KULIAH 5.

TEKNIK KULTUR IN VITRO SEBAGAI

PENUNJANG PROGRAM BIOTEKNOLOGI
TANAMAN

Dr. Nilahayati, S.P., M.Si

 Aplikasi Kultur Jaringan
◼ Micropropagation (Kultur tunas, kultur pucuk, kultur
akar, kultur meristem)
◼ Industrial products from cell and calllus cultures.
◼ Haploid production (Anther Culture)
◼ Embryo culture
◼ In vitro hybridization – protoplast fusion
◼ Somaclonal variation
◼ Germplasm preservation
◼ Plant genetic engineering
1. KULTUR KALUS/KULTUR SEL
• Kalus adalah suatu kumpulan sel
amorphous yang terjadi dari sel-
sel jaringan yang membelah diri
secara terus menerus.

• Kalus dapat diperoleh dari bagian

tanaman berupa akar, batang
dan daun.

• Dalam kultur in vitro, kalus dapat

dihasilkan dari potongan organ
steril di dalam medium yang
mengandung ZPT auxin dan juga
sitokinin.
Induction
Division
 Syarat kultur Kalus :

◼ Media yang digunakan dapat menggunakan

media padat atau cair.
◼ Kultur kalus mensyaratkan eksplan yang ditanam
harus diberi pelukaan.
◼ Lingkungan diatur dengan ketersediaan oksigen
tinggi, ketersediaan hara dan cahaya yang cukup
 INDUKSI KALUS
• Kalus dapat diinduksi dengan pemberian ZPT
auksin dan sitokinin, namun kebutuhannya
berbeda-beda tergantung jaringan tanaman.
• Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian
tanaman, tetapi dari organ yang berbeda
kecepatan pembelahan selnya berbeda pula.
• Bagian tanaman yang mudah dediferensiasi dan
menghasilkan kalus : embrio muda, hipokotil,
kotiledon, dan batang muda
Lolium temulentum
Contoh Kultur Kalus
 Manfaat kultur kalus
• Kultur kalus dapat dilakukan pada media padat maupun cair.
Pada media cair embrio berkembang sebagai individu terpisah,
sehingga penanganan kultur relatif mudah, jadi keuntungannya
dapat untuk produksi massal.

• Potensi terbesar penggunaan kultur kalus adalah dimana sel-sel

kalus dapat dipisahkan dan diinduksi untuk berdiferensiasi
menjadi embrio somatik.

• 1 milimeter kalus berisi ribuan sel, masing-masing memiliki

kemampuan untuk membentuk embrio, sehingga kecepatan
multiplikasi sangat tinggi.
KULTUL SEL
◼ Kultur sel: adalah pembudidayaan/pemeliharaan sel,
tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam
lingkungan buatan (medium buatan) yang steril.

◼ Kultur sel terdiri atas populasi sel dengan laju

pertumbuhan yang cepat karena seluruh permukaan
sel dapat kontak langsung dengan medium nutrisi.

