MAKALAH INSTRUMENTASI LABORATORIUM

THERMOCYCLER (PCR)

D
I
S
U
S
U
N
O
L
E
H
Kelompok 6
1. Gita Nada Hartawan PO7134223005
2. Sally Marfira PO7134223008
3. Febry NurFadillah PO7134223017
4. Cici Holiffa Sari PO7134223030
5. Farin Dwi Safira PO7134223034

Dosen Pembimbing

1
 KATA PENGANTAR

Puji syukur atas kehadirat Allah SWT karena atas

karuniadan rahmat-Nya Lah kami dapat menyelesaikan
tugasmata kuliah Instrumentasi yang berjudul "
THERMOCYCLER (PCR)” ini.
Kami menyadari bahwa makalah ini sangat jauh dari kata
sempurna, maka dari itu kami mengharapkan kritikan dan
saran agar sempurnanya makalah iniSemoga makalah ini
dapat memberikan manfaat kepada kita semua. Aamiin.

Palembang , Oktober 2023

Penulis

2
 Daftar Isi

Kata Pengantar...................................................................................................
DaftarIsi.......................................................................................................

BAB 1 Pendahulian............................................................................................
A.Latar Belakan.......................................................................................
B...Rumus Masalah.....................................................................................
C...Tujuan...................................................................................................
D...Manfaat..................................................................................................

BAB II Pembahasan..............................................................................................
Cara Penggunaan................................................................................…..

BAB III Penutup..................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA.....................................................................................

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

3
 Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang
semakin pesat.Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang
sering diterapkan adalah bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan
berbagai prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, sistem, atau proses
biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan potensi organisme maupun
menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia. Secara umum
bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan
bioteknologi modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang
memanfaatkan mikroba, proses biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara
alami. Bioteknologi tradisional ini terus mengalami perkembangan hingga
ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan lainnya.Dengan
ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan tentang DNA,
muncullah istilah bioteknologi modern.

Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada

manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi
DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada
organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Produk dari
bioteknologi modern, misalnya insulin, kloning domba Dolly, antibodi
monoklonal.Dalam aplikasinya, bioteknologi menerapkan berbagai macam disiplin
ilmu. Disiplin ilmu tersebut antara lain: mikrobiologi (tentang mikroba), biologi sel
(tentang sel), genetika (tentang pewarisan sifat makhluk hidup), dan biokimia
(tentang makhluk hidup dilihat dari aspek kimianya). Salah satu pokok bahasan
yang penting untuk di pahami yaitu mengenai Polymerase Chain Reaction atau yang
lebih dikenal dengan istilah PCR.PCR adalah suatu metode in vitro untuk
menghasilkan sejumlah fragmen DNA spesifik dengan panjang dan jumlah skuens
yang telah ditentukandari jumlah kecil template kompleks.
PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan dapat diaplikasikan
dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, genetika populasi, dan analisis
forensik. Mengingat peningnya peranan teknik PCR ini terhadap perkembangan

4
 ilmu pengetahuan kedepan, maka dalam makalah ini akan dibahas tentang teknik
PCR, prinsip-prinsip PCR, pertimbangan penggunaan PCR, dan manfaat PCR.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan H. pylori?
2. Apasaja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)?
3. Alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction
(PCR)?
4. Apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase Chain
Reaction (PCR)?
5. Apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?
6. Apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?

7. Bagaimana mendeteksi H. Pylori dengan menggunakan metode (PCR).

8. Apa saja peralatan,bahan dan prosedur yang digunakan dalam proses (PCR)?

1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction
(PCR) dan H. pylori.
2. Untuk mengetahui apa saja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR).
3. Untuk mengetahui alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase
Chain Reaction (PCR).
4. Untuk mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses
Polymerase Chain Reaction (PCR).
5. Untuk mengetahui apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR).
6. Untuk mengetahui apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR).
7. Untuk mengetahui cara mendeteksi H.pylori menggunakan metode (PCR).
8. Untuk mengetahui peralatan,bahan dan prosedur yang digunakan dalam
proses (PCR).

5
 BAB II
PEMBAHASAN

6
2.1 Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR) dan H. pylori

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR

(Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini
dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang
biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah
sampel yang kecil. Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses
sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR
dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali
jumlahnya. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara
amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan
non-target.

Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo,
yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan
primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA
polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak
menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan
dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase
dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu
campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens
DNA yang diinginkan.

Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan
untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer

7
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target
DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA
yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.

PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan

menggunakan dua oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung 5’dari
dua untaian skuen target.Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer
PCR) untuk memungkikan DNA template dikopi oleh DNA polimerase.Untuk
mendukung terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali diperlukan
untuk memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan.
Hampir semua aplikasi PCR mempekerjakan DNA polimerase yang stabil terhadap
panas, seperti polimerase Taq. Awalnya enzim diisolasi dari bakteri Aquaticus
Thermus. DNA polimerase enzimatis ini merakit sebuah untai DNA baru dari
pembangunan blok DNA, nukleotida , dengan menggunakan DNA beruntai tunggal
sebagai template dan oligonukleotida DNA (juga disebut primer DNA ), yang
dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR menggunakan
siklus termal , yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan sampel PCR untuk
serangkaian langkah pasti suhu.

Langkah-langkah siklus termal yang diperlukan pertama yang secara fisik

memisahkan dua helai dalam heliks ganda DNA pada suhu tinggi dalam proses yang
disebut DNA leleh .Pada suhu yang lebih rendah, masing-masing untai kemudian
digunakan sebagai template dalam sintesis DNA oleh polimerase DNA untuk
selektif memperkuat DNA target.Selektivitas hasil PCR dari penggunaan primer
yang komplementer ke wilayah yang ditargetkan untuk amplifikasi DNA di bawah
kondisi spesifik siklus termal.

Helicobacter pylori (H. pylori) adalah suatu bakteri yang menyebabkan

peradangan lapisan lambung yang kronis (gastritis) pada manusia. Bakteri ini juga
adalah penyebab yang paling umum dari borok-borok (ulcers) diseluruh dunia.

8
 H. pylori adalah bakteri Gram negatif, berbentuk spiral dengan panjang 2,5-
5,O pm dan lebar 0,5-1,O pm, mempunyai 4-6 flagela pada ujung selnya dan pada
setiap ujung flagela terdapat bulb, bergerak aktif seperti pembuka tutup botol, dan
tidak membentuk spora. Bakteri ini mengalami adaptasi untuk dapat hidup dalam
mukus lambung yang bersuasana asam kuat (pH asam lambung berhsar antara 1,7-
2,O) dengan cara menghasilkan enzim urease yang sangat kuat dan akan
memecahkan urea yang ada dalam mukus lambung menjadi amonia dan bikarbonat
yang bersifat busa2. Sel bakteri H. pylori akan diliputi awan amonia yang terbentuk
sehingga dapat bertahan hidup dalam suasana asam.Bakteri ini juga menghasilkan
protease yang mempengaruhi mukosa lambung yang mengakibatkan menurunnya
kemampuan asam lambung berdifusi melewati lendir. H. pylori berbentuk
pleomorfik, yaitu dapat ditemui dalam beberapa bentuk. Dalam lambung keadaan
normal akan berbentuk spiral atau batang bengkok.

2.2 Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat,
penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA.
Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal
DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan primer dan
tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-95°C
selama beberapa menit. Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah
sebagai berikut:

 Denaturasi.

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi

dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi
menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang
komplemen.Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi
polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.Denaturasi biasanya dilakukan antara
suhu 90 C – 95̊ C.
9
 Penempelan Primer.
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah
yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing
ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen
pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC – 60oC.
Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen
tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila
dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.
 Reaksi Polimerisasi (extension).

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada

suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan
pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat
oleh DNA polimerase.

Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh

dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang
berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan
dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal
molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung,
setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4,
sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini
akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq
DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan
satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga
nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang
ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya.Proses PCR dilakukan
menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.

10
 Gambar 01.Proses Amplikasi Secara Eksponensial.

Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan
berikut:

 Pra-Denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan

denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau
dipanaskan terlebih dahulu).

 Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit
untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara
sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.

11
 Gambar 02. Siklus Polymerase Chain Reactions (PCR)

2.3 Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro
antara lain :

1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan

diamplifikasi
2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing
sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP
campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat
dNTP terpisah yang digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
5. Minyak mineral ringan

12
 6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N’-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, #
5516UB)
8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. TEMED (N, N, N’N ‘Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, #
5524UB)

Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:

1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)

2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest
Scientific)

2.4 Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)

beberapa komponen-komponen PCR antara lain:

1. Enzim DNA Polymerase

Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment

DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif
secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan
enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk
perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik.Untuk mengatasi
kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA
polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya,
penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat
dilakukan dalam satu mesin

2. Primer

Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai

urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer
13
 berkisar antara 20-30 basa.Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui
urutannukleotida pada awal dan akhir DNA target.Primer oligonukleotida di
sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer.

3. Reagen lainnya

Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut
menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk
reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2. Konsentrasi ion
Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion
Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas
produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi.

2.5 Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)

Ada banyak variasi dari PCR yang umum di kenal, antara lain:

 Alel-spesifik PCR : atau kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada -

nukleotida polimorfisme tunggal (SNP) Hal ini membutuhkan pengetahuan
sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan
menggunakan primer yang 3 'berakhir meliputi SNP. amplifikasi PCR dalam
kondisi ketat jauh kurang efisien dalam adanya ketidaksesuaian antara template
dan primer, amplifikasi sukses jadi dengan kehadiran sinyal primer spesifik-SNP
dari SNP spesifik secara berurutan.
 Polymerase Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang panjang
dengan melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan segmen
tumpang tindih pendek. The oligonukleotida bergantian antara rasa dan arah
antisense, dan segmen tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR,
sehingga selektif menghasilkan produk DNA panjang akhir.
 Asymmetric PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai
ganda. Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi probing amplifikasi
hanya satu dari dua untai komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti

14
 biasa, tetapi dengan kelebihan besar primer untuk untai yang ditargetkan untuk
amplifikasi. Karena (lambat aritmatika amplifikasi) kemudian dalam reaksi
setelah membatasi primer telah digunakan Facebook, siklus PCR tambahan yang
diperlukan.
 Amplifikasi tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi
menggunakan suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan
annealing / siklus ekstensi. DNA helikase , sebuah enzim yang unwinds DNA,
digunakan di tempat denaturasi termal.
 Hot Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama proses
set up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan
memanaskan komponen reaksi terhadap temperatur leleh (misalnya, 95°C)
sebelum menambahkan polimerase. Khusus sistem enzim telah dikembangkan
yang menghambat polimerase, aktivitas pada suhu sekitar, baik oleh mengikat
dari antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang terdisosiasi
hanya setelah suhu aktivasi langkah-tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai
dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu kamar dan akan
segera diaktifkan pada suhu perpanjangan.
 PCR spesifik Intersequence (ISSR): metode PCR untuk sidik jari DNA yang
memperkuat daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan
sidik jari yang unik dengan panjang fragmen diperkuat.
 Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit
sekitar genom sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi
diri, sehingga diketahui pada urutan kedua ujung urutan tidak diketahui.
 Mediated PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan
DNA kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, tetapi telah
digunakan untuk sekuensing DNA , berjalan genom , dan DNA footprinting.
 PCR spesifik Metilasi (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim
Herman di Johns Hopkins School of Medicine dan digunakan untuk mendeteksi
metilasi dari CpG pulau dalam DNA genom. DNA pertama diobati dengan
natrium bisulfit, yang mengubah unmethylated basa sitosin ke urasil, yang
15
 diakui oleh primer PCR sebagai timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA
dimodifikasi, menggunakan primer set identik kecuali pada setiap pulau CpG
dalam urutan primer. Pada titik-titik ini, satu set primer mengakui DNA dengan
sitosin untuk mengamplifikasi DNA alkohol, dan satu set mengakui DNA
dengan urasil atau timin untuk mengamplifikasi DNA unmethylated. MSP
menggunakan qPCR juga dapat dilakukan untuk mendapatkan informasi
kuantitatif daripada kualitatif tentang metilasi.
 Miniprimer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat
memperpanjang dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10
nukleotida. Metode ini memungkinkan menargetkan untuk mengikat PCR
primer daerah yang lebih kecil, dan digunakan untuk memperkuat sekuens DNA,
seperti atau eukariotik 18S rRNA).
 Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): izin beberapa sasaran
diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari
keterbatasan resolusi PCR multipleks.
 Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal
untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens
DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan
dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali
reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk
masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam
reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus
berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan
dengan elektroforesis gel .
 Nested PCR : meningkatkan kekhususan amplifikasi DNA, dengan mengurangi
latar belakang karena khusus non amplifikasi DNA. Dua set primer yang
digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi pertama, sepasang
primer digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain target yang
dimaksud, masih dapat terdiri dari fragmen DNA non-khusus diperkuat. Produk
(s) yang kemudian digunakan dalam PCR kedua dengan satu set primer yang
16
 mengikat situs sebagian atau seluruhnya berbeda dari dan terletak 3 'dari
masing-masing primer yang digunakan dalam reaksi pertama. Nested PCR
sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen spesifik DNA yang panjang
dari PCR konvensional, tapi membutuhkan pengetahuan lebih rinci tentang
urutan target.
 Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi
(BUMN): sebuah rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk splice bersama
lebih fragmen DNA atau dua yang berisi urutan komplementer. Hal ini
digunakan untuk bergabung dengan potongan DNA yang mengandung gen,
urutan peraturan, atau mutasi, teknik tersebut memungkinkan penciptaan DNA
spesifik dan panjang konstruksi.
 Kuantitatif PCR (Q-PCR): digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR
(umum secara real-time). Ini secara kuantitatif jumlah ukuran mulai DNA,
cDNA, atau RNA. Q-PCR biasanya digunakan untuk menentukan apakah urutan
DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam sampel. Kuantitatif real-
time PCR memiliki tinggi tingkat yang sangat presisi. QRT-PCR metode
menggunakan pewarna fluorescent, seperti Sybr Green, EvaGreen atau
fluorophore DNA probe yang mengandung seperti TaqMan, untuk mengukur
jumlah produk yang diperkuat secara real time. Hal ini juga kadang-kadang
disingkat RT-PCR (R T ime Bit PCR) atau RQ-PCR. QRT-PCR atau RTQ-PCR
sesuai kontraksi lebih, karena RT-PCR umumnya mengacu pada reverse
transkripsi PCR (lihat di bawah), sering digunakan dalam hubungannya dengan
Q-PCR.
 RT reverse transcription PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA.
Reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang kemudian
diamplifikasi dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profiling
ekspresi , untuk menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan
dari transkrip RNA, termasuk start transkripsi dan situs penghentian. Jika urutan
DNA genom gen diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi

17
 ekson dan intron dalam gen. 5 'akhir dari gen (sesuai dengan awal transkripsi)
biasanya diidentifikasi oleh RACE-PCR (Rapid Amplifikasi cDNA End).
 PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR ): untuk isolasi dari suatu urutan
yang tidak diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan diketahui,
TAIL-PCR menggunakan sepasang nested primer dengan suhu yang berbeda
anil; degenerate primer digunakan untuk memperkuat yang lain dari arah yang
tidak diketahui.
 Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR): sebuah varian dari PCR yang
bertujuan untuk mengurangi latar belakang spesifik secara bertahap menurunkan
suhu anil sebagai bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada awal siklus
biasanya beberapa derajat (3-5 ° C) di atas m T primer yang digunakan,
sedangkan pada siklus kemudian, ini adalah beberapa derajat (3-5°C) di bawah
T primer m. Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk primer
mengikat, dan suhu yang lebih rendah izin lebih amplifikasi efisien dari produk
tertentu terbentuk selama siklus awal.

2.6 Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)

 Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:

Amplifikasi urutan nukleotida.
 Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
 Bidang kedokteran forensik.
 Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan,
diantaranya:

 Isolasi Gen.

18
 Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat
besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya
mengandung ribuan gen. Fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu
sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip
menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai
asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang
menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan
protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum
diketahui dengan baik.

Para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai

contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau
babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja
mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak
benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen

penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri
(dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin. Hasilnya insulin
yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang
insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih
murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.
Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama
‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita
inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang
sesuai dengan gen tersebut.

 DNA Sequencing.

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA

Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger
(chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy
19
 terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang
agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan
2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent.
Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu
DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

 Identifikasi Forensik.

Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau

korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan.Jika identifikasi secara fisik
sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan
yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan
analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut
fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang.
Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki
pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung.Jika memiliki kecocokan yang
sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Banyak orang yang juga yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri
orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

 Diagnosa Penyakit.

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang

mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya
seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.PCR merupakan teknik
yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam
hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi
daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang
tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

20
2.7 Cara mendeteksi H. Pylori
Sebanyak 73 buah biopsi lambung (antrum dan corpus) pasien yang
menjalani pemeriksaan endoskopi di Subbagian Gastroenterologi, Bagian Ilmu
Penyakit Dalam FKUI/RSCM Jakarta dimana 53 sampel diperoleh selama bulan
Juli-Desember 2004, sedangkan 20 sampel lainnya diperoleh selama bulan Juli-
Oktober 2006. Spesimen biopsi tersebut diambil dari antrum dan corpus lambung
pasien dyspepsia yakni gangguan pencernaan akibat tingginya asam lambung.

 Ekstraksi DNA H pylori

Prosedur ekstraksi DNA H. pylori dilakukan sesuai dengan petunjuk Kit
Easy-DNA for genomic DNA isolation (No. katalog K-1800-01) Invitrogene.
Secara garis besar, biopsi dimasukkan ke dalam mikrotube steril berisi 350 µl
larutan pelisis (Solution A), divorteks dan diinkubasi pada 65oC selama 10 menit.
Selanjutnya ditambahkan 150 µl larutan pemurnian (Solution B), kemudian
divorteks hingga diperoleh larutan bening. Ditambahkan 500 µl kloroform dan
divorteks hingga campuran homogen. Larutan disentrifus pada 12.000 rpm selama
10-20 menit pada mesin sentrifus yang ditempatkan di dalam lemari pendingin
(4oC) dan kemudian fasa bagian atas dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus
steril baru untuk ekstraksi DNA.
Pemurnian DNA dilakukan dengan menambahkan 1 ml etanol 100% dingin
(-20oC), divorteks dan kemudian diinkubasi pada es selama 30 menit. Disentrifus
pada kecepatan maksimum selama 10-15 menit pada 4oC. Setelah etanol
disingkirkan dari pellet, ditambahkan 500 µl etanol 80% (-20oC) dan kemudian
dicampur dengan membolak- balikkan tabung 3-5 kali. Selanjutnya disentrifus pada
kecepatan maksimum selama 3-5 menit pada 4oC. Etanol disingkirkan dengan
pipet. Disentrifus kembali pada kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada 4oC
dan residu etanol disingkirkan dan dibiarkan mengering di udara. Pelet dilarutkan
ke dalam 75-100 µl buffer TE serta ditambahkan 1,5 µl RNase 2 mg/ml hingga
konsentrasinya 40 µg/ml. Diinkubasi pada 37oC selama 30 menit dan DNA yang
diperoleh siap untuk digunakan sebagai DNA template.
21
  Amplifikasi DNA denganPCR.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR menggunakan lima primer
oligonukleotida untuk gen-gen cagA, ureA dan ureC (glmM) serta 16S RNA ribosom
(Tabel1).
Tabel 1.Urutan basa primer oligonukleotida untuk gen-gen yang diuji beserta ukuran
produk PCR yang diharapkan, suhu annealing PCR.
Ukuran Suhu
Gen Oligonukleotida produk anneali Pustaka
(pb*) ng (oC)
cagA 5’-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3’ 349 55 Monteiro
5’-CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA-3’ dkk. [20]

ureA 5’-GCCAATGGTAAATTAGTT-3’ 491 45 Peek dkk.

5’-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3’ [21]

ureC 5’-AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT-3’ 294 60 Lage dkk.

