat gandakan suatu sekuens
nukleotida tertentu secara in vitro, merupakan pengertian dari Polymerase Chain
Reaction (PCR) atau dapat disebut dengan reaksi polymerase berantai. Kary B.
Mulis adalah yang pertamakan mengembangkan metode PCR ini pada tahun
1985. Pada awalnya metode PCR ini dikembangkan dengan maksud digunakan
untuk melipat gandakan molekul DNA, namun dalam perkembangannya lebih
 7

lanjut metode ini dapat digunakan untuk melipat gandakan dan melakukan
kuantitas molekul mRNA. Sehingga kini metode PCR ini telah banyak digunakan
dalam berbagai bidang guna berbagai macam analisis genetic dan manipulasi.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode perbanyakan
atau replikasi DNA secara enzimatik tanpa menggunakan bantuan dari
organisme. PCR adalah reaksi polimerase berantai yang melibatkan enzim
polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Dimana proses pemisahan untai
ganda dari DNA menjadi untai tunggal yang dilakukan secara berulng-uleng.
Dengan teknik PCR ini maka dapat dihasilkan DNA dalam jumlah yang besar
dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang
menggunakan DNA. Funsi utama dari perkembangan teknik atau metode PCR ini
adalah dengan menentukan cara imflikasi hanya pada urutan DNA target dan
meminimalisir imflikasi urutan non-target. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh
2n kali banyaknya DNA target. Penggunaan teknik atau metode PCR ini mampu
meningkatkan jumlah urutan DNA menjadi ribuan atau jutaan kali dari jumlah
semula. Proses hibridisasi primer yang mengawali replikasi DNA akan
dilanjutkan dengan penambahan basa oleh enzim polymerase pada cetakan DNA.
Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali
jumlahnya. sekitar 106-107 kali.
Pada penerapan teknik atau metode PCR ini telah banyak dilakukan dalam
bidang biokimia dan biologi molecular. Hal ini dikarenakan dalam penerapannya
teknik atau metoda PCR hanya memerlukan jumlah sample yang kecil dan
biayanya relative murah. Selain kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan
amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas
penggunaannya. Dengan semakin pesat dan banyaknya dilakukan pengembangan
baik dalam ilmu pengetahuan mengenai DNA dan teknologi yang semakin
canggih guna menyeimbangkan kemajuan ilmu pengetaguan telah banyak
merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit
genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular.

Jenis PCR
Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya:
 8

1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); metode ini

digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model
derifat dari perbedaan DNA.
2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal
yang diketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang memotong
bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi yang
dihasilkan ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan
menggunakan sekuen primer yang memiliki titik ujung yang memiliki
jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen eksternal yang telah
tergabung. Metode ini khusus digunakan untuk mengidentifikasi ”sekuen
antara” dari beragam gen.
3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi
pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak
diperlukan. Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set
kedua mengamplifikasi target kedua selama proses pertama berlangsung.
Sekuens DNA target dari satu set primer yang disebut primer inner
disimpan di antara sekuens target set kedua dari primer yang disebut
sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama dari PCR
menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua dilakukan dengan
inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk reaksi
yang pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer akan menyatu
dengan produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk yang lebih
pendek daripada produk yang pertama.
4. Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil
produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur
kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode
ini juga menampilkan copy dari sampel
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk amplifikasi,
isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA. Metode ini
dibantu oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi cDNA),
 9

mencakup pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen

diekspresikan.
6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) bertujuan untuk
mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan
oleh Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan
teknik PCR menggunakan primer – primer dengan sequens acak untuk
keperluan amplifikasi lokus acak dari genom.

2.3 Prinsip PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode rutin yang
digunakan untuk perbanyakan (amplifikasi) fragmen DNA secara invintro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh dua primer oligonukleotida. Metode PCR
menggunakan prinsip perubahan temperature untuk mendenaturasi DNA,
menempelkan primer oligonukleotida dan polimerisasi DNA dengan bantuan
enzim DNA polymerase termostabil.
Prinsip:

Gambar 1. Prinsip PCR

 10

1. Denaturasi

Gambar 2. Denaturasi DNA Template

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka

menjadi 2 untai tunggal. Hal ini disebabkan suhu denaturasi yang tinggi
dapat menyebabkan putusnya ikatan hydrogen diantara basa-basa yang
komplemen. Pada tahap ini seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya
reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya
dilakukan antara suhu 90 ᵒC – 95 ᵒC.
Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses
denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi
DNA templat umumnya dilakukan selama 30 – 90 detik, ini semua
tergantung pada DNA templat yang digunakan. Waktu denaturasi yang
terlalu lama akan merusak templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan
aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu
pendek akan menyebabkan proses denaturasi tidak sempurna.
2. Penempelan primer (annealing)

