AMPLIFIKASI PCR

LAPORAN

OLEH :

SHOLAHUDDIN AL HASNAN
170301157
PEMULIAAN TANAMAN – A

LABORATORIUM GENETIKA MOLEKULER

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
F A K U L T A S P E R T A N I A N
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
2020
 AMPLIFIKASI PCR

LAPORAN

OLEH :

SHOLAHUDDIN AL HASNAN
170301157
PEMULIAAN TANAMAN – A

Laporan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Dapat Memenuhi Komponen Penilaian
di Laboratorium Genetika Molekuler Program Studi Agroteknologi
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara

LABORATORIUM GENETIKA MOLEKULER

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
F A K U L T A S P E R T A N I A N
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
2020
Judul : Amplifikasi PCR
Nama : Sholahuddin Al Hasnan
NIM : 170301157
Group : PET - A

Diketahui Oleh,
Dosen Penanggung Jawab Laboratorium

(Ir. Eva Sartini Bayu, MP)

NIP. 196105061993032001

Diperiksa oleh : Diperiksa oleh :

Asisten Koordinator Asisten Korektor

(Bayu Atmaja Nirza) (Alda Rizky)

NIM. 160301191 NIM. 160301243
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan yang Maha Esa, karna

atas berkat rahmat dan karunianya penulis dapat menyelesaikan laporan ini tepat

pada waktunya.

Adapun judul laporan ini adalah “Amplifikasi PCR” yang merupakan

salah satu syarat untuk dapat memenuhi komponen penilaian di Laboratorium

Genetika Molekuler Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas

Sumatera Utara, Medan.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada dosen

penanggung jawab Laboratorium Sitogenetika, yaitu: Ir. Eva Sartini Bayu, MP.,

Ir. Emmy Harso Khardinata, M.Sc., Dr. Diana Sofia Hanafiah, SP., MP., Dr. Ir

Revandy I.M Damanik, M.Si., M.Sc., Ph.D serta kakak - kakak asisten yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan laporan ini.

Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh

karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun.

Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih.

Medan , April 2020

Penulis

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR............................................................................................i

DAFTAR ISI..........................................................................................................ii

PENDAHULUAN
Latar Belakang.............................................................................................1
Tujuan Penulisan..........................................................................................2
Kegunaan Penulisan.....................................................................................2

TINJAUAN PUSTAKA

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Pratikum.......................................................................5
Alat dan Bahan.............................................................................................5
Prosedur Pratikum........................................................................................5

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil…………………………………………………………………….. 7
Pembahasan……………………………………………………………... 7

KESIMPULAN

DAFTAR PUSTAKA

ii
 1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Asam Deoksiribonukleat (DNA) merupakan materi genetik yang

membawa informasi genetik bagi seluruh makhluk hidup. DNA terdiri atas bagian

yang mengkode genetik (ekson), bagian yang tidak mengkode genetik (intron) dan

bagian yang mengatur regulasi genetik 1. Karena fungsinya yang membawa

informasi genetik, DNA sangat berguna dalam identifikasi penyakit infeksius,

kanker, kelainan genetik 2, bahkan forensik (Feranisa, 2016).

Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain

Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk

mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan

jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106

-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali

jumlahnya (Tiara et al., 2014).

Reaksi amplifikasi berlangsung dalam 3 tahap untuk setiap siklus. Reaksi

diawali dengan hot start pada suhu 95°C selama 5 menit. Tahap pertama adalah

proses denaturasi pada suhu 94°C selama 1,5 menit. Tahap kedua adalah proses

annealing pada suhu 45°C selama 1 menit. Tahap ketiga adalah pemanjangan

rantai DNA pada suhu 72°C selama 3 menit (Rahayu, et al., 2015).

Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas

spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada

kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui

sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu

 2

menghindari kesalahan pada amplifikasi produk. Masalah yang berkenaan dengan

PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi (Yusuf, 2010).

Jumlah DNA yang diperlukan dalam proses PCR sangat sedikit yaitu

sekitar 1 μl atau 10 ng/μl. Untuk mengetahui konsentrasi DNA hasil ekstraksi

dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose.

Hasil amplifikasi DNA dengan PCR ditentukan oleh primer oligonukleotida yang

digunakan (Fitri, 2013).

Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui teknik

amplifikasi PCR.

Kegunaan Penulisan

Adapun kegunaan penulisan yaitu sebagai salah satu syarat untuk dapat

memenuhi komponen penilaian di Laboratorium Genetika Molekuler Program

Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dan

sebagai sumber informasi bagi pihak yang membutuhkan.