(glmM) 5’-AAGCTTACTTTCTAACACTAA CGC-3” [22]

16S-RNA 5’-CTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3’ 110 60 Mapstone

ribosom 5’-ATTACTGACGCTGATTGTGC-3’ dkk.[10]

*) pb : pasang basa (basepair)

Proses PCR dilakukan dengan mencampur Buffer 1X, MgCl 2 2,5 mM, gelatin
0,001%, dNTP 100 µM, primer forward dan reverse masing-masing 0,1 µM dan
ampliTaq polymerase 0,5 U serta DNA template. Proses PCR dilakukan pada mesin
Master cycler gradient Eppendorf untuk maing-masing primer dengan kondisi
sebagai berikut: denaturasi awal pada 94oC selama 10 menit diikuti oleh 40 siklus
terdiri dari denaturasi pada 94oC selama 30 detik, annealing pada 45-64 oC selama 1
menit (tergantung primer) dan elongasi pada 72oC selama 45 detik. Setelah selesai 40
siklus, kemudian dilanjutkan elongasi akhir pada 72 oC selama 7 menit. Hasil
amplifikasi PCR dielektroforesis pada 2% gel agarose dan kemudian diwarnai
dengan etidium bromida 0,5 µg/ml selama 15 menit serta dipotret dengan kamera
instant Polaroid.

22
 HASIL DETEKSI H. Pylori
Dalam penelitian ini, telah terkumpul 73 sampel biopsi dari pasien
dispepsia berumur antara 22 hingga 85 tahun yang sebagian besar menderita
gastritis antrum berdasarkan hasil uji patologi anatomi. Dalam penelitian ini telah
dilakukan pendeteksian H pylori dalam biopsi lambung pasien dengan teknik
PCR menggunakan primer gen antara lain cagA, ureA, ureC dan 16S RNA
ribosom yang berhubungan erat dengan kolonisasi dan aktivitas patogenisasi
bakteri dalam saluran cerna. Dari 73 sampel biopsi yang diuji, empat atau 5,47%
sampel menunjukkan hasil positif untuk tiga gen yakni cagA, ureC dan 16S
RNA, tetapi tidak menghasilkan produk PCR positif untuk gen ureA. Dari empat
sampel tersebut, dua diantaranya menunjukkan pita DNA non spesifik dengan
berat molekul tinggi.Primer ureA yang digunakan tampaknya kurang sensitif
disebabkan karena jumlah ureA RNA yang lebih rendah dalam masing-masing
sel bakteri.

Gambar 2.Hasil analisis PCR untuk gen ureC (produk berukuran 294 bp) pada
sampel nomor 10 dan 15 (MIU positif). Kontrol positif (K+) adalah DNA strain H.
pylori NCTC 11638 dan kontrol negatif (K-) adalah akuabidest steril.

2.8 Peralatan,bahan dan prosedur yang digunakan dalam proses (PCR)

Sebelum melakukan prosedur amplifikasi DNA dengan teknik PCR,

diperlukan pengenalan peralatan dan bahan terlebih dahulu sesuai dengan metode
pengembangan PCR masing-masing. Berikut ini akan disajikan persiapan alat, bahan
dan prosedur dalam teknik PCR yang rutin digunakan yaitu teknik PCR standar atau
konvensional.

23
1.Peralatan

Peralatan dasar di laboratorium biologi molekuler sudah dibahas pada topik

sebelumnya pada Bab 6 tentang Teknik dasar Analisis Biologi Molekuler. Pada sub
topik ini hanya akan dibahas peralatan yang diperlukan terutama untuk
teknik PCR konvensional diperlukan peralatan sebagai berikut:

a.Biosafety Cabinet

Komponen utama biosafety cabinet HEPA (High Efficiency Particulate Air)

dan ULFA (Ultra Low Penetration Air), merupakan jantung dari Biosafety
Cabinet terbuat dari filter tipe kering berbentuk mikrofiber borosilikat
lembaran tipis seperti kertas. Fungsinya menyaring debu, asap, bakteri,
jelaga, serbuk sari dan partikel radioaktif).

b.Mesin PCR (PCR Thermal cycler)

Mesin PCR merupakan suatu alat yang dipergunakan untuk

mengamplifikasi atau menggandakan untaian basa-basa DNA yang
dibatasi oleh pasangan primer pengapitnya melalui pengaturan suhu dan
penggunaan enzim tahan panas tinggi. Dalam proses amplifikasi
tersebut, mesin PCR akan bekerja secara otomatis sesuai permintaan
pengaturan suhu untuk tahap denaturasi, annealing maupun ektensi/
elongasi serta berapa siklus yang diperlukan sampai dengan proses PCR
selesai.

c.Pipet Mikro

Pipet dimaksudkan alat untuk mengambil larutan dari suatu tempat

ke tempat lain dalam jumlah tertentu secara akurat. Alat ini diperlukan
dalam teknik PCR untuk mengambil larutan atau suspensi dengan
ketepatan yang sangat tinggi dan volume yang relatif kecil ( dalam µL).

