Anda di halaman 1dari 462

Kultur Jaringan Tanaman

PENDAHULUAN

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Bab 1 Tipe Kultur Jaringan Tanaman
Bab 2 Desain dan Peralatan Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman
Bab 3 Preparasi dan Komposisi Media Nutrisi
Bab 4 Preparasi Eksplan
Bab 5 Propagasi In Vitro
Bab 6 Keragaman Genetik In Vitro
Bab 7 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan dan Morfogenesis
Bab 8 Teknik Aseptik dan Penggunaan Antibiotika
Bab 9 Faktor Lingkungan yang Mempengaruhi Pertumbuhan dan Perkembangan
Bab 10 Kultur Kalus dan Keragaman Somaklonal
Bab 11 Produksi Tanaman Bebas Virus
Bab 12 Produksi Tanaman Haploid Melalui Kultur Anter
Bab 13 Kultur Embrio
Bab 14 Teknik Sitologi untuk Kultur Jaringan
Bab 15 Metabolit Sekunder
Bab 16 Konservasi Plasmanutfah Secara In Vitro
Bab 17 Transfer Dari Media Nutrisi Ke Tanah (Aklimatisasi)
Terminologi Kultur Jaringan

 Kultur Jaringan = tissue culture


tissue = jaringan
culture = budidaya
 Budidaya tanaman di dalam wadah
gelas
Terminologi Kultur Jaringan

“… kultur aseptik protoplas, sel,


jaringan atau organ tanaman pada
kondisi yang memungkinkan sel untuk
bermultiplikasi atau beregenerasi
membentuk organ atau tanaman “
Terminologi Kultur Jaringan

suatu metode mengisolasi bagian dari


tanaman, seperti protoplasma sel,
sekelompok sel, jaringan, dan organ serta
menumbuhkannya dalam media yang sesuai
dan kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian
tersebut dapat memperbanyak diri dan
bergenerasi menjadi tanaman lengkap
Kultur jaringan tanaman (plant tissue
culture) atau seringkali disebut juga
dengan kultur in vitro adalah terminologi
yang digunakan untuk menggambarkan
semua prosedur budidaya tanaman
secara aseptik.
Karena pertumbuhannya memerlukan
tempat steril dengan wadah yang
biasanya tembus cahaya, maka disebut
juga kultur in vitro yang berarti kultur di
dalam gelas.
Karakteristik Kultur Jaringan

• Terbebas dari segala mikroorganisme


• Lingkungan tumbuh optimal
• Pola perkembangan normal tanaman dapat
dimodifikasi
• Manipulasi jaringan untuk perbaikan tanaman
Totipotensi
Pelaksanaan teknik kultur jaringan
berdasarkan teori sel yang
dikemukakan oleh Schleiden dan
Schwan yaitu bahwa sel mempunyai
kemampuan totipotensi.
Totipotensi
 Totipotensi adalah kemampuan
suatu sel untuk tumbuh menjadi
tanaman baru apabila diletakkan
pada lingkungan tumbuh yang
sesuai
 Setiap sel hidup memiliki cetak biru
yang lengkap dan memiliki potensi
untuk berkembang menjadi tanaman
utuh.
Totipotensi ….
 Sel berdiferensiasi untuk membentuk
jaringan dan organ
 Tidak seperti sel hewan, sel tanaman dapat
berdediferensiasi dan kemudian
berredediferensiasi untuk membentuk tipe
sel yang berbeda
Pengertian Kultur Jaringan

usaha untuk mengisolasi sel, sekelompok


sel, atau organ tanaman,
menumbuhkannya dalam keadaan
aseptik pada lingkungan yang sesuai
sehingga dapat menghasilkan tanaman
baru yang dapat ditanam pada media
non-aseptik.
Teknik kultur jaringan kemudian
berkembang menjadi sarana
penelitian di bidang fisiologi
tanaman dan aspek-aspek
biokimia tanaman.
Dewasa ini teknik kultur jaringan telah
mengalami banyak perkembangan dan
penyempurnaan, teknik kultur jaringan
telah digunakan dalam industri tanaman,
seperti tanaman tanpa biji, tanaman
dengan pertumbuhan yang lambat atau
tanaman hibrida.
Mengapa Kultur Jaringan?
Manfaat Kultur Jaringan
 dapat menghasilkan propagul tanaman dalam
jumlah banyak dalam waktu singkat
 dapat menghasilkan tanaman yang sama
dengan induknya.
 dapat menghasilkan tanaman yang bebas hama
dan penyakit (sistemik dan non sistemik) serta
virus.
 dapat memperbanyak tanaman langka dalam
waktu singkat
 dapat dilakukan sepanjang tahun
 dapat menciptakan tanaman baru
yang toleran terhadap kekeringan,
kadar garam tinggi, dan kondisi yang
kurang menguntungkan
 dapat memperoleh bibit unggul
dengan cara fusi protoplas
 dapat menghasilkan senyawa
metabolit sekunder yang berguna
dalam bidang farmasi
Aplikasi Kultur Jaringan
 Salah satu aspek yang menarik dari penerapan kultur jaringan
dan dewasa ini sangat pesat perkembangannya adalah
mikropropagasi/ perbanyakan mikro (micropropagation).
 Teknik mikropropagasi telah banyak digunakan untuk
memperbanyak secara cepat berbagai jenis tanaman dalam
skala industri.
 Teknik kultur jaringan terbukti ampuh membantu para pemulia
tanaman untuk menghasilkan tanaman dengan karakter yang
sudah diperbaiki.
 Pada mulanya tujuan dan manfaat utama teknik kultur jaringan
tanaman adalah untuk perbanyakan tanaman.
 Pada perkembangannya, teknik kultur jaringan juga
dimanfaatkan untuk tujuan lain, seperti: polinasi in vitro,
penyelamatan embrio (transplantasi embrio), produksi
metabolit sekunder, konservasi plasma nutfah, fusi protoplas,
keragaman somaklonal, produksi tanaman haploid, dan
transformasi tanaman.
Teknologi Perbanyakan Tanaman

 Mikropropagasi
 Kalus, organogenesis
 Embriogenesis
 Kultur meristem Direct

 Grafting In vitro
 Kultur Anter/microspore
Teknologi Pemuliaan Tanaman

 Keragaman somaklonal
 Seleksi In vitro
 Mutagenesis
 Kultur haploid (1N)
 Fusi protopla
 Hibrida somatik
Teknologi Gen
 DNA rerkombinan = GMO
Pemuliaan Klasik
Mutagenesis
Rekayasa Genetika

…. Bergantung pada regenerasi tanaman


 Marker assisted breeding
 Diagnostik molekuler
 Penelitian fisiologi
Aplikasi In Vitro Lainnya...

 Biositesis
 Bioreaktor
Prospek Kultur Jaringan Tanaman
 Kultur jaringan dapat dikatagorikan merupakan teknik atau metode
baru dalam perbanyakan tanaman.
 Tanaman pertama yang pertama kali diperbanyak secara besar-
besaran melalui teknik ini adalah anggrek.
 Menyusul tanaman hias dan tanaman hortikultura lainnya.
Sedangkan yang terakhir adalah perbanyakan tanaