MODUL BIOINFORMATIKA PRAKTIKUM BIOSISTEMATIKA

Studi Filogenetik Tanaman Dalam Famili Fabaceae dengan ITS2

(Internal Transcribed Spacer 2)

Fabaceae merupakan famili tanaman obat terbesar kedua yang terdiri dari 490 spesies
tanaman. Beberapa spesies tanaman seperti Glycyrriza uralensis, Glycyrriza inflate, dan
Glycyrriza glabra telah digunakan sebagai obat tradisional untuk penyakit HIV dan hepatitis.
Namun ada beberapa spesies tanaman yang dapat menghasilkan alkaloid toksik seperti Acacia
ridigula. Dalam penggunaannya seringkali terjadi kesalahan penggunaan spesies tanaman
karena karakteristik morfologinya yang mirip. Kesalahan penggunaan ini dapat diminimalisir
dengan adanya metode identifikasi yang lebih akurat. DNA barkode seperti matK, rbcL, psbA-
trnH, ITS, rpoC1 telah dikembangkan untuk identifikasi spesies (Gao et al., 2010)
Dalam praktikum ini akan dilakukan studi filogenetik tanaman-tanaman yang termasuk
ke dalam famili Fabaceae menggunakan DNA barkode ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2)
yang terletak di antara 5,8S dan 25S rRNA. Filogenetik adalah studi tentang sejarah evolusi
dari organisme hidup menggunakan diagram pohon (tree-like) untuk mewakili silsilah
organisme. Pola bercabang pada pohon mewakili perbedaan evolusioner yang disebut sebagai
filogeni. Filogenetik dapat ditentukan dengan berbagai cara seperti dari data rekam fosil yang
memuat data morfologi spesies, tetapi hal ini memiliki kekurangan antara terbatasnya
kelimpahan sampel, habitat, jarak geografis dan faktor lainnya. Namun saat ini sudah
digunakan data molekuler seperti sekuen DNA dan protein yang mampu menyediakan
perspektif evolusioner lain pada organisme yang ada sekarang, hal ini dikarenakan selama
organisme berevolusi, materi genetik mengakumulasi berbagai macam mutasi yang
menyebabkan perubahan fenotip (Jin Xiong, 2006). Program yang digunakan untuk studi
filogenetik adalah MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0). Program
ini merupakan program analisis sekuens DNA maupun protein untuk membentuk suatu pohon
filogenetik dengan berbagai metode baik distance based maupun character based. MEGA7
telah dioptimasi lebih baik sehingga para peneliti bisa menganalisa data yang lebih banyak.
Aplikasi ini sudah tersedia bagi pengguna Windows, Linux dan Mac OS (Kumar et al., 2016).
Dasar Teori

Molekuler filogenetik didasari konsep bahwa karakter tidak hanya menunjukkan tingkat
kesamaan atau ketidaksamaan (kekerabatan, phenetic) antar organisme yang dianalisis, akan
tetapi juga menunjukkan hubungan evolusioner (evolutionary relationship) antar organisme
(filogeni, cladistic). Sekuens nukelotida dalam genom sesuai untuk keperluan filogenetik
molekuler karena sekuens DNA yang merupakan hereditary materials yang diturunkan dan
akan mengakumulasi mutasi sepanjang waktu. Jika dua organisme memiliki sekuens DNA
memiliki kesamaan yang tinggi maka organisme tersebut berkerabat dekat dan belum lama
mengalami spesiasi dari nenek moyangnya (common ancestor). Keunggulan lain penggunaan
sekuens DNA dalam filogenetik molekuler adalah : jumlah karakter yang banyak dalam sekali
analisis, memiliki 4 character state yang diskrit (Adenin (A), Guanin (G), Sitosin ( C) dan
Timin (T)), karakternya dimiliki semua organisme hidup dan dapat dengan mudah dianalisis
secara statistik. Dalam aplikasinya, analisis filogenetik memungkinkan untuk analisis waktu
divergensi (waktu berpisah) suatu spesies dari nenek moyangnya, penentuan distribusi spesies
sepanjang waktu (filogeografi) dan DNA Barcoding.