◼ Kultur sel mempunyai metabolisme lebih tinggi jika

dibandingkan dengan kultur kalus
 Eksplan Kultur Sel

◼ - Kalus
- Potongan daun

◼ Salah satu keunggulan kalus sebagai sumber

suspensi sel dibanding jaringan tanaman secara
langsung adalah lebih mudah dalam proses isolasi
dan lebih cepat tumbuh karena sel cepat
membelah.
 Cara memisahkan sel-sel
tanaman dari kalus
◼ Kalus adalah sel yang membelah secara terus
menerus secara tidak terorganisir sehingga
memberikan penampilan sebagai massa sel yang
bentuknya tidak teratur.
◼ Masa sel dalam kalus akan terpisah-pisah apabila
diletakkan dalam media cair sambil digojog
sehingga sel-sel tanaman dapat terpisah.
◼ Sel-sel tanaman yang telah terpisah diberi media
tanam, maka menjadi kultur sel atau kultur
suspensi sel.
 Cara memisahkan sel dari
potongan daun
◼ Penanaman dalam media cair & digojog : Potongan daun
yg mengambang pada media MS, sel mesofilnya
membelah dengan cepat, setelah digojog selama 4 hari
potongan daun terpisah sepurna dan membebaskan sel
dalam jumlah yang besar.
◼ Secara Mekanis : Mengupas jaringan epidermis (dapat
pula dng cara diblender), kemudian jaringan yang tanpa
epidermis disikat. Dimasukkan larutan osmotikum
(manitol, sorbitol, Mg Cl2, Ca Cl2), dng pH 3.
◼ Secara Enzimatis : Menggunakan enzim pektinase atau
poligalacturonase, yg dpt melarutkan senyawa pektat shg
lamella tengah melunak dan akhirnya sel sel terpisah.*
 KEGUNAAN KULTUR SEL
• Produksi metabolit sekunder, obat-obatan,
senyawa flavor/pewangi, pewarna.
• Mendapatkan biomasa sel untuk kultur
protoplas dan sel embryosomatik.
Contoh aplikasi kultur kalus/sel
untuk industry obat-obatan
 2. Kultur Haploid
Pemuliaan “Varietas baru”
- Konvensional
Tanaman homozigot
- Non konvensional (Inbred)

Konvensional
• Persilangan : self atau cross
F1 F2 F3 …….. F5
Contoh :
Padi generasi F5 ±97% homozigot
Diperlukan waktu yang lama
Non konvensional
Kultur Anther, Mikrospora, ovule

Tanaman haploid

Penggandaan kromosom

Tanaman homozigot & ‘breed true’

Tanaman haploid adalah tanaman yang mempunyai

jumlah kromosom sama dengan gametofitik dalam
sporofitik (Bajaj, 1983).
Tanaman haploid dapat dibentuk melalui :

1. Partenogenesis secara alami.

perkembangan tanaman haploid dari sel-sel
telur yang tidak dibuahi
2. Androgenesis
Perkembangan tanaman haploid dari polen
3. Secara artificial diinduksi melalui kultur ovari,
anther, microspora dan hibridisasi seksual
(persilangan kultivar terbudidaya dengan
genotipe liar)
 Kegunaan haploid dalam
pemuliaan tanaman:

1. Tanaman haploid dapat digunakan

untuk mendeteksi mutasi dan
rekombinan yang unik. Mutasi yang
resesif tidak muncul dalam keadaan
diploid.
2. Penggandaan jumlah kromosom akan diperoleh
tanaman homozigot. Tanaman homozigot sangat
penting untuk menghasilkan hibrida terkendali,
seperti tanaman Asparagus.
Tanaman Asparagus officinale merupakan
tanaman dioeceous yang menghasilkan bunga
betina dan bunga jantan pada tanaman yang
berlainan. Tanaman jantan lebih disukai
konsumen karena produksi rebungnya lebih
tinggi dan kualitasnya lebih baik. Usaha
penyilangan ditujukan untuk menghasilkan biji
yang menjadi tanaman jantan (XY). Hibrida XY
diperoleh dengan menyilangkan tanaman jantan
XY dengan betina XX dengan hasil XY: 50%.
Melalui kultur anther, diperoleh tanaman XY,
yang disebut super male. Penyilangan super male
YY dengan betina XX, akan menghasilkan
progeni yang 100%.
Anther/Microspore Culture
 Kultur Anther

