PRAKTIKUM TEKNIK ANALISA MIKROORGANISME

KP A

Modul VI : DETEKSI Salmonella spp PADA PANGAN DENGAN MEODE

PCR

Selasa, 17 Maret 2020

Nama Praktikan:

1. Giveny Grace Wibisono 170118029

2. Clarita Devina 170218030

Asisten Dosen:

1. Johanna Melisa R. 170117028

2. Meliana Setiawan 170117067

Dosen:

1. Ernest Suryadjaja,S.Si.,M.App.Sc.
2. Dr.rer.nat.Theresia Desy Askitosari,S.Si.,M.Biotech.

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI

UNIVERSITAS SURABAYA

2020

1
I. JUDUL
Deteksi Salmonella spp Pada Pangan Dengan Metode PCR.

II. TUJUAN
Mendeteksi adanya Salmonella spp pada sampel makanan dengan
menggunakan metode PCR.

III. DASAR TEORI

Salmonella merupakan bakteri berbentuk batang, tidak berspora, dan pada
pewarnaan gram bersifat gram negative. Bakteri Salmonella berkembang
pada saluran pencernaan binatang seperti babi, sapi, dan ayam. Bakteri tersebut
kemudian menyebar melalui makanan hingga menginfeksi manusia. Tak jauh
beda dengan binatang, saat menginfeksi manusia, Salmonella bersarang di saluran
pencernaan, mulai dari lambung hingga usus halus. Umumnya, bakteri Salmonella
menimbulkan salmonellosis berupa penyakit tifus atau paratifus. Seseorang yang
terinfeksi bakteri Salmonella, akan menunjukkan gejala berupa diare, kram perut,
demam dan sakit kepala, mual, bahkan muntah-muntah. Suhu tubuh pun tidak
stabil dan cenderung tinggi. Dari masa inkubasi hingga munculnya gejala pertama
memakan waktu antara 8-72 jam. Salmonellosis pada manusia cukup berbahaya
karena bisa menyebabkan kematian. Sangat fatal jika menyerang bayi, balita, ibu
hamil, dan orang lanjut usia (Ikawikanti, 2012).
DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. Komponen basa nitrogen pada DNA terdiri dari Adenin (A),
Guanin (G), Timin (T), dan Sitosin (C). Reaksi berantai polimerase atau lebih
umum dikenal sebagai PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik
atau metode perbanyakan DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu
relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan
DNA. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi
molekuler karena relatif mudah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

2
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang dilakukan berulang-ulang antara 20-
30 kali siklus. Ada tiga tahap utama: (Pestana et al., 2010).
1. Tahap denaturasi: Berlangsung pada suhu 94-96℃ ikatan hydrogen DNA
terputus dan DNA untai ganda menjadi tunggal. Tahap ini biasanya
dilakukan lebih lama agar memastikan DNA terpisah. Pemisahan
menyebabkan DNA siap dijadikan template untuk primer.
2. Tahap penempelan: Primer akan menempel dengan template DNA.
Dilakukan pada suhu 45-60℃ . Umumnya hanya perlu waktu 1-2 menit.
3. Tahap pemanjangan: Tergantung jenis enzim DNA polymerase yang
dipakai. Dengan Taq polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu
70-76°C. Pada tahap ini DNA polimerase akan memasangkan dNTP yang
sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan
dipasang dNTP, begitu seterusnya (pasangan A adalah T, dan C dengan G,
begitu pula sebaliknya).
Hasil PCR adalah produk berupa 50-10000 bp bagian spesifik
genomeyang dapat dianalisis dengan elektroforesis gel atau sekuensing DNA
(Mufty, 2008). Keunggulan real-time PCR lainnya ialah analisis dapat dilakukan
tanpa membuka tabung sehingga mengurangi resiko kontaminasi amplikon PCR
atau molekul target lainnya. Aplikasi teknologi real-time PCR mengurangi waktu
penanganan atau pengujian dan meningkatkan keakuratan kuantifikasi metode
PCR. Sebelum tahap amplifikasi dengan real-time PCR, diperlukan tahap
persisapan/pra-amplifikasi, kemudian setelah tahap amplifikasi diperlukan
evaluasi produk real-time PCR. Tahap pra-amplifikasi PCR standard dan real-time
PCR tidak berbeda, meliputi persiapan sampel bakteri dan isolasi DNA untuk
memperoleh isolat DNA sebagai DNA target amplifikasi. Protokol yang baik
dalam mempersiapkan isolat DNA adalah fokus pada tahap
pengumpulan/pemanenan patogen, penghilangan inhibitor yang terdapat pada
pangan atau pada media kultur, dan pengisolasian DNA. Metode pendidihan
(boiling method) merupakan salah satu metode untuk mengisolasi/ mengekstraksi
DNA dari sel mikroba. DNA yang berasal dari bakteri Gram negatif dapat dengan
mudah diisolasi/diekstraksi dengan menggunakan metode pendidihan/
mendidihkan sel bakteri di dalam air ( Lee et al., 2006).