 3

TINJAUAN PUSTAKA

Reaksi berantai polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR)

merupakan suatu metode enzimatis untuk mengamplifikasi secara eksponensial

suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. Proses PCR untuk

mengamplifikasi DNA membutuhkan DNA cetakan yang mengandung urutan

DNA target yang akan diamplifikasi, sepasang primer, enzim DNA polimerase,

buffer, dan campuran monomer nukleosida trifosfat (dNTP). PCR melibatkan

serangkaian siklus suhu yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas 3

tahapan : denaturasi pada suhu 94-96 °C, penempelan primer pada suhu 45-60 °C

(annealing) dan perpanjangan primer pada suhu 72 °C (Wallace, 2009).

Proses amplifikasi DNA pada PCR membutuhkan bahan campuran yang

terdiri dari buffer PCR, MgCl2, dNTP yang digunakan sebagai sumber nukleotida

pada proses PCR (gabungan dATP, dGTP, dCTP dan dTTP), Taq DNA

polymerase, DNA hasil isolasi dan Nuclease Free Water. Sebelum dilakukan

proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran DNA tamplate dengan

Nuclease Free Water. Hal ini tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik

hasil ekstraksi (Santoso, et al., 2013).

PCR dibedakan menjadi dua yaitu PCR konvensional dan real time.

Analisis hasil amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional dilakukan

dengan visualisasi di agar elektroforesis. Sedangkan PCR real time, jumlah DNA

yang diamplifikasi dapat dideteksi dan diukur di setiap siklus proses PCR.

Jumlah amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional divisualisasikan

dengan menggunakan agar elektroforesis. Penandaan fragmen DNA dengan

fluorescent dye dan intensitas pita DNA dapat diukur dengan menggunakan mesin
 4

digital densitometri. Hal ini berbeda pada PCR real time, jumlah DNA diukur di

setiap siklus proses amplifikasi PCR terutama pada fase eksponensial (Yuwono,

2006).

Keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh beberapa

faktor, yaitu DNA template, primer, buffer PCR, MgCl2, enzim

polymerase, suhu, waktu dan jumlah siklus. Optimasi PCR perlu

dilakukan terlebih dahulu untuk mendapatkan kondisi PCR yang tepat

sehingga dihasilkan produk PCR yang spesifik. Hasil amplifikasi PCR

menggunakan primer COIL dan COIH dengan berbagai suhu annealing

yang berbeda (41⁰C, 42⁰C, 43⁰C, 44⁰C, 45⁰C) dengan jumlah siklus

sebanyak 35, yang dideteksi dengan elektroforesis dalam gel agarose

(Susminarsih, 2010).

Keberhasilan proses PCR juga ditentukan oleh jenis enzim DNA

polimerase yang digunakan. Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan

katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Enzim DNA polimerase idealnya harus tahan

panas, mempunyai laju polimerisasi dan prosesivitas yang tinggi. Prosesivitas

adalah kemampuan suatu enzim polimerase untuk menggabungkan nukleotida

dengan suatu primer secara terus menerus tanpa terdisosiasi dari kompleks

primer-DNA cetakan (Pardal, 2010).

 5

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Praktikum

Adapun praktikum dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler

Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara,

Medan dengan ketinggian ±35 mdpl. Pada hari Selasa, 14 April 2020 pukul 14.00

WIB sampai dengan selesai.

Alat dan Bahan Praktikum

Adapun alat yang digunakan selama praktikum yaitu, Tips untuk

dipasangkan dengan mikropipet, Mikropipet digunakan untuk memindahkan dan

mengambil cairan dalam jumlah kecil secara akurat, Chamberwell untuk

elektroforesis dan untuk saat pemasukan DNA tidak tercampur dengan larutan di

dalam, Power supply untuk menghantarkan arus listrik, dan PCR sebagai alat

amplifikasi.

Adapun bahan yang digunakan selama praktikum yaitu stok DNA sebagai

objek yang akan diamati, Aquades sebagai pelarut, ddH2O sebagai bahan, Primer

sebagai bahan.

Prosedur Praktikum

- Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 1

µl stok DNA dan ditambah 9 µl ddH2O sehingga diperoleh 10 µl aliquot

DNA

- Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR-

RAPD yaitu paket PCR Go Taq Green Master Mix produksi promega

dalam kotak berisi pecahan es.

ddH2O : 4.5 µl x B = .... µl

 6

Go Taq Green Master Mix : 7.5 µl x B = .... µl

Primer : 1 µl x B = .... µl

B = Jumlah Sampel.

- Dari tube diambil 13 µl ke tube yang lain sehingga diperoleh 10 tube untuk

PCR dan ditambahkan masing-masing DNA aliquot sebanyak 2 µl.

- Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran

master mix dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR.

 7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Sample N25 N26 N27 N29

Pita
1 # 0 0

0 # 0 0

1 # 0 1

0 # 0 1

Pembahasan

Penanda RAPD bersifat dominan, fragmen DNA yang dihasilkan tidak

dapat membedakan individu yang memiliki genotipe homozigot (AA) dengan

heterozigot (Aa) hal ini sesuai dengan literatur Susminarsih (2010) yang

menyatakan bahwa keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh

beberapa faktor, yaitu DNA template, primer, buffer PCR, MgCl2, enzim

polymerase, suhu, waktu dan jumlah siklus.