Dalam pemakaian pipet mikro perlu diperhatikan kisaran volume yang

sesuai

untuk pipet yang bersangkutan. Angka yang tercantum di dalam pipet

menunjukkan volume maksimum yang dapat diambil pemilihan ukuran
pipet dan tips pipet mikro tergantung pada volume yang akan diambil.
Misalnya untuk mengambil volume 80 µL, kita gunakan pipet mikro
dengan kisaran 10-

24
 100 µL. Pengambilan bisa dengan pipet mikro yang 1000 µL, tetapi
kurang

akurat. Demikian pula dapat dilakukan dengan pipet ukuran 0-10 µL,
tetapi harus diulang beberapa kali. Hal tersebut dapat menyebabkan
kesalahan yang cukup besar karena dengan pengambilan berulang kali
terdapat kesalahan setiap kali pemipetan walaupun dengan kesalahan
yang sangat kecil.

d.Tabung (tubes)

Tabung mikro (micro tubes) dipergunakan dalam berbagai proses di

laboratorium molekuler termasuk proses PCR dalam berbagai volume.
Dikenal berbagai macam ukuran tabung, mulai ukuran kecil
sampai besar, di antaranya ukuran 0,5 mL; 1,5 mL; 2,0 mL. (Maftuchah,
2014).

e.Perangkat elektroforesis

Perangkat elektroforesis digunakan untuk mendeteksi secara visual hasil

produk PCR (Amplikon).

2.Bahan (Reagensia) yang diperlukan dalam proses PCR

Sebelum melakukan PCR, komponen-komponen yang akan digunakan dipersiapkan

terlebih dahulu, yaitu:

a.Larutan buffer stock

100 mM Tris-HCl pH 8,3 (pada suhu 25oC); 500 mM KCl; 1,5 mM MgCl2;
0,1% (b/v) gelatin. Untuk mempersiapkan arutan buffer harus digunakan
komponen-komponen yang steril.

b.Larutan dNTP

Larutan dATP, dTTP, dCTP, dCTP dan dGTP masing-masing disiapkan

dengan konsentrasi 10 mM sebagai larutan stock. Kemudian buatlah
larutan dNTP yang merupakan campuran keempat deoksiribonukleotida
trifosfat sehingga masing-masing deoksinukleotida trifosfat mempunyai
konsentrasi 0,2 mM. Sterilkan larutan dNTP dengan menggunakan filter.

25
 Larutan deoksinukleotida trifosfat tersebut harus disimpan di dalam
freezer bersuhu -20oC.

c.Larutan oligonukleotida primer

Sebelum digunakan untuk membuat larutan stok primer, oligonukleotida

yang diperoleh dari hasil sintesis dengan DNA synthesizer sebaiknya
dimurnikan terlebih dahulu dengan cara tertentu. Pada saat ini sudah
tersedia kit komersial yang dapat digunakan untuk memurnikan DNA.
Bahkan jika primer dipesan dari perusahaan yang bagus, biasanya dikirim
sudah dalam keadaan siap digunakan.

d.Larutan enzim Taq DNA polymerase

Enzim Taq DNA polymerasesebaiknya disiapkan menjelang digunakan.

Encerkan stok enzim dengan menggunakan larutan 1X buffer PCR steril
sehingga diperoleh konsentrasi 2,5 unit/µL. Sebelum digunakan, enzim
yang telah diencerkan tadi harus selalu diletakkan pada es. Oleh karena
enzim ini

merupakan salah satu komponen yang termasuk mahal, enzimTaq

DNA polymerasedisiapkan seperlunya saja dan sisanya disimpan
kembali dalam freezer bersuhu - 20oC.

3.Prosedur

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, enzim DNA
polimerase yangthermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, danthermal cycler.