Dalam analisis filogenetik, karakter dikategorikan sebagai karakter yang primitive (plesiomorf)
dan karakter yang lebih maju (apomorf). Karakter apomorfi terbagi lagi menjadi autoapomorfi
(hanya dimiiliki spesies tertentu) dan sinapomorfi (karakter maju yang dimiliki bersama-sama).
Penentuan jenis karakter dilakukan dengan analisis outgroup.

Ilustrasi pembagian karakter dalam analisis cladistik, A-D menunjukkan spesies dan bentuk
geometri menunjukkan character state, A merupakan spesies outrgoup sehingga karakter bulat
merupakan plesiomorfi, karakter kotak adalah sinapomorfi dan karakter segitiga adalah
autopomorfi

Berdasarkan asal karakternya, karakter terbagi menjadi dua yaitu karakter yang homolog dan
karakter yang homoplasi. Karakter yang dapat
digunakan untuk analisis filogenetik hanya
karakter yang homolog yaitu karakter yang
berasal dan berkembang dari nenek moyang
yang sama (shared common ancestor).
Karakter yang homoplasi merupakan karakter
yang tidak berkembang dari karakter nenek
moyang yang sama, akan tetapi disebabkan karena adanya reversal (secondary loss), evolusi
konvergen atau evolusi parallel.

Output dari analisis filogenetik yang paling umum adalah dalam bentuk pohon filogenetik.
Istilah yang digunakan dalam penamaan pohon filogenetik dapat berupa:
 1. Cladogram: Pohon yang menunjukkan kekerabatan antar spesies, panjang cabang tidak
memberikan informasi apapun
2. Phylogram: Pohon dimana panjang cabang menunjukkan derajat perbedaan antar taksa
atau waktu sejak spesiasi dari nenek moyang
3. Dendogram: Merujuk pada semua jenis pohon filogenetik secara umum. Baik
cladogram maupun phylogram merupakan jenis dendogram.
Terminologi yang dipakai dalam pohon filogenetik meliputi:

Topologi: Pola kekerabatan antar spesies dalam pohon secara umum

Root: Common ancestor dari semua taksa
Branches/Edges: menunjukkan hubungan antar taksa
Branch Length (hanya di scaled tree atau phylogram): menunjukkan derajat perbedaan
antar branch
Internal Nodes: Percabangan di dalam pohon yang mengindikasikan common ancestor
yang sama
Terminal Nodes, OTU atau tips: menunjukkan organisme yang dibandingkan
Clade atau Sister Groups: kelompok dari beberapa taksa yang berasal dari satu common
ancestor yang sama

Pengelompokan taksa di dalam pohon filogenetik terbagi ke dalam tiga kategori utama:

1. Pengelompokan monofiletik: Nenek moyang dan semua spesies turunannya

dikelompokkan dalam satu clade
2. Pengelompokan Parafiletik: Hanya sebagian spesies turunan dikelompokkan dalam
satu nenek moyang/ancestor
 3. Pengelompokan Polifiletik: spesies yang memiliki ancestor yang berbeda
dikelompokkan dalam satu clade yang sama.

Topologi pohon yang dikonstruksi dapat berupa unrooted maupun rooted. Pohon unrooted
hanya menunjukkan kekerabatan antar organisme tanpa ada informasi nenek moyang.
Percabangan dalam pohon filogenetik dapat berupa dikotomi (dari satu internal node bercabang
dua) atau politomi dimana dari satu internal node bercabang lebih dari dua. Percabangan yang
dikotomi lebih memberikan informasi kekerabatan secara lebih jelas dibandingkan politomi.