◼ Keberhasilan kultur anther telah diwujudkan pada

tanaman seperti Datura innoxia, nicotiana tabacum,
karet, poplar, anggur, tanaman Gramineae serta pada
tanaman anggrek. Teknik kultur anther relatif sederhana
dan efisien yang paling penting adalah penentuan
tingkat perkembangan pollen (androgenesis) yang tepat
pada anther yang akan dijadikan eksplan.
◼ Secara praktis tingkat perkembangan pollen dapat
ditentukan berdasarkan pengambilan contoh beberapa
tingkat perkembangan kuncup bunga. Tingkat
perkembangan androgenesis pollen uninucleat paling
sesuai bila digunakan sebagai eksplan.
◼ Media dasar yang digunakan untuk tanaman dikotil, umumnya
adalah media MS, media White dan media Nitsch &Nitsch,
dengan berbagai modifikasi dengan penambahan sukrosa
sekitar 20-40 gram/liter. Zat Pengatur Tumbuh diberikan
dalam konsentrasi serendah mungkin untuk menghindari
terbentuknya kalus dari jaringan-jaringan diploid yang tidak
diinginkan. Untuk mendapatkan double haploid dipergunakan
larutan colchicine: 0,5% dengan waktu perendaman 24-28 jam.
◼ Tanaman monokotil terutama tanaman Gramineae seperti
padi, media MS juga dapat digunakan. Tetapi selain MS,
dikembangkan juga beberapa media lain misalnya media N6.
Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH4+ dan NO3_ yang
jauh perbedaannya. Ammonium yang diberikan dalam bentuk
(NH4)2SO4 hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO3 :
2830 mg/l. Khusus untuk padi, ada beberapa media lain yang
dikembangkan di Cina, sesuai dengan kultivar padinya,
misalnya media SK3, He5 dan LB.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan
kultur anther adalah:
1. Tingkat Perkembangan Pollen
Tergantung spesies. Tembakau, polen pada tahap
PGM (pollen grain mitosis) keberhasilan tinggi.
Serealea dan Brassica, optimum stage : awal periode
uninukleat.
Pada tanaman padi, frekuensi pembentukan kalus
yang tertinggi diperoleh pada kultur anther dengan
pollen yang nukleusnya terletak di pinggir sel (mid-
uninucleate microspore stage). Pembentukan
terbentuknya kalus pada berbagai stage adalah
sebagai berikut:
◼ 5.6% kultur membentuk kalus pada early-uninucleate stage,
yaitu sesudah tetrad terbentuk.
◼ 35,7% kultur membentuk kalus pada mid-uninucleate stage.
◼ 10.5% pada saat late-uninucleate stage.
◼ 6.7% pada saat mitosis pertama dari pollen.
◼ 0% pada saat polen mencapai bi-nucleat stage.
2. Perlakuan fisik sebelum inokulasi
Perlakuan temperatur rendah sebelum inokulasi,
meningkatkan keberhasilan kultur anther dalam:
Nicotiana tabacum, Datura innoxia, Hyosciamus
niger, Hordeum vulgare dan Oryza sativa. Pada
umumnya, temperatur antara 3-10°C. Bila
dipergunakan temperatur rendah 3-5°C, maka
waktu perlakuan dapat dipersingkat, sedangkan
pada temperatur rendah 10-15 ° C, waktu
perlakuan lebih panjang. Percobaan Wang dan
grupnya (Chen, 1986) dalam kultur padi hsien
menunjukkan:
◼Bila temperatur 3-5°C, dibutuhkan 10 hari.
◼Bila temperatur 6-8°C, dibutuhkan 15 hari.

◼Bila temperatur 9-10°C, dibutuhkan 20 hari.

3. Perlakuan kimia sebelum inokulasi

Anther yang dikultur dalam media cair yang ditambah

dengan 50-250 mg/l colchisine selama 4 hari,
meningkatkan frekuensi pembentukkan kalus dan
diferensiasi. Colchicine dapat meningkatkan tanaman
double haploid hingga 79%, sedangkan anther tanpa
perlakuan pendahuluan, hanya menghasilkan 53,8%
tanaman. Jika konsentrasi colchicine ditingkatkan
hingga 500 mg/l akan mengakibatkan frekuesi tanaman
anakan yang abnormal seperti albino akan meningkat.
Selain senyawa tersebut senyawa ethrel juga sering
digunakan untuk praperlakuan pada media cair + 5 g/l
ethrel (Gunawan, 1988).
4. Media tumbuh

