SKORING DNA

LAPORAN

OLEH :

ANGGI PARLAGUTAN LUBIS

170301031
PEMULIAAN TANAMAN – A

LABORATORIUM GENETIKA MOLEKULER

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
F A K U L T A S P E R T A N I A N
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
2020
 SKORING DNA

LAPORAN

OLEH :

ANGGI PARLAGUTAN LUBIS

170301031
PEMULIAAN TANAMAN – A

Laporan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Dapat Memenuhi Komponen Penilaian
di Laboratorium Genetika Molekuler Program Studi Agroteknologi
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara

LABORATORIUM GENETIKA MOLEKULER

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
F A K U L T A S P E R T A N I A N
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
2020
Judul : Penentuan Skoring Marka DNA
Nama : Anggi Parlagutan Lubis
Nim : 170301031
Group : Pet - A

Diketahui Oleh,
Dosen Penanggung Jawab Laboratorium

(Ir. Eva Sartini Bayu, MP)

NIP. 196105061993032001

Diperiksa oleh : Diperiksa oleh :

Asisten Koordinator Asisten Korektor

(Bayu Atmaja Nirza) (Ivana Juliandri Siringoringo)

NIM. 160301191 NIM. 160301047
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan yang Maha Esa, karna

atas berkat rahmat dan karunianya penulis dapat menyelesaikan laporan ini tepat

pada waktunya.

Adapun judul laporan ini adalah “Penentuan Skoring Marka DNA”

yang merupakan salah satu syarat untuk dapat memenuhi komponen penilaian di

Laboratorium Genetika Molekuler Program Studi Agroteknologi Fakultas

Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada dosen

penanggung jawab Laboratorium Sitogenetika, yaitu: Ir. Eva Sartini Bayu, MP.,

Ir. Emmy Harso Khardinata, M.Sc., Dr. Diana Sofia Hanafiah, SP., MP., Dr. Ir

Revandy I.M Damanik, M.Si., M.Sc., Ph.D serta kakak - kakak asisten yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan laporan ini.

Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh

karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun.

Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih.

Medan , Mei 2020

Penulis

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR............................................................................................i

DAFTAR ISI..........................................................................................................ii

PENDAHULUAN
Latar Belakang.............................................................................................1
Tujuan Penulisan..........................................................................................2
Kegunaan Penulisan.....................................................................................3

TINJAUAN PUSTAKA

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Pratikum.......................................................................6
Alat dan Bahan.............................................................................................6
Prosedur Pratikum........................................................................................6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil…………………………………………………………………….. 7
Pembahasan……………………………………………………………. 12

KESIMPULAN

DAFTAR PUSTAKA

ii
 1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) merupakan salah

satu dari beberapa teknik pembuatan penanda berbasis DNA dengan melibatkan

penggunaan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction). Teknik PCR-RAPD dapat

digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan genotip normal dan abnormal,

berdasarkan perbedaan pada pita DNA yang dapat teramplifikasi dengan random

primer. Pita DNA yang berbeda akan dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui

perbedaan urutan basa DNA antara genotip normal dan abnormal

(Sembiring et al., 2015).

Marka (penanda) molekuler adalah sekuen DNA yang dapat diidentifikasi,

dan terdapat pada lokasi tertent pada genom, dan dapat diwariskan dari satu

generasi ke generasi berikutnya. Ibaratnya sebuah barcode, keberadaan marka

molekular tersebut secara prinsip memiliki perbedaan, sehingga untuk memilih

dan pengaplikasian harus dengan hati-hati. Definisikan marka genetik merupakan

gen yang terekspresi dan membentuk fenotip, biasanya mudah dibedakan,

digunakan untuk identifikasi individu atau sel yang membawanya, atau sebagai

probe untuk menandai inti, kromosom, atau lokus (Fatchiyah, 2011).

Konsentrasi primer berpengaruh terhadap intensitas produk PCR-RAPD.