Gambar 3. Penempelan Primer (Annealing)

 11

Pada tahap ini primer akan menuju daerah yang spesifik yang
komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ikatan hydrogen
akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat.
Proses ini dilakukan pada suhu 45 ᵒC – 60 ᵒC.
Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan Panjang
primer. Untuk panjang primer 18 – 22 basa cukup dengan 30 detik,
sedangkan untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu
annealing 60 detik.
3. Polimerisasi DNA (extension)

Gambar 4. Polimerisasi DNA (Extention)

Reaksi polimerisasi terjadi pada suhu 72 ᵒC. Primer yang telah

menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan
penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA
polymerase.
Pemilihan waktu ekstensi primer tergantung pada panjang fragmen
DNA yang akan diamplifikasi. Secara umum untuk mengamplifikasi
setiap satu kilo basa DNA diperlukan waktu 30 – 60 detik.
 12

Gambar 5. Siklus PCR

Jika siklus PCR dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh
dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplicon yang berupa
untai ganda), sehingga mencapai jumlah kopi yang dapat dirumuskan dengan
(2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA.
Jadi seandainya ada 1 kopi DNA sebeum siklus berlangsung, setelah satu siklus,
akan menajdi 2 kopi, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan
menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara
eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polymerase pada akhir
dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’
dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat
dikloning dengan menggunakan vector yang ditambahkan nukleotida T pada
ujung-ujungnya 5’-nya. Proses PCR diakukan menggunakan alat yang disebut
thermocycler.
 13

Gambar 6.Thermal Cycler

Thermal Cycler juga dapat digunakan di laboratorium untuk memfasilitasi
reaksi lain yang membutuhkan reaksi yang sensitif terhadap suhu, termasuk reaksi
enzim restriksi atau diagnosa yang cepat. Perangkat ini dilengkapi dengan blok
termal dengan lubang yang dapat menampung tabung reaksi (tube) dimana yang
menampung reagensia. Thermal Cycler kemudian mengontrol suhu, naik dan
turun sesuai dengan program yang dimasukan kedalam komputer PCR tersebut,
sehingga proses polymerase chain reaction (PCR) terjadi.

2.4 Teknik PCR

Adapun teknik dalam PCR ini ialah:
1. Teknik PCR simpleks (tunggal)
Merupakan suatu teknik dalam PCR yang menggunakan uji pada
satu target sampel uji tunggal.
2. Teknik PCR dupleks (ganda)
Merupakan suatu teknik dalam PCR yang menggunakan uji pada
DNA sampel yang diamplifikasi isolasi. Duplex PCR merupakan
pengembangan dari PCR yang dapat digunakan untuk mendeteksi dua
jenis gen dalam satu kali running. Penggunaan metode ini memiliki
keuntungan lebih praktis, hemat waktu, dan biaya jika dibandingkan
dengan single PCR atau uniplex PCR. Beberapa peneliti telah
menggunakan teknik dPCR untuk deteksi patogen, misalnya Yasmon et al.
 14

(2010) menggunakan dPCR untuk deteksi secara simultan Legionella

species dan Legionella pneumophila pada sampel air di Jakarta.
3. Elektroforesis gel
Merupakan suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip
kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak
menuju kutub positif (anoda), sedangkan partikel-partikel bermuatan
positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anoda).
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.
Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang
merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan
potonganpotongan jumlah pasangan basanya (Klug dan Cummings 1994).
Teknik elektroforesis menggunakan medium yang terbuat dari gel.
Perpindahan partikel pada medium gel dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan,
kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka
pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel
mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-
partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut. Di dalam
elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk
elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan
buffer (buffer ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan
gel (Brown 1992).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran
dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu,
elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan
untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya,
mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang
diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk
 15

mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA
tertentu (Klug dan Cummings 1994).
4. Real – Time PCR
Prinsip kerja Real – Time PCR ialah dengan mendeteksi dan
mengkuantifikasi reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat
seiring dengan bertambahnya amplifikasi DNA PCR dalam reaksi. Reaksi
selama fase eksponensial dapat dipantau dengan mencatat jumlah emisi
fluoresen pada setiap siklus.
Real – Time PCR adalah teknik yang digunakan untuk
mengendalikan DNA target dari suatu organisme yang bertujuan untuk
mengetahui kualitas DNA target. Analisis menggunakan Real time PCR
memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik untuk produk PCR tertentu.
Real Time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan
secara Real Time menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara
langsung pada waktu bersamaan. Komponen utama Real Time PCR adalah
thermal cycler (mesin PCR), optical modul (pendeteksi fluoresensi selama
reaksi) dan komputer (membaca dan memindahkan data fluoresensi ke
layar monitor, serta dapat disimpan dalam berkas).
5. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
merupakan suatu modifikasi dari metode teknik PCR Konvensional. Cara
kerja dari metode ini ialah menggunakan molekul RNA sebagai template
lalu dikonvermasi menjadi DNA Komplementer (cDNA) sebelum
diperbanyak (amplifikasi). Dalam konversi dari RNA menjadi cDNA
digenerasi menggunakan enzim reverse transcriptase, sehingga dapat
menjadi template reaksi. Tipe ini biasa digunakan dalam metode penelitian
penyisipan gen, diagnosa penyakit yang berhubungan dengan virus RNA
dan kanker.
6. Nested PCR
Metode ini merupakan suatu teknik replikasi sampel DNA
menggunakan bantuan enzim DNA polimerase yang menggunakan dua
 16

pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen DNA. Dengan

menggunakan metode ini, kita dapat mengamplifikasikan kembali jika ada
fragmen yang salah diamplifikasi, dikarenakan bagian yang salah akan
diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Metode ini
sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.

Gambar 7. Nested PCR

Pasangan primer pertama mengamplifikasi fragmen DNA dengan

cara kerja yang mirip dengan PCR pada umumnya sedangkan pasangan
primer kedua atau nested primer akan mengamplifikasi fragmen DNA dari
produk PCR pertama sehingga hasil fragmen yang diperoleh lebih pendek
dari yang pertama (Anonim 2009). Penelitian di Indonesia yang juga
menggunakan metode nested PCR antara lain penelitian untuk mengetahui
tingkat prevalensi malaria burung pada populasi liar Gelatik Jawa (Yuda
2009) dan prevalensi malaria Burung Madu Sriganti (Rakan 2010).
7. In situ PCR
In situ PCR adalah teknik molekuler baru, yang menggabungkan
sensitivitas ekstrim PCR dengan lokalisasi seluler yang disediakan oleh in
 17

situ hybridization (ISH), melalui amplifikasi urutan gen tertentu dalam sel
utuh atau bagian jaringan dan meningkatkan nomor salin ke tingkat yang
dapat dideteksi oleh ISH atau imunohistochemistry. Selain deteksi DNA
virus (CMV, HBV, HIV), teknik ini digunakan untuk mempelajari
pengaturan ulang DNA, translokasi kromosom dan RNA virus (HCV)
dalam sel-sel dalam suspensi, persiapan cytocentrifuge atau bagian
jaringan arsip. Berdasarkan penelitian yang dilakukan dalam
membandingkan pendekatan yang berbeda dengan amplifikasi situ urutan
target dan visualisasi produk PCR baik dengan ISH berikutnya (Indirect In
situ PCR) atau dengan deteksi langsung nukleotida berlabel, yang telah
dimasukkan selama PCR (Direct In situ PCR).

Gambar 8. In situ PCR

Hasil menunjukkan, bahwa In situ PCR mencakup sejumlah teknik

yang berbeda, yang tidak sama berlaku untuk semua jenis sampel. In situ
PCR tampaknya paling efektif untuk deteksi DNA dalam persiapan sel
tunggal dengan fiksasi dan pre treatment yang terkontrol, meskipun
kuantifikasi hasil tetap bermasalah. Gangguan yang disebabkan oleh difusi
dan extra cellular generasi produk PCR adalah masalah signifikan yang
 18

berpotensi menyebabkan hasil positif palsu. In situ PCR bekerja kurang

efisien di bagian jaringan arsip karena kualitas asam nukleat yang buruk
dan retensi produk PCR. In situ PCR menghasilkan hasil yang kurang
spesifik daripada Indirect In situ PCR dan membutuhkan kontrol tambahan
seperti kelalaian primer dalam campuran reaksi untuk mendeteksi
gangguan.

2.5 Kelebihan dari PCR

Ada beberapa manfaat yang bisa didapatkan dengan penggunaan metode

PCR. Pertama, PCR merupakan sebuah teknik sederhana dalam penggunaan dan
pentafsirannya. PCR juga membutuhkan waktu yang singkat dan mengeluarkan
hasil secara rapid. Teknik ini sangat sensitif dan berpotensial untuk menghasilkan
jutaan salinan dari sebuah produk untuk mengalami sequencing, kloning, dan
analisis. PCR juga memiliki sensitivitas yang lebih tinggi bila dibandingkan
dengan kultur dan staining dalam mendeteksi organime umum, seperti bakteria
dan virus.