Perubahan kondisi reaksi dan intensitas pita yang dihasilkan bervariasi

 8

sehingga menyulitkan dalam skoring pola pita. Hal ini sesuai literatur Yuwono

(2006) yang menyatakan bahwa Jumlah amplifikasi fragmen DNA pada PCR

konvensional divisualisasikan dengan menggunakan agar elektroforesis.

Penandaan fragmen DNA dengan fluorescent dye dan intensitas pita DNA dapat

diukur dengan menggunakan mesin digital densitometri

Amplifikasi fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan mesin PCR

pada suhu annealing rendah(35-40°C) hal ini sesuai dengan literature Wallace

(2009) yang menyatakan bahwa PCR melibatkan serangkaian siklus suhu yang

berulang dan masing-masing siklus terdiri atas 3 tahapan : denaturasi pada suhu

94-96 °C, penempelan primer pada suhu 45-60 °C (annealing) dan perpanjangan

primer pada suhu 72 °C

Pada hasil skoring marka yang di lakukan dapat di lihat bahwa pita pada

masing-masing sampel tidak jelas hal ini sesuai dengan literatur Pardal, (2010)

yang menyatakan bahwa keberhasilan proses PCR juga ditentukan oleh jenis

enzim DNA polimerase yang digunakan. Enzim DNA polimerase yaitu enzim

yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Enzim DNA polimerase

idealnya harus tahan panas, mempunyai laju polimerisasi dan prosesivitas yang

tinggi.

Faktor yang mempengaruhi pita DNA yang terlalu tipis atau tidak begitu

jelas dikarenakan pada saat proses PCR kurang optimal hal ini sesuai dengan

literatur Santoso, et al., (2013) Sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus

dilakukan pengenceran DNA tamplate dengan Nuclease Free Water. Hal ini

tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi

 9

KESIMPULAN

1. Penanda RAPD bersifat dominan, fragmen DNA yang dihasilkan tidak dapat

membedakan individu yang memiliki genotipe homozigot (AA) dengan

heterozigot (Aa).

2. Perubahan kondisi reaksi dan intensitas pita yang dihasilkan bervariasi

sehingga menyulitkan dalam skoring pola pita.

3. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan mesin PCR pada

suhu annealing rendah(35-40°C).

4. Pada hasil skoring marka yang di lakukan dapat di lihat bahwa pita pada

masing-masing sampel tidak jelas.

5. Faktor yang mempengaruhi pita DNA yang terlalu tipis atau tidak begitu jelas

dikarenakan pada saat proses PCR kurang optimal.

 10

DAFTAR PUSTAKA

Feranisa, A. 2016. Komparasi Antara Polymerase Chain Reaction (Pcr) Dan

Loopmediated Isothermal Amplification (Lamp) Dalam Diagnosis
Molekuler. Universitas Islam Sultan Agung.
Fitri, R. M. 2013. Optimasi Isolasi Kromosomal DNA dan Amplifikasi PCR DNA
Ribosomal Fungi Penicillium sp. LBKURCC20, LBKURCC21,
LBKURCC27 dan Trichoderma sp. LBKURCC28. Universitas Riau.

Pardal, S.J. 2010. Menguji ekspresi gen menggunakan real time PCR. Warta
Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 32:13-14.

Rahayu, F,. Saryono,. T, T, Nugroho. 2015. Isolasi Dna Dan Amplifikasi Pcr
Daerah Its Rdna Fungi Endofit Umbi Tanaman Dahlia (Dahlia
variabilis) LBKURCC69. JOM FMIPA Vol. 2 No.1.

Santoso, T.J., S. H. Hidayat., M. Herman., Sudarsono. 2013. Aplikasi Teknik

Polymerase Chain Reaction (PCR) Menggunakan Primer Degenerate
dan Spesifik Gen AV1 Untuk Mendeteksi Begomovirus Pada Tomat
(Lycopersicon esculentum Mill.). J. Hort. Indonesia 4(3):140-149.

Susminarsih, T. 2010. Peran Genetik DNA Mitokondria (mtDNA) Pada

Motilitas Spermatozoa. Majalah Kesehatan PharmaMedika. Vol
2(2): 178-184.

Tiara, S,. A, Arziani,. N, Siti,. E, Aprilia,. S, Retalia,. D, Yunus,. M, Sapta,. A, N,

Huda,. M, Alkahfi. 2014. PCR (Polymerase Chain Reaction). IPB.
Bogor.

Wallace, D. C., 2009, Mitochondrial DNA Mutation and Neuromocular Disease,

Hum. Genet. Disease, p. 9-13.

Yusuf, J.K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Universitas Negeri

Gorontalo.

Yuwono T. 2006. Teori dan aplikasi polymerase chain reaction. Yogyakarta.