Cara Kerja:

PCR mix solution, untuk keperluan 10 μL pereaksi, maka campurkan:

Aquadest steril = 2 μL ; PCR mix = 5 μL ; Primer 1(10pmole) = 1 μL ; Primer 2

(10pmole) =

1 μL dan Sampel DNA = 1 μL.

Contoh PCR Program:

26
1.Hot start (denaturasi awal) 94 oC selama 2 menit

2.Siklus amplifikasi diulang 31 kali terdiri dari

a) Denaturasi 94 oC selama 60
detik b) Annealing 58 oC
selama 45 detik c) Ekstensi 72
o
C selama 60 detik

3.Periode ekstensi pada suhu 72 oC selama 5 menit

Catatan: bila primer diganti program PCR menyesuaikan susunan primer

dan panjang DNA produk amplifikasi yang diinginkan.(Fatchiyah dkk., 2012

BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode in vitro yang digunakan

untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target
DNA.

Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR), denaturasi DNA

templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA.

Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR), Enzim DNA

Polymerase: enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi;
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan
komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar
antara 20-30 basa; Reagen lainnya berupa dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan
buffer yang mengandung MgCl2.

Manfaat Polymerase Chain Reaction (pcr), yaitu: amplifikasi urutan

nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami

27
mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang dengan
membandingkan DNA “finger print”.

Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah bahwa hanya
empat (5,47%) dari 73 sampel yang diuji menunjukkan hasil positif untuk seluruh
gen kecuali gen ureA. Dari ke empat sampel tersebut, dua diantaranya menunjukkan
pita DNA non spesifik.

28
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2011.PCR (Polimerase Chain Reaction). Diperoleh dari: www.

http://www.medicinenet.com. Diakses pada 5 April 2011.

Campbell dan Farrell. 2008. Biochemistry Sixt Edition. Brooks/cole.Kanada.

Elrod,S., dan William S. 2011. Genetika edisi 4. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Mahmuddin, 2010.Polimerase Chain Reaction (PCR). Diperoleh dari : www.

http://mahmuddin.wordpress.com/. Diakses pada 5 April 2011.

Nasir, M. 2002. Bioteknologi Molekuler. Citra Aditya Bakti. Bandung.

Sandra, R.N., 2011. Polimerase Chain Reaction. Diperoleh dari: www.

http://restunidia.blogspot.com/. Diakses pada 5 April 2011.

Stanfield, W., dkk.2009. Biologi Molekuler dan Sel. Erlangga. Jakarta

Wikipedia, 2011.Polimerase Chain Reaction. Diperoleh dari: www.

http://en.wikipedia.org/wiki/ Polymerase_chain_reaction. diakses pada 5 April
2011.

BLASER, M.J. and PARSONNET, J., Parasitism by “slow” bacterium Helicobacter

pylori leads to altered gastric homeostasis and neoplasia, Journal of Clinical
Investigation, 94, 4-8, 1994.

KIKUCHI, S. and DORE, M.P., Epidemiology of Helicobacter pylori infection,

Helicobacter 10 (Supplement), 1-4, 2005.

IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Infection

with Helicobacter Pylori.In : International Agency for Research on Cancer
(IARC) (ed.) IARC Monograph on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans. IARC Scientific Publications, No. 61, IARC, Lyon, 1994, pp. 177–241.

29
SYAIFUDIN, M., MARIALINA, R., ABDULLAH, M., and SYAM, A.F., Deteksi
Helicobacter pylori dengan teknik polimerase chain reaction, Risalah Seminar
Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Aplikasi Isotop dan Radiasi, P3TIR
BATAN, Jakarta 12 April 2005, 41-47.

RUZSOVICS, A., MOLNAR, B., and TULASSAY, Z., Review article:

deoxyribonucleic acid-based diagnostic techniques to detect Helicobacter pylori,
Aliment Pharmacol Ther, 19, 1137-1146, 2004.

AZUMA, T., YAMAKAWA, A., YAMAZAKI, S., OHTANI, M., ITO, Y.,
MURAMATSU, A., SUTO, H., YAMAZAKI, Y., KEIDA, Y., HIGASHI, H.,
and HATAKEYAMA, M. Distinct diversity of the cag pathogenicity island
among Helicobacter pylori strains in Japan, J. Clin. Microbiol. 42: 2508-2517,
2004.

30