WEEK 8: KULTUR MERISTEM DAN EMBRIO

- Meristem → jaringan yang bersifat meristematik (terus membelah)

o Meristem apikal → pucuk batang
 Fungsi: membentuk tunas daun, tunas aksiler
 Dapat diisolasi dan dipergunakan untuk proses KJT
 Keuntungan → jaringan yang sangat tertutup (ditutupi oleh daun) → lebih bebas dari
hama penyakit
 Kultur meristem dapat dimanfaatkan untuk hasilkan bibit yang bebas hama
o Kultur meristem

 Dibuat dengan cara membuat sayatan pada bagian …. (bagian ujung tunas) →
dikultur pada media → menjadi tanaman utuh (planlet) → diaklimatisasi
 Menggunakan tunas apikal atau tunas aksiler → sama-sama punya meristem apikal
 Aplikasi kultur meristem → apel bebas virus → diberi perlakuan termoterapi pada
tunas apikal
 Isolasi tunas apikal dan tunas aksiler dari tanaman apel → diambil ujung tunasnya
→ dikultur → jadi planlet → diberi perlakuan panas (untuk bunuh virus yang
mungkin terdapat pada eksplan) → meristem dari planlet diambil → planlet apel
→ diambil sampel jaringan → diuji ELISA dan RT-PCR (lihat virus masih ada
atau tidak) → planlet ditanam di lapangan
  Sterilisasi: tunas direndam pada larutan 10% NaOCl → dicuci 3x pakai aquades
steril → ditanam pada media MS + 1 BA + 0.3 IBA + 0.2 GA (mg/L)
 Ketika melakukan kultur meristem → kadang tanaman tidak selalu mampu
menghasilkan akar → ada beberapa kasus harus dipindahkan ke media yang
membantu regenerasi akar
 Proses regenerasi akar dapat dilakukan dengan:
o media mengandung ZPT auksin
o menurunkan kadar garam-garam/ mineral dalam media
o pengakaran dilakukan secara ex vitro dengan menggunakan pasta pada bagian
pangkal pangkal planlet sebelum ditanam ke media tanah
 Faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur meristem
 Ukuran eksplan → meristem ukurannya kecil → kemungkinan rusak sangat tinggi
→ menghambat proses pertumbuhan kultur meristem
 Status fisiologi dari tanaman: tunas diambil dari batang yang letaknya lebih tinggi
→ lebih baik dari meristem yang diambil pada batang yang terletak di bagian
bawah
 Komposisi media → perbedaan vitamin dan ZPT →berpengaruh terhadap
kemampuan tumbuh dari eksplan
- Kultur embrio
o Embrio terbentuk dari fertilisasi ovum oleh sperma pada bakal biji di dalam ovarium
o Hasil fertilisasi → zigot → terus berkembang jadi embrio (versi mini dari tanaman yang
terletak di dalam biji)
o Embrio pada tanaman terdiri atas kotiledon, shoot apex (ujung tunas), root apex (ujung
akar)
o Dapat dilakukan melalui dua cara: embrio yang sudah dewasa dan embrio yang masih
muda
o Fungsi:
 Mengatasi post-zygotic incompability → ketika melakukan penyilangan (beda spesies
maupun spesies sama) → ketika zigot terbentuk akan ada mekanisme, di mana induk
akan menghambat pertumbuhan dan perkembangan zigot menjadi embrio → ovum
yang sudah difertilisasi gagal berkembang jadi embrio
 Diatasi dengan kultur embrio yang belum matang → 3-4 hari setelah fertilisasi →
bakal buah diambil (atau jika embrio cukup besar, embrionya yang diambil) →
dikultur pada media → bisa jadi 1 tanaman utuh
 Memecah dormansi: beberapa biji memiliki waktu dormansi yang panjang (sampai 1
tahun untuk berkecambah) → KJT bisa mempersingkat waktu → dengan bantuan
ZPT GA untuk mempercepat perkecambahan
 Mempersingkat waktu penelitian
o Contoh: proses regenerasi menggunakan embrio yang belum matang, dari jagung
hybrid.
  Embrio yang belum matang ditumbuhkan pada media yang mengandung 2.4-D →
berkecambah pada awalnya → tumbuh menjadi tanaman jagung utuh → bagian
tertentu dari embrio yang tumbuh/ berkecambah → menjadi kalus