◼ Komposisi media dasar tidak begitu kritis, namun dalam kultur

anther, NH4+ yang tinggi (35mM) akan menghambat pembentukan
kalus.
◼ Sukrosa yang diberikan, berkisar 2-12%. Pada serealia digunakan 6-
9%, sedangkan pada tanaman diploid 2-4%.
◼ Zat Pengatur Tumbuh pada kultur anther Solanaceae tidak diperlukan
cukup media dasar N6. ZPT yang biasa digunakan untuk memacu
pertumbuhan embriogenesis pada kultur anther adalah senyawa TIBA
(Tri iodobenzoic acid). Disamping itu penambahan 2 mg/l 2,4D pada
media dasar digunakan untuk kultur anther padi, dan kombinasi ZPT:
4 mg/l NAA + 1 mg/l 2,4D dan 1-3 mg/l kinetin sering ditambahkan
pada media dasar untuk kultur anther.
◼ Penambahan bahan-bahan organik seperti: ekstrak pisang, air
kelapa, ensdosperm serealia, ekstrak ragi, alanin, folic acid dan Co-
enzym A, dapat memacu pertumbuhan pada kultur anther.
◼ Penambahan 2% arangaktif dapat memperbaiki androgenesis.
5. Genotipe tanaman donor
Tidak semua kultivar dari setiap tanaman
organ anthernya dapat menghasilkan tanaman
haploid, seperti kultivar dari Lycopersicon
esculentum dari 43 kultivar hanya 3 kultivar saja
yang anthernya dapat ditumbuhkan. Triticum
aestivum hanya 10 kultivar saja yang anthernya
dapat ditumbuhkan menjadi tanaman haploid
dari 21 kultivar yang ada.
6. Kondisi Tanaman Donor

◼ Umur fisiologi tananam donor ternyata dapat mempengaruhi

pertumbuhan tanaman anther. Bunga dari tanaman muda pada saat
permulaan pembungaan, ternyata lebih baik dari pada bunga yang
keluar kemudian.
◼ Kondisi nutrisi tanaman donor: tembakau yang diberikan perlakuan
larutan Hoagland selama 2 minggu, mempunyai bunga dengan
vigor yang lebih baik.
◼ Temperatur waktu menumbuhkan tanaman donor. Contohnya pada
tanaman Datura, tanaman donor yang ditumbuhkan pada suhu 24
derajat Celsius frekuensi terjadinya androgenesis sebesar 45% dan
bila tanaman donor ditumbuhkan pada temperatur 17 derajat
Celsius , frekuensi tumbuhnya turun menjadi 8%.
◼ Cahaya selama pertumbuhan tanaman donor. Triticum aestivum
yang ditumbuhkan di lapangan dengan cahaya yang penuh,
menghasilkan kultur anther yang lebih baik dari tanaman yang
ditumbuhkan di rumah kaca pada musim dingin dengan
penyinaran yang kurang.
3. Embryo rescue (Kultur embrio)

◼ Isolasi secara steril embrio matang ataupun

belum matang, dengan tujuan memperoleh
tanaman yang viabel
◼ 2 macam kultur embrio:
◼ Kultur embrio yg belum matang, utk mencegah
keguguran : embryo rescue
◼ Kultur embrio matang, utk merangsang
perkecambahan : embryo culture
 Aplikasi
1. Memecahkan dormansi
◼ Pd Musa balbisiana, tdk mungkin memperoleh
perkecambahan secara normal
2. Perkecambahan parasit obligat
◼ Tidak mungkin berkecambah dg cara normal
3. Memendekkan siklus pemuliaan
◼ Akibat dormansi benih
4. Menghasilkan tanaman haploid
◼ Pd Hordeum vulgare x H. bulbosum, fertilisasi terjadi,
tapi kromosom bulbosum tereliminasi dan embrio
gugur.
5. Mencegah aborsi embrio pd buah
◼ pd persilangan stone fruit, transportasi air dan
nutrisi terhenti terlalu cepat, sehingga embrio gugur
6. Mencegah aborsi pd persilangan interspesifik
◼ Persilangan ini sering menghasilkan biji dengan
endosperm yg tdk sempurna, atau embrio yg lemah,
kecil. Co: Kacang, Kapas, Tomat, Padi.

7. Pembiakan vegetatif
◼ Embrio dapat digunakan sebagai bahan awal
pembiakan vegetatif. Co: Poaceae, Conifer
 Faktor yg mempengaruhi
kesuksesan kultur embrio
◼ Genotipe
◼ Pd suatu sp, embrio mudah diisolasi dan tumbuh,
sementara tan lain, susah…
◼ Tahap (stage) embrio diisolasi
◼ The bigger the better
◼ Kondisi tumbuh tan. Inang
◼ Sebaiknya ditumbuhkan di rumah kaca/ kondisi
terkontrol. Embrio mesti cukup besar dan berkualitas
tinggi
◼ Kondisi media
◼ Hara makro dan mikro
◼ Ph 5.0 – 6.0

◼ Sukrosa sbg sumber energi. Embrio belum matang

perlu 8 – 12%, matang perlu 3%.
◼ Auksin dan sitokinin tidak diperlukan. GA untuk
memecahkan dormansi
◼ Vitamin (optional)

◼ Senyawa organik (opt), air kelapa, casein hydrolisate,

glutamin (penting)
◼ Lingkungan
◼ Oksigen (perlu oksigen tinggi)
◼ Cahaya : kadang embrio perlu ditumbuhkan dlm
gelap selama 14 hari, kemudian ditransfer ke cahaya
untuk merangsang sintesa klorofil
◼ Suhu : kadang perlu perlakuan dingin (vernalisasi,
4oC) untuk memecah dormansi
 Wide hybridisation & embryo
rescue
1.Introgresi gen penting dari spesies liar yg masih
kerabat dekat dg spesies yg akan disilangkan
◼ Spesies dg struktur genom serupa
Tomat Lycopersicum esculentum 2n=2x=24
Lycopersicum chmiclewskii 2n=2x=24
(sumber gen dg kandungan gula tinggi)
◼ Spesies dg struktur genom berbeda
Kacang hijau Vigna radiata 2n=2x=22
Vigna glabrescens 2n=4x=24
(sumber gen tahan serangga)
2. Sintesa spesies alopoliploid
◼ Turnip (B. campestris, 2n=2x=16) X
Kol (B.oleracea, 2n=2x=18) = Oilseed rape (B.
napus, 2n=4x=34)

◼ Gandum tetraploid (Triticum turgidum, 2n=4x=28)

X Rye (Secale cereale, 2n=2x=14) = Triticale
(Triticosecale, 2n=6x=42).
3. Produksi triploid (buah tanpa biji)
◼ Jeruk triploid Citrus sinensis
Diploid citrus X tetraploid citrus = jeruk tanpa biji
◼ Pisang triploid
Musa acuminata (AA) X Musa balbisiana (BB) = pisang tanpa biji
(AAB)

4. Produksi tan. Haploid

◼ Hordeum vulgare (2n=2x=14) x H. bulbosum (2n=2x=14)
= H. vulgare x=7.
Karena kromosom tereliminasi
 Bulbosum Method

Hordeum
Hordeum vulgare
Barley X bulbosum
Wild relative
2n = 2X = 14 2n = 2X = 14
↓
Embryo Rescue

Haploid Barley
2n = X = 7
H. Bulbosum
chromosomes eliminated

✓ This was once more efficient than microspore culture in creating

haploid barley
✓ Now, with an improved culture media (sucrose replaced by maltose),
microspore culture is much more efficient (~2000 plants per 100
anthers)