3
IV. ALAT dan BAHAN
a. Alat
 Instrumen PCR  Mikro pipet
 Perangkat gel  Sentrifuge
elektroforesis  UV transilluminator
 Heating plate  Power supply
 Tabung PCR
b. Bahan
 Primer S139 (5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’) dan
S141 (5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’)
 Aquades steril
 Agarosa
 PCR kit : Taq pol, buffer+MgCl2, dNTP
 Ethidium bromide
 Buffer TAE
 Loading buffer
 DNA molecular weight marker (100 bp ladder)

V. SKEMA KERJA
1. PCR dari proses pengayaan sampel atau dari kultur murni
25 gr sampel
225 ml pepton water (PW)
Diblender 2’

Diinkubasi 37°C, 6-8 jam

4
 1 ml PW

Direbus 5’

Sentrifuge 6000 rpm, 5’

Supernatan digunakan sebagi template

2. PCR
PCR
6.75 μl ddH2O steril
4 μl HF buffer
2 μl primer foward
2 μl primer reverse

2 μl dNTP
1.25 μl lisat/supernatant APW
2 μl Taq polimerase

Inkubasi 95°C 1’, denaturasi 95°C 1’, primer annealing 60°C 30”, primer
extension 72°C 30”, final extension 72°C 7’
3. Analisis pada gel agarose
Hasil PCR
agarose 1.5%
TAE 1x
Dijalankan analisis beda potensial 5V

5
VI. HASIL PENGAMATAN
No Nama Gambar Hasil Keterangan
.
1 NA
plate

2 Marker

3 Kontrol
+

4 Kontrol
-

6
 5 PCR

VII. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, biakan Salmonella pada NA petri dari modul
sebelumnya akan dideteksi dengan PCR. Banyak uji yang berbasiskan DNA, tapi
hanya metode probe, PCR dan bakteriofag yang telah dikembangkan secara
komersial untuk mendeteksi patogen pencemar pangan (foodborne patogen).
Tahap awal praktikum ini ialah menyiapkan primer Salmonella. Primer
Salmonella kosong ditambah TE Buffer sesuai dengan petunjuk pada kemasan.
Tahap kedua adalah pembuatan template DNA dimana 1 ujung ose koloni
Salmonella dimasukkan kedalam 20 mikrolit akuades steril dalam tube. Kemudian
dilakukan boiling lysis dengan tujuan mengisolasi/ mengekstraksi DNA dari sel
Salmonella. Pendidihan mempermudah proses denaturasi rantai DNA ketika
amplifikasi dengan PCR. Tahap isolasi DNA dengan pemanasan ini dilakukan
jika mikroba sudah melalui enrichment dimana biakan Salmonella yang kami
gunakan sudah melalui tahap tersebut. Harus enrichment terlebih dahulu karena
dapat menyembuhkan sel maupun memperbanyak sel agar lebih yakin bahwa
mikroba yang diisolasi adalah mikroba hidup. Kemudian di-sentrifuge untuk
menarik semua isi yang ada di pcr tube agar tercampur rata dan tidak tertinggal
dibawah. Tahap selanjutnya adalah mereaksikan komponen PCR dengan
komposisi : Master mix 2x, primer F, primer R, DNA template, NFW. Semua
bahan selain DNA template ditaruh terlebih dahulu pada tube karena …………
Diperlukan semua komponen terebut karena mengandung buffer khusus yang
dapat menjaga pH optimum, NaCl, MgCl2 yang sebagai kofaktor untuk Taq
polymerase berjaan optimal. Semua komponen dan tube PCR usahakan dalam

7
keadaan dingin agar mencegah denaturasi protein/ enzim. Setelah semua
tercampur, divortex dan di spin down.
Dilakukan PCR untuk melihat pita-pita untuk mendeteksi adanya DNA
yang kita inginkan terekspresi. Setelah proses amplifikasi DNA, dilakukan
elektroforesis untuk memisahkan komponen bermuatan berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam medan listrik. Data yang didapat tidak sesuai dengan
literatur, karena band tidak terlihat pada gel elektroforesis. Band yang tidak
terlihat ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti template DNA yang
sudah tidak segar lagi, Waktu denaturasi yang terlalu lama sehingga dapat
menyebabkan DNA terdegradasi (Kiskároly et al., 2017)

VIII. KESIMPULAN
Berdasarkan data yang didapat, pada sampel makanan yang diuji, tidak
terdapat Salmonella spp, hal ini terlihat dari hasil PCR yang tidak terdapat band
pada gel elektroforesis.

IX. DAFTAR PUSTAKA

Ikawikanti, Anas. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Salmonella spp Pada
Lingkungan Peternakan Ayam Broiler di Kota Malang. FKH UB, 1-10.
Kiskároly, F., Morić, I., Đokić, L., Vasiljević, B., Šenerović, L., & Mišić, D.
2017. Development of PCR-based identification of Salmonella enterica
serovars. Acta Veterinaria, 67(2), 271-284.
Lee MD, Fairchild A. 2006. Sample Preparation for PCR. In: Maurer, J (ed.).
Food Microbiology and Food Safety: PCR Methods in Foods. USA:
Springer.
Mufty MM. 2008. Application of a real time PCR methode for detection of
Salmonella spp. in shrimp and scallop and its partial validation.
Fisheries Training Programme. Iceland : The United Nation University.
Pestana EA, Belak S, Diallo A, Crowther JR, Viljoen GJ. 2010. Early, Rapid, and
Sensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real-Time PCR Application.
Dordrecht: Springer.