Trifurcation / Politomi Unrooted Tree

Aplikasi filogenetik dalam sistematik dan taksonomi diantaranya adalah DNA barcoding.
Prinsip ini sama halnya dengan barcode di pusat perbelanjaan yang dipindai mesin untuk
mengetahui identitas produk. Pada analisis DNA barcode, barcode tersebut analog dengan
terdapat penanda (marker, sekuens DNA spesifik dalam genom) untuk mengidentifikasi suatu
spesies. Pemindai (scanner) yang digunakan adalah metode molekuler yang diawali dari PCR
(isolasi segmen spesifik) yang kemudian dilanjutkan sekuensing DNA (untuk mengetahui
urutan DNA). Bagian genom yang digunakan untuk identifikasi berbeda-beda pada tiap
kelompok organisme diantaranya adalah : gen COI (Cytochrome c oxidase subunit I) pada
hewan, segmen ITS (Internal Transcriber Spacer) pada fungi, gen 16S rRNA pada bakteri dan
rBCL atau MatK pada tumbuhan.
Gen COI merupakan gen penkode cytochrome C oxidase yang berperan dalam proses rantai
transport elektron dan memiliki panjang kurang lebih 1500 pasang basa. Gen ini berlokasi pada
genom mitokondria yang berbentuk sirkuler. COI 5P, bagian 5 gen COI sepanjang 600-650
pasang basa banyak digunakan sebagai marker DNA barcoding. Penggunaan COI 5P memiliki
keuntungan tersendiri diantaranya: gen ini hanya diturunkan secara maternal (dari pihak ibu)
dan tidak mengalami rekombinasi genetik, ada di semua organisme eukariotik, laju mutasi nya
tinggi sehingga urutannya berbeda antar spesies yang berbeda tetapi sama pada organisme yang
sama (conspecific), terdapat banyak salinan dalam satu sel dan telah disepakati secara
internasional untuk keperluan animal barcoding.

Ilustrasi Sel dan Segmen DNA COI dalam mitokondria

Langkah-langkah analisis filogenetik molekuler adalah sebagai berikut:

1. Pengumpulan Data DNA

Merupakan langkah awal analisis filogenetik molekuler. Data gen COI telah tersedia untuk
publik di situs repositori Gen Bank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) atau yang telah
dikurasi di BOLD system (http://www.boldsystems.org/) . Perbedaan kedua nya adalah pada
BOLD system data gen COI telah dicek validitasnya dan telah dianotasi (diberi keterangan).
Pada NCBI semua data penelitian dapat secara otomatis dideposit ke sistem dan
kemungkinan akurasinya lebih rendah (mungkin gen yang tersedia parsial atau masih
memiliki banyak error sekuensing).

2. Multiple Sequence alignment

Langkah ini digunakan untuk menjajarkan sekuens yang akan dibandingkan. Sekuens
tersebut tidak secara langsung bisa dibandingkan, karena dalam prosesnya sekuens tersebut
mengalami mutasi dan diantaranya adalah insersi atau delesi (indel) yang dapat mengubah
panjang sekuens. Algoritma penjajaran seperti CLUSTAL, Muscle atau MAFFT dapat
digunakan untuk merekonstruksi mutasi yang terjadi di pada sekuens tersebut sehingga
mencerminkan perubahan sekuens dari sekuens nenek moyang yang sebenarnya.
3. Tree Construction
Metode konstruksi pohon filogenetik terbagi ke dalam dua kategori utama yaitu distance
based method dan character based methods.

Dalam distance based method, semua data sekuens ditransformasi ke dalam distance matrix.
Metode ini berasumsi bahwa semua nukleotida yang digunakan bersifat additive dan
mengakumulasi mutasi sepanjang waktu secara konstan (mengikuti molecular clock).
Contoh metode distance methods adalah UPGMA dan neighbor joining. Metode ini cepat,
tetapi mungkin bias karena data sekuens yang penting secara evolusi mungkin hilang saat
transformasi dan tidak semua segmen DNA mengalami evolusi yang sama.

Pada character based method, karakter nukleotida tidak ditransformasi ke dalam numerik,
akan tetapi metode ini akan mengkonstruksi semua kemungkinan, kemudian berdasar
informasi sekuens, akan memilih pohon yang paling mungkin menggambarkan hubungan
evolusionernya. Metode ini lebih lambat, menggunakan algoritma yang lebih rumit serta
computationally intensive, tetapi menggambarkan proses evolusioner yang lebih realistis.
Contoh metode character based method diantaranya adalah maximum likelihood dan
parsimoni.