 Kalus diinduksi melalui proses organogenesis/embriogenesis → organogenesis hanya

hasilkan organ akar/batang, embriogenesis hasilkan dua-duanya
 Jika hanya muncul tunas diinduksi sehingga bisa muncul akar → planlet →
diaklimatisasi → tanaman jagung ditanam ex vitro
o Contoh: menginduksi/regenerasi kalus dari embrio dewasa pada tanaman padi
 Embrio dewasa diperoleh dari mengkultur biji tanaman padi yang sudah padi
 Tanaman padi → diinduksi 2.4-D → berkecambah menjadi akar dan tunas → dari
pangkal tunas muncul kalus → kalus diinduksi supaya hasilkan akar atau green spot
→ green spot akan tumbuh jadi tunas → tunas tumbuh jadi planlet padi

 WEEK 9: KULTUR KALUS, SUSPENSI SEL, DAN RAMBUT AKAR

- Kalus adalah kumpulan sel tumbuhan yang tidak terdiferensiasi → secara alami kalus
terbentuk pada daerah perlukaan → dapat diinduksi secara in vitro dengan bantuan ZPT
o ZPT untuk induksi kalus:
 Auksin (NAA, IAA) dan sitokinin (Zeatin, BAA) dengan komposisi sedang →
seimbang
 Auksin saja (2.4-D)
 Tanaman tertentu bisa diinduksi oleh hormon Brassinosteroids atau asam absisat
o Karakteristik kalus
 Friable → banyak tonjolan, ditekan dengan pinset mudah terpisah
 Tipe yang bisa diregenerasi
 Kalus dapat diregenerasi menjadi 3 macam:
o Beregenerasi jadi tunas → media mengandung sitokinin
o Beregenerasi jadi akar → media mengandung auksin
o Kalus organogenik → hanya muncul tunas/akar saja
o Kalus embriogenik → bersifat bipolar (kalus yang terbentuk akan terdiri dari
tunas dan akar)
 Compact → tidak mudah pecah
- Organ yang dapat digunakan untuk diinisiasi pembentukan kalusnya
o Embrio
o Akar → biasanya kalus muncul di bagian perlukaan
o Batang → biasanya kalus muncul di bagian perlukaan
o Daun
- Aplikasi kultur kalus
o Perbanyakan/ propagasi → prinsip totipotensi → setiap sel dari kalus bisa diregenerasi
menjadi satu tanaman utuh
 Propagasi dari kalus → rentan mengalami perubahan genetik (variasi somaklonal) →
dimanfaatkan untuk perbaikan sifat tanaman → dikenal dengan seleksi somaklonal
o Pemuliaan tanaman
o Seleksi in vitro → hasilkan tanaman yang punya ketahanan dengan cara menumbuhkan
kalus pada media yang sudah diberi perlakuan (misal: mau tanaman tahan kadar garam
tinggi → kalus ditumbuhkan pada media semisolid yang mengandung kadar garam tinggi
→ kalus yang berhasil bertahan diregenerasi menjadi tanaman utuh)
o Bahan baku untuk suspensi sel dan protoplas
 Protoplas digunakan untuk pemuliaan tanaman → misal: pada fusi protoplas → untuk
menghasilkan tanaman dengan sifat baru yang dilakukan dengan mengkombinasikan
2 protoplas dari spesies yang berbeda
 o Produksi metabolit sekunder → kalus tumbuh dengan cepat dan sel yang seragam →
metabolit sekunder dalam jumlah besar
- Suspensi sel → kalus friable dipindahkan pada media cair
o Kelebihan: seluruh sel mendapatkan nutrisi yang lebih baik → karena hampir semua sel
berkontak dengan media
o Kultur suspensi sel berjalan dengan baik → perlu agitasi (pengadukan) → pakai shaker
(gerakan mendatar)
 Fungsi pengadukan: memecah kalus menjadi kelompok sel kecil, menjaga distribusi
sel tetap seragam dalam medium, aerasi (mendapat oksigen dengan baik →
metabolisme seragam)
- Kultur rambut akar (contoh dari kultur organ)

o Dapat diinduksi menggunakan bakteri Rhizobium rhizogenes

o Bakteri secara alami menginfeksi tanaman yang mengalami luka → pada area luka,
bakteri menginduksi munculnya akar
o Pembuatan: organ diinfeksi Rhizobium rhizogenes → komponen t-plasmid pada bakteri
berpindah ke sel tanaman → memicu terbentuknya akar → akar terbentuk → dipindah
dan diperbanyak pada media KJT
o Pembuatan kultur suspensi sel → menggunakan erlenmeyer → diagitasi
o Manfaat:
 Sintesis protein rekombinan
 Meningkatkan produksi metabolit sekunder → beberapa metabolit diproduksi pada
organ spesifik (mis: beberapa tanaman metabolit sekunder disintesis di akar)
 Fitoremediasi → akar punya kemampuan menyerap berbagai jenis pencemar di
lingkungan
 Plant breeding
o Protein rekombinan yang sudah diproduksi menggunakan kultur akar:
 WEEK 10: METABOLIT SEKUNDER