Konsentrasi primer yang terlalu rendah atau yang terlalu tinggi menyebabkan

tidak terjadinya amplifikasi. Rasio yang rendah antara primer dan DNA cetakan

dapat menyebabkan produk RAPD yang dihasilkan tidak konsisten. Tiap primer

menghasilkan jumlah pita DNA yang berbeda. Pita yang muncul memiliki ukuran

basa dan intensitas pita yang bervariasi. Perbedaan intensitas pita DNA
 2

dipengaruhi oleh sebaran situs penempelan primer pada genom, kemurnian dan

konsentrasi genom dalam reaksi (Wibowo, 2010).

Penanda molekuler DNA yang ideal memiliki kriteria sebagai berikut: a)

memiliki tingkat polimorfisme yang sedang sampai tinggi, b) terdistribusi merata

diseluruh genom, c) memberikan resolusi perbedaan genetik yang cukup, d)

pewarisan bersifat kodominan (dapat membedakan kondisi homozigot dan

heterozigot dalam organisme diploid), e) berprilaku netral, f) secara teknik

sederhana, cepat dan murah, g) butuh sedikit jaringan dan DNA sampel, h)

berkaitan erat dengan fenotipe, i) tidak memerlukan informasi tentang genom

organisme. j) data mudah dipertukarkan antar laboratorium. Tidak ada satu jenis

penanda yang dapat memenuhi semua kriteria tersebut, bagaimana pun juga kita

dapat memilih diantara berbagai penanda yang ada dan saling dikombinasikan

untuk mencapai semua kriteria tersebut (Agarwal et al., 2008).

Penanda molekuler ini memiliki keuntungan dibandingkan dengan

penanda morfologi, yaitu stabil dan dapat dideteksi dalam semua jaringan

tanaman, serta tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Penanda molekuler DNA

tersebut dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu, pertama, penanda DNA tanpa

PCR (non-PCR based techniques) seperti RFLP, kedua, penanda DNA

berdasarkan PCR yang meliputi RAPD, AFLP, SSR, CAPS, SCAR, SSCP dan

DNA Barkoding (Sondur et al., 1996).

Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui teknik

amplifikasi PCR.
 3

Kegunaan Penulisan

Adapun kegunaan penulisan yaitu sebagai salah satu syarat untuk dapat

memenuhi komponen penilaian di Laboratorium Genetika Molekuler Program

Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dan

sebagai sumber informasi bagi pihak yang membutuhkan.

 4

TINJAUAN PUSTAKA

RAPD merupakan salah satu penanda DNA yang dapat digunakan untuk

mengkarakterisasi dan mempelajari keragaman genetik. RAPD dihasilkan melalui

amplifikasi DNA berdasarkan Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil RAPD

dipisahkan melalui teknik elektroforesis dan diwarnai dengan pewarna sehingga

terlihat berbagai ukuran pita DNA (Arisetianingsih et al., 2010).

Pita polimorfik adalah pita yang tidak terdapat pada seluruh sampel.

Jumlah pita polimorfik hasil amplifikasi berbeda-beda. Semakin banyak pita

polimorfik yang dihasilkan akan semakin mudah untuk mengamati adanya variasi.

Pita polimorfik terbentuk dari perbedaan ukuran pita yang terbentuk pada setiap

sampel yang diteliti. Pola pita yang terbentuk oleh setiap sampel unik dan

berbeda-beda (Azizah, 2009).

Data pita DNA yang diperoleh pada umumnya akan dianalisa dengan

menggunakan data biner dengan melakukan skoring, yakni skor 1 untuk pita yang

muncul dan skor 0 untuk pita yang tidak muncul. Hal inilah metode penggunaan RAPD

disebut dengan sifat dominan karena hanya mendeteksi alel per lokus. Selanjutnya hasil

skoring tersebut dapat dianalisis sesuai dengan kebutuhan dengan menggunakan

bantuan software komputer seperti program GenAlEx, program POPGENE dan

software UVITEC Cambridge FireReader (Weising et al., 2005).

Analisis data molekuler dilakukan dengan metode skoring terhadap

pita DNA hasil PCR yang muncul pada elektroforesis gel poliakrilamid

8%. Pita-pita yang terlihat dianggap sebagai satu alel. Pita-pita DNA yang

memiliki laju migrasi yang sama dianggap sebagai lokus yang sama. Pada

laju migrasi yang sama, setiap pita yang terlihat diberi skor 1, pita yang

tidak terlihat diberi skor 0. Sampel yang tidak teramplifikasi diberi skor 9
 5

dan dianggap sebagai data yang hilang, sehingga hasil skoring pita berupa

data biner (Nugroho et al., 2017).