4. Statistical Support (Bootstraping)

Langkah terakhir adalah menentukan tingkat kekokohan (kredibilitas) dari cabang pada
pohon. Metode statistik boostraping digunakan untuk keperluan ini. Boostraping dilakukan
dengan mengkonstruksi pohon dengan data sekuens baru yang diperoleh dari pengacakan
data sekuens awal. Boostraping dilakukan sebanyak 100-1000 kali, dimana pada setiap
boostrap, program akan membuat sekuens baru (yang panjangnya sama dengan sekuens
awal) dan mengkonstruksi pohon filogenetik. Konsistensi percabangan dari semua pohon
disebut sebagai nilai bootstrap. Nilai bootstrap dilaporkan berupa persentase misalnya nilai
boostrap 67 % dari 1000 boostrap menunjukkan bahwa percabangan konsisten pada 670
pohon dari 1000 pohon yang dibuat. Nilai bootstrap yang menunjukkan cabang yang kokoh
dan memiliki validitas tinggi adalah diatas 70%. Jika nilainya dibawah nilai ini
kemungkinan taksa akan memiliki pola percabangan yang berbeda jika pohon dikonstruksi
dengan gen yang berbeda.

Tujuan dari praktikum ini adalah :

1. Studi taksonomi pada famili Fabaceae dengan DNA barcode ITS2
METODE
Filogenetik molekuler (15 sekuen)
GQ434357, GU217618, GU217659, GU217665, GU217655, GQ434750, GU217672,
GQ434348, GU217673, GU217633, GQ434346, GQ434352, GU217658, GU217624,
GU217670
1. Buka browser www.ncbi.nlm.nih.gov
2. Pada menu search ganti all database menjadi nukleotida.
3. Masukkan Accession Number atau keyword (nama gen dan organisme), klik Search

4. Ubah sekuens yang didapat menjadi format FASTA (klik FASTA, Send to > File >
Format FASTA > Create File)
5. Diperoleh sekuen gen dalam notepad

6. Untuk bahan multiple sequence alignment dan pohon filogenetik, buka halaman
notepad baru, lalu gabungkan 15 sekuens yang diperoleh dan susun dengan awalan
>(Nama Spesies). Kemudian simpan file tersebut dengan nama Sekuens ITS2
Fabaceae dan ubah extension .txt menjadi .fasta
Multiple Sequence Alignment dan Pohon Filogenetik dengan software MEGA

1. Buka software MEGA

2. Klik Align, kemudian klik Edit/built alignment dan pilih Retrieve sequence from file

3. Alignment sequences yang didapatkan dengan klik open pada file Sekuens ITS2
Fabaceae.fasta lalu Alignment by Muscle lalu klik Align DNA.
4. Pilih OK pada pop-up question Nothing selected for alignment. Select all?. Dan klik
compute pada pop-up selanjutnya.
5. Dilakukan analisis filogenetik dengan mengklik pada Data kemudian pilih
Phylogenetic analysis. Pilih Yes pada pop-up question protein-coding nucleotide
sequence data?
6. Kembali pada jendela utama aplikasi MEGA. Klik pada Phylogeny, kemudian buatlah
pohon filogenetik dengan metode Neighbor-Joining dengan mengklik pada
Construct/Test Neighbor-Joining Trees, klik Yes pada pop-up question Would you like
to use currently active data?. Pada opsi Test of Phylogeny pilih metode Bootstrap
dengan pengulangan 1000 kali.
 7. Setelah hasilnya keluar, bisa disimpan dengan cara klik image dan save as PNG file

Referensi:

Gao, Ting. Yao, Hui. et al. 2010. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae
using a potential DNA barcode ITS2. Journal of Ethnopharmacology 130: 116-121

Kumar, Sudhir. Stecher, Glen and Koichiro Tamura. 2016. MEGA7: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology
and Evolution 33(7): 1870-1874

Xiong, jin. 2006. Essential Bioinformatics. Cambridge: Cambridge University Press.

Catatan untuk praktikan:

Membawa laptop
Install program MEGA7 http://www.megasoftware.net/