- Pada tumbuhan metabolit dibagi menjadi dua

o Metabolit primer → metabolit yang dibutuhkan agar tumbuhan bisa hidup (glukosa,
selulosa, dll)
 Tanpa keberadaan metabolit primer → tanaman tidak bisa hidup
o Metabolit sekunder → senyawa yang diproduksi bagi tumbuhan dan bermanfaat bagi
tumbuhan untuk bertahan hidup, menarik polinator, mengusir hama/penyakit

 Disintesis dari metabolit primer atau melalui jalur sintesis metabolit primer pada
tumbuhan
 Produksinya dapat direkayasa melalui:
 Mengatur komposisi nutrisi
 Menambahkan senyawa elisitor → senyawa yang dapat memicu produksi
metabolit sekunder
o Elisitor merupakan molekul yang menstimulasi pertahanan diri atau respon
yang diinduksi stres pada tanaman. Elisitor juga didefinisikan sebagai senyawa
yang diberikan pada kadar kecil pada sistem sel hidup untuk menginisiasi atau
meningkatkan biosintesis senyawa-senyawa tertentu
 Pemberian inhibitor → menghambat jalur metabolit tertentu sehingga dapat
meningkatkan produksi salah satu metabolit tertentu
  Metabolit sekunder memiliki banyak manfaat bagi manusia

- Metabolit sekunder dengan KJT

o Fungsi KJT:
 Mensintesis metabolit secara kimia → tidak sederhana → melibatkan banyak reaksi
(beberapa reaksi belum ditemukan cara kimia untuk mensintesisnya)
 Tanaman melimpah, tetapi pertumbuhan tanaman atau senyawa yang terkandung
sangat terpengaruh oleh musim → beberapa tanaman hanya tumbuh pada musim
tertentu → dengan KJT dapat menanam tanaman sepanjang tahun dengan
merekayasa lingkungan tumbuhnya yang terkontrol
 Beberapa tanaman yang menghasilkan metabolit beberapa dari tanaman langka atau
menjadi langka karena eksploitasi berlebihan → dengan KJT dapat mengambil organ
atau jaringan dari tanaman tersebut tanpa harus merusak tanaman, diperbanyak
secara in vitro, dirangsang untuk hasilkan metabolit → mencegah kepunahan
 Beberapa kultur dalam KJT → menghasilkan metabolit yang berbeda dari tanaman
asal
o Senyawa-senyawa yang hanya diproduksi di dalam kultur jaringan:

o Tanaman pada KJT mampu memproduksi senyawa yang tidak ditemukan pada tumbuhan
yang di alam → ketika lingkungan berbeda → memicu perubahan metabolisme yang ada
pada tumbuhan
 Perubahan lingkungan dapat menghambat salah satu metabolit sekunder →
menyebabkan akumulasi produk intermediet → dapat dideteksi dan di ekstrak
o Produksi metabolit sekunder:
 Kultur yang dapat digunakan:
 Kultur tumbuhan lengkap
 Kultur organ
 Kultur sel (suspensi kalus atau kalus) → meskipun tumbuh secara cepat, kalus
punya metabolisme yang berbeda dengan akar → tidak semua kultur bisa
menggunakan kalus/ suspensi sel
 Strategi pengoptimalan produksi metabolit sekunder secara in vitro
 Manipulasi kondisi kultur → mengatur komposisi media, ZPT, vitamin, sumber
karbon, pencahayaan, temperatur
 Seleksi sel line yang tepat → pada proses seleksi → sel yang digunakan
kemampuan produksinya seragam → didapat metabolit yang optimal
 Elisitasi → zat yang dapat memicu produksi metabolit sekunder → dari
komponen biotik (enzim/toksin patogen), senyawa cekaman abiotik (misal: logam
berat)

o Cara kerja elisitor biotik: elistor → diterima oleh reseptor yang ada di
permukaan sel → memicu respon stress di dalam tumbuhan → tumbuhan
produksi metabolit tertentu → kultur bisa hasilkan metabolit yang lebih tinggi
o Contoh:

 Immobilisasi sel → dapat diterapkan apabila metabolit disekresikan keluar sel →

pada kultur suspensi diletakkan pada matriks tertentu
 Kultur hairy root → beberapa metabolit hanya diproduksi di akar dan beberapa
metabolit memang bisa diproduksi dengan kultur kalus, namun kalus terkadang
tidak stabil sehingga hasilnya bervariasi
o Hairy root diinduksi dengan cara mentransformasi tanaman menggunakan
Agrobacterium rhizogenes
o Dibuat dengan melukai tanaman → diinfeksi Agrobacterium rhizogenes → t-
DNA dari Agrobacterium dimasukkan ke sel-sel tanaman → daun
menghasilkan akar → akar ini dapat dikultur terus-menerus
 o Alasan: tumbuh dengan cepat, tidak menggunakan hormon pada medianya,
akar sudah terdiferensiasi (hampir menyerupai akar asli) dan secara fenotip
stabil, kultur akar dapat diinduksi hampir di semua spesies tanaman, bisa
diinduksi menggunakan elisitor
o Tingkat pertumbuhan tiap spesies berbeda-beda
o Pemberian ABA dapat menurunkan pertumbuhan akar
o Contoh:

 Biotransformasi → menambahkan gen-gen tertentu dari luar → supaya mampu

memproduksi metabolit tertentu
o Membuat konstruksi gen (promoter-gen-reporter-terminator)
o Setelah ditransformasi dicek → konfirmasi keberadaan gen yang diinsersikan
dan dicek pengaruh transformasi
 Meningkatkan permeabilitas sel → baik produk maupun bahan baku dapat dengan
mudah keluar masuk sel
 WEEK 12: KULIAH TAMU

-
-
o

 WEEK 13: KENDALA KJT

- Kontaminasi → jamur/bakteri
o Dapat terjadi karena tanaman itu sendiri → kontaminan tumbuh disekitar organ yang
digunakan sebagai eksplan

 Sumber penyakit ada di dalam jaringan tumbuhan → misal jamur endofit (hidup di
jaringan pembuluh → solusi: kultur meristem (pada meristem belum ada jaringan
pembuluh)
 Jika bukan endofit → menemukan metode sterilisasi yang tepat → dicoba-coba
 Mengambil tanaman dari luar → biasanya bakterinya sangat banyak → tanaman
tumbuhkan di greenhouse → ditreatment (anti bakteri, anti jamur) → pretreatment
o Bersumber dari pekerja → kontaminasi ada di luar eksplan (bisa di media)

 Keteledoran → tidak teliti → misal: tangan ada di atas media (mengandung spora
jamur yang jatuh ke media), tidak menutup botol dengan benar
- Variasi somaklonal → terutama jaringan yang digunakan adalah jaringan dewasa, dipicu
untuk dediferensiasi
o Variasi somaklonal adalah perbedaan klon hasil perbanyakan tidak sama → umumnya
dan seharusnya KJT atau hasil kloning itu hasilnya sama (seragam)
o Bisa terjadi karena kondisi fisiologi yang berbeda → memicu aktivasi atau inaktivasi gen
yang berbeda
 o Dediferensiasi menyebabkan adanya variasi sel hasil regenerasi → bisa bersifat
sementara (epigenetik) maupun permanen

o Contoh (gambar): aslinya merah, gen pengkode warna merah bukan termutasi,
melainkan ekspresinya tertekan → merah muda → epigenetik. Pada KJT dengan induksi
hormon → sel membelah dengan cepat → dapat menyebabkan kerusakan pada
kromosom → non-disjuction atau kromosom patah → mutasi genetik
- Vitrifikasi → kondisi lingkungan in vitro berbeda dengan lingkungan luar → menyebabkan
tumbuhan menjadi hidup dan tumbuh secara upnormal
o Gangguan pertumbuhan pada tanaman
o Ciri-ciri:
 tanaman tampak transparan seperti gelas → berkaitan dengan sintesis klorofil yang
rendah
 batang dan daun mudah patah → gangguan sintesis lignin (kurang)
 batang dan daun membesar → overhidrasi → jaringan berkembang pesat
o Faktor penyebab:
 Sitokinin yang tinggi → memicu pembelahan sel yang cepat
 Konsentrasi agar rendah
 Mineral yang terlalu tinggi di media
o Solusi:
 Meningkatkan kadar karbohidrat di media
 Meningkatkan konsentrasi agar → supaya air yang tersedia di akar tidak terlalu
banyak
 Menurunkan kelembaban → melubangi tutup dan diberi kapas
- Browning → pada proses KJT ada proses perlukaan → memicu terjadinya browning →
terutama pada tanaman berkayu
o Terjadi karena respon alami oleh tanaman ketika mengalami perlukaan
  Ketika tanaman mengalami perlukaan → tanaman mengeluarkan senyawa fenol →
terjadi oksidasi fenol → menyebabkan kecokelatan
 Oksidasi senyawa fenol → toxic bagi sel → mengganggu pertumbuhan tanaman di
dalam kultur
o Mencegah:
 Menambahkan antioksidan (vitamin C)
 Dikultur pada sedikit cahaya/gelap
 Menyerap senyawa fenol yang dikeluarkan tanaman → menambahkan arang aktif
pada media