POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Disusun oleh :

1. Novia Sinta Varadina (4401416101 / 3)

2. Rafika Nur Handayani (4401416052 / 3)
3. Ulfa Lutfiana (4401416093 / 3)
4. Istighfaroh Tsaniyah (4401416099 / 3)

PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

SEMARANG
2019
 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

I. Tanggal Praktikum : 8 Mei 2019

II. Tujuan Praktikum :

Untuk mengamplifikasi DNA hasil isolasi

III. Landasan Teori

Keberhasilan sekuensing DNA sangat bergantung dari keberhasilan proses

PCR. Asas PCR adalah melipat gandakan secara eksponensial sekuen nukleotida
tertentu secara in vitro (Triyani, dkk, 2016). Polymerase Chain Reaction (PCR), yang
dikemukakan oleh Kary Mullis pada pertengahan 1980-an, merupakan salah satu
tonggak revolusi dalam bidang genetika molekuler. Teknik ini memungkinkan
pendekatan baru dalam studi dan analisis gen (Retnoningsih dkk, 2019). Muhsinin dkk
(2018), menyebutkan bahwa PCR memiliki beberapa keunggulan, diantaranya: cepat
dalam menganalisis hasil (1 hari), memiliki nilai sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi
(>90%).

Dalam penelitian Tang et al. (2016), PCR dilakukan di bawah kondisi

thermocycling sebagai berikut: 95°C selama 5 menit, diikuti oleh 36 siklus 94°C selama
30 detik, 50°C selama 30 detik, 72°C selama 30 detik, dan perpanjangan akhir selama
7 menit pada 72°C. Menurut Ahrberg et al (2016), tahapan PCR biasanya terdiri dari
tiga tahap yaitu, denaturasi, anealing, dan ekstensi. Pada langkah denaturasi (±95°C),
DNA untai ganda terdenaturasi menjadi dua untaian tunggal. Setelah itu suhu menurun
untuk langkah pendinginan (±56 ° C). Primer, yang merupakan sekuens pendek dan
komplementer dari DNA, dapat dianil pada target DNA untai tunggal. Untuk
meningkatkan aktivitas polimerase, suhu dinaikkan untuk langkah ekstensi, biasanya
sekitar 72°C.

Menurut Muhsinin dkk (2018), keberhasilan amplifikasi fragmen DNA

dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu DNA template, primer, MgCl2, enzim
polimerase, suhu, waktu dan jumlah siklus. Konsentrasi template DNA yang terlalu
kecil sering menghasilkan pita DNA amplifikasi yang tipis dan tidak jelas. Enzim
polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA pada proses PCR
enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Konsentrasi enzim polimerase yang
tidak tepat dapat menyebabkan hasil pita DNA yang smear. Konsentrasi ion Mg2+
berpengaruh besar terhadap spesifisitas dan jumlah produk (yield) PCR. Umumnya jika
ion Mg2+ kurang akan menurunkan yield, sedangkan jika ion Mg2+ berlebih akan
menghasilkan produk non spesifik. Magnesium mempengaruhi penempelan primer
serta aktifitas enzim. Pada penelitian ini konsentrasi MgCl2 yang rendah menyebabkan
intensitas pita yang rendah pada produk PCR. Hal ini disebabkan rendahnya aktifitas
Taq polimerase. Konsentrasi MgCl2 yang tinggi juga mempengaruhi jumlah pita yang
dihasilkan dan mengakibatkan penurunan intensitas.

Berdasaerkan penelitian yang dilakukan oleh Muhsinin dkk (2018), diperoleh

konsentrasi komponen PCR yang optimum sebagai berikut:

Tabel 1. Tabel Konsentrasi Optimal Komponen PCR

Konsentrasi
No Komponen Konsentrasi PCR Volume
Awal

1. Taq Polimerase 5U 1U 0,2 µl

2. Buffer 5X 1X 10 µl

3. MgCl2 25 µM 1,5 µM 3 µl

4. dNTPs 10 µM 150 µM 0,75 µl

5. Primer Forward 100 µM 100 nM 5 µl

6. Primer Reverse 100 µM 100 nM 5 µl

7. DNA Template 4,5 ng/µl 4,5 ng/µl 1 µl

8. NFW ad 50 µl

Dalam penelitian lain, Triyani dkk (2016) menyebutkan bahwa keberhasilan

reaksi PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu: Deoksiribonukleotida
trifosfat (dN-TP); Oligonukleotida primer; DNA template; Susunan larutan bufer;
Jumlah dauran reaksi; Enzim yang digunakan dan faktor teknis lainnya, seperti
pencemaran. Oligonukleotida primer (rancangan primer) memegang peran penting
 untuk kekhasan terbesar dan keberhasil-gunaan PCR. Green et al (2015) dalam
penelitiannya menyebutkan beberapa kriteria ideal untuk primer, antara lain: (i) primer
harus cocok dengan gen dari semua organisme yang dikenal dalam kelompok yang
diminati, dan harus dapat menargetkan gen dari organisme yang tidak dikenal di tingkat
sub-taksonomi, (ii) pasangan primer harus seimbang untuk suhu leleh dan
menghasilkan amplifikasi yang kuat, dan (iii) primer perlu menjangkau satu atau lebih
daerah gen yang hipervarabel.

IV. Alat dan Bahan

- Alat : - Bahan :
1. Mesin Thermal cycler 1. Kit PCR
(PCR) 2. Primer Forward dan Reserve
2. Tube PCR 3. H2O nuclease free
3. Mikropipet 1 ul, 10 ul, dan 4. Sample DNA
100 ul.
V. Metode
1. Cara kerja PCR Gen D-Loop untuk DNA Hewan

Amplifikasi Gen D-loop Menggunakan KAPA 2G Hotstart Ready Mix Kit.

Primer Untuk Amplifikasi D-loop

(Primer Forward Dl-anaspf (L56)) Dan (Primer Reserve Dl-anaspr (H773))

Komposisi Cocktail PCR :

Komposisi Cocktail PCR Dicampurkan Dengan Cara Pipetting Dan Dihomogenkan

Menggunakan Vortex Selama 1 - 2 Menit.

Melakukan Program PCR : SEBANYAK 35x

Pre-denaturasi 94˚C 5 Menit

Denaturasi 94˚C 30 Detik

Annealin 56,1˚C 30 Detik

Ekstensi 72˚C 1 Menit

Final Ekstensi 72˚C 5 Menit

Produk PCR divisualisasikan menggunakan Agarose 2%

2. Cara kerja PCR marker mikrosatelit untuk tumbuhan

Amplifikasi lokus Mikrosatelit dangan menggunakan Dream Taq Green

master mix

Primer DZgccg01 digunakan untuk Amplifikasi lokus mikrosatelit.

sekuen primer forward DZgccg01 dan primer reserve

Komposisi Cocktail PCR

dicampur dengan cara pipetting

diVortex 1-2 menit

Melakukan Program PCR : SEBANYAK 35x

Pre-denaturasi 94˚C 5 Menit

Denaturasi 94˚C 30 Detik

Annealin 60,9˚C 30 Detik

Ekstensi 72˚C 30 detik

Final Ekstensi 72˚C 10 Menit

Produk PCR divisualisasikan menggunakan Agarose 2%

 DAFTAR PUSTAKA

Ahrberg, C. D., Manz, A., and Chung, B. G. 2016. Polymerase Chain Reaction in Microfluidic
Devices. Journal of Lab Chip. 16: 3866 – 3884
Green, S. J., Venkatramanan, R., and Naqib, A. 2015. Deconstructing the Polymerase Chain
Reaction: Understanding and Correcting Bias Associated with Primer Degeneracies
and Primer-Template Mismatches. Journal of PLoS One. 10(5): 1 – 21.
Muhsinin, S., Sulastri, M. M., dan Supriadi, D. 2018 Deteksi Cepat Gen InvA pada Salmonella
spp. Dengan Metode PCRm. Jurnal Sains Farmasi & Klinis. 3 (5) :191–200.
Retnoningsih, A., dan Susanti, R. 2019. Petunjuk Praktikum Biologi Molekuler. Semarang:
Jurusan Biologi FMIPA UNNES.
Tang, Y., Bo, l., Jianguo, D., Jianfang, D., Wang, X., Si, J., Ali, Z., Taotao, L., and Nongyue,
H. 2016. Genotyping of Pseudomonas aeruginosa Type III Secretion System Using
Magnetic Enrichment Multiplex Polymerase Chain Reaction and
Chemiluminescence. Journal of Biomedical Nanitechnology. 4(12): 762 – 769.
Triyani, Y., Nafsi, N., Yuniarti, L., Sekarwana, N., Sutedja, E., Gurnida, D. A., Parwati, I., dan
Alisjahbana, B. 2016. Rancangan Primer Spesifik Gen Macrophage Mannose
Receptor (MMR) untuk Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Sekuensing
Deoxyribo Nucleic Acid (DNA). Indonesian Journal of Clinical Pathology and
Medical Laboratory. 2 (22): 158 – 162