2.6 Kekurangan dari PCR

Pemeriksaan dengan PCR memiliki kekurangan diantaranya adalah proses

PCR harus diawali dengan preparasi sampel yang cukup rumit dan reagen yang
mahal. Proses PCR memerlukan mesin pengatur suhu (thermal cycler) dan waktu
relatif lebih lama dari LAMP, yaitu sekitar 3 – 4 jam untuk 35 siklus. Hasil PCR
tidak dapat dilihat secara langsung, harus diproses lagi denganelektroforesis dan
dilihat dengan alat gel documentation. Pemeriksaan dengan PCRtidak dapat
membedakan apakah parasit dalam tubuh masih hidup atau sudah mati (Sudjadi
2008).
 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode enzimatis untuk
amplifikasi DNA dengan cara in vitro. Pada proses PCR diperlukan beberapa
komponen utama, yaitu DNA cetakan, Oligonukleotida primer,
Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA Polimerase, dan Komponen
pendukung lain adalah senyawa buffer. Pada proses PCR menggunakan
menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki kemampuan untuk
memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur temperatur
untuk tiap tahapan reaksi. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983
dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut.
Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40
siklus dan berlangsung dengn cepat yaitu denaturasi, anneling, dan pemanjangan
untai DNA. Dalam proses PCR terdapat beberapa tahapan yang meliputi :
denaturasi DNA template ; Penempelan primer pada template (annealing) ;
Pemanjangan primer (Extension). Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal
ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Masalah yang
berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi.

3.2 Saran
Seiringan dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang
kian pesat membutuhkan SDM atau sumberdaya manusia yang semakin maju dan
inovatif dalam mengembangkan ilmu pengetahuan dan teknologi guna membantu
dan mempermudah kegiatan manusia. Bioteknologi menupakan salah satu dari
sekian banyaknya ilmu yang terus berkembang pesat karena perannya yang sangat
bermanfaat dalam kehidupan manusia. Oleh karena itu perlu bagi kita semagai
generasi muda untuk terus belajar dan mengerti juga memahami setiap ilmu yang
kita pelajari.

19
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, F.E. 2002. Detection of genetically modified organisms in foods. Trends

Biotechnol. 20(5):215–223.
Brown, T. A. 1992. Molecular Biology. Academic Press. Oxford.

Campbell, Neli A., Jane B. Reece. 2008. Biologi. Erlangga : Jakarta.

Gaffar, Shabarni. 2012. Bioteknologi Molekul Aplikasi dan Teori. Widya

Padjadjaran. Bandung

Garibyan, Lilit., Nidhi, Avashia. 2013. Research Techniques Made Simple:

Polymerase Chain Reaction (PCR). J Invest Dermatol. Maret 2013. Vol.

133. No. 3. Diakses dari
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/ pada 28 Februari
2021.

Gurakan, G.C., G. Aydin, and R. Yilmas. 2011. Qualitative detection of GM

maize (BT11) in food and feed sold commercially in Turkey by PCR based
methods. Indian J. Biotechnol. 10:143–146.

Handoyo, Darmo., Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction (PCR). Universitas Surabaya.

Innis, M.A.(Eds.). 1990. PCR Protocols a Guide to Methods and Applications.

California: Academic Press, Inc..

Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice

Hall, Englewood cliffs

Kumala, Widyasari. 1999. Polymerase Chain Reaction : Uji Molekuler Di Masa

Depan. 12 (1) : 8 – 14.

Liu, Harry Y., Hopping, Grant C., Vaidyanathan, Uma., Ronquillo, Yasmyne C.,

Hoopes, Phillip C., Majid Moshirfar. 2019. Polymerase Chain Reaction and
Its Apllication in the Diagnosis of Infectious Keatitis. Med Hypothesis
Discov Innov Ophthalmol. Vol. 8 No. 3. Diakses dari
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6778471/ pada 28 Februari
2021.

Mahardika, I.G. Ngurah K. 2005. Polymerase Chain Reaction. Jurnal Veteriner

Vol.4 No. 1. Bali.

v
Mousumi, Debnath., Prasad GBKS., Bisen PS. 2010. Polymerized Chain
Reaction. 9 : 129 – 152.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda.

Bogor.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kanisius. Yogyakarta.

Zuhriana K Yusuf. 2010. Saintek vol 5, N0 6, Tahun 2010 Polimerase Chain

Reaction (PCR).

vi