Beberapa faktor yang mempengaruhi reproduksibilitas reaksi PCR RAPD

adalah kualitas dan kuantitas DNA, buffer PCR, konsentrasi MgCl2, rasio primer

terhadap template, suhu annealing, enzim Taq polimerase, dan mesin PCR yang

digunakan. Namun untuk mengurangi hal tersebut dapat diatasi dengan memenuhi

standar protokol ekstraksi DNA untuk meminimalisir kontaminan, melakukan

optimasi, melakukan seleksi primer dengan reproduksibilitas pita yang tinggi, dan

menggunakan bahan PCR yang terpercaya (Lynch dan Milligan, 1994).

 6

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Praktikum

Adapun praktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa, 29 April 2020 pada

pukul 13.00 WIB sampai dengan selesai di Laboratorium Genetika Molekuler

Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara pada

ketinggian ± 32 m dpl.

Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan selama praktikum yaitu, alat tulis untuk

mencatat, serta kamera untuk dokumentasi.

Adapun bahan yang digunakan selama praktikum yaitu hasil dokumentasi

dari elektroforesis PCR sebagai media dalam penentuan skoring.

Prosedur Praktikum

- Diskoring produk PCR-RAPD untuk menentukan keragaman genetik

berdasarkan muncul tidaknya pita DNA.

- Diasumsikan pita yang muncul pada gel sebagai alel RAPD

- Ditentukan keragaman alel RAPD dari perbedaan migrasi alel pada gel dari

masing- masing individu sampel

- Diterjemahkan profil pita berdasarkan ada atau tidaknya pita kedalam data

biner.

- Diberi kode -1 (ada) dan -0 (tidak ada) pada pita yang muncul

Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan dengan

menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader.

 7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil
8
9
10
 11

Ket :

- Panjang Basepairs N1 adalah 3.500.000

- Panjang Basepairs N2 adalah 2.250.000

- Panjang Basepairs N3 adalah 2.250.000

- Panjang Basepairs N4 adalah 3.500.000

- Panjang Basepairs N7 adalah 2.250.000

- Panjang Basepairs N11 adalah 3.500.000

 12

- Panjang Basepairs N12 adalah 2.250.000

- Panjang Basepairs N14 adalah 2.250.000

- Panjang Basepairs N16 adalah 3.500.000

- Panjang Basepairs N17 adalah 2.250.000

- Panjang Basepairs N18 adalah 2.250.000

- Panjang Basepairs N21 adalah 2.300.000

- Panjang Basepairs N22 adalah 2.500.000

- Panjang Basepairs N23 adalah 2.500.000

- Panjang Basepairs N24 adalah 2.500.000

- Panjang Basepairs N25 adalah 5.000.000

- Panjang Basepairs N26 adalah 4.000.000

- Panjang Basepairs N27 adalah 2.750.000

- Panjang Basepairs N29 adalah 4.500.000

- Panjang Basepairs N30 adalah 4.500.000

Pembahasan

Skoring adalah suatu teknik dalam penentuan atau pemberian kode pada

pita yang muncul. Berdasarkan pada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan

kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1 dan 0 jika tidak ada. Hal ini

sesuai dengan literatur Sembiring (2015) yang menyatakan bahwa Teknik PCR-
 13

RAPD dapat digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan genotip normal dan

abnormal, berdasarkan perbedaan pada pita DNA yang dapat teramplifikasi

dengan random primer.

Pita polimorfik yaitu pada hasil amplifikasi menunjukkan adanya

perbedaan komponen nukleotida. Dalam untaian DNA, nukleotida yang berbeda

bisa dikarenakan adanya peristiwa delesi maupun inersi pada DNA. Hal ini sesuai

dengan literatur Sondur (1996) yang menyatakan bahwa Penanda molekuler ini

memiliki keuntungan dibandingkan dengan penanda morfologi, yaitu stabil dan

dapat dideteksi dalam semua jaringan tanaman, serta tidak dipengaruhi oleh

lingkungan.

Pita monomorfik adalah pita yang menunjukkan adanya sekuen DNA

yangsama yang teramplifikasi. Perubahan kondisi reaksi dan intensitas pita yang

dihasilkan bervariasi sehingga menyulitkan dalam skoring pola pita. Hal ini

sesuailiteratur Azizah (2009), yang menyatakan bahwa Pita polimorfik terbentuk

dari perbedaan ukuran pita yang terbentuk pada setiap sampel yang diteliti. Pola

pita yang terbentuk oleh setiap sampel unik dan berbeda-beda

Berdasarkan ada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan kedalam data

biner. Pita yang muncul diberi kode 1 (ada) dan 0 (tidak ada). Penanda

RAPDbersifat dominan, fragmen DNA yang dihasilkan tidak dapat

membedakanindividu yang memiliki genotipe homozigot dengan heteroizigot. Hal

ini sesuai literatur Weising (2005) yang menyatakan bahwa Data pita DNA yang

diperoleh pada umumnya akan dianalisa dengan menggunakan data biner dengan

melakukan skoring, yakni skor 1 untuk pita yang muncul dan skor 0 untuk pita

yang tidak muncul.

 14

Faktor yang mempengaruhi pita DNA yang terlalu tipis atau tidak begitu

jelas dikarenakan pada saat proses PCR kurang optimal. Hal ini sesuai literatur

Lynch dan Milligan (1994) yang menyatakan bahwa Beberapa faktor yang

mempengaruhi reproduksibilitas reaksi PCR RAPD adalah kualitas dan kuantitas

DNA, buffer PCR, konsentrasi MgCl2, rasio primer terhadap template, suhu

annealing, enzim Taq polimerase, dan mesin PCR yang digunakan

 15

KESIMPULAN

1. Skoring adalah suatu teknik dalam penentuan atau pemberian kode pada pita

yang muncul.

2. Pita polimorfik yaitu pada hasil amplifikasi menunjukkan adanya perbedaan

komponen nukleotida.

3. Pita monomorfik adalah pita yang menunjukkan adanya sekuen DNA yang

sama yang teramplifikasi.

4. Berdasarkan ada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan kedalam data

biner. Pita yang muncul diberi kode 1 (ada) dan 0 (tidak ada).

5. Faktor yang mempengaruhi pita DNA yang terlalu tipis atau tidak begitu jelas

dikarenakan pada saat proses PCR kurang optimal.

 16

DAFTAR PUSTAKA

Sembiring, I. M. S., Lollie, A. P. Pdan Hot, S. 2015. Aplikasi Penanda Lima

Primer RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) untuk Analisis
Keragaman Genetik Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC)
Sumatera Utara. USU. Medan.

Arisetianingsih, R.E.D., Totok, A.D.H dan Prakoso, B. 2010. Keragaman Genetik

Kedelai Berdasarkan Pola Pita DNA Hasil RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA). Universitas Jenderal Soedirman.
Purwokerto.

Azizah, A. 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi Dna Daun, Bunga Kelapa
Sawit Normal dan Abnormal. Institut Pertanian Bogor . Bogor.
Wibowo, C. H. 2010. Andaliman, Rempah Tradisional Sumatera Utara Dengan
Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba. Bul. Teknol. Dan Industri
Pangan.

Sondur, S.N., R.M. Manshardt, and J.I. Stiles. 1996. A genetic linkage map of
papaya based on randomly amplified polymorphic DNA markers.
Theoretical and Applied Genetics.

Weising, K., H. Nybom, K. Wolff, and G. Kahl. 2005. DNA Fingerprinting in

Plants: Principles, Methods, and Applications. Second Edition.
Taylor & Francis Group. Boca Raton.

Lynch, M. and B.G. Milligan. 1994. Analysis of population genetic structure with
RAPD markers. Molecular Ecology.

Agarwal, M., N. Shrivastava, and H. Padh. 2008. Advances in molecular marker

techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell
Reporter.

Fatchiyah, A. 2011. Biologi Molekuler: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Penerbit

Erlangga.

Nugroho, K., Rerenstradika, T.T., Reflinur, Asadi dan Puji, L. 2017. Analisis
Keragaman Genetik Kedelai Introduksi Menggunakan Marka
Mikrosatelit. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi
dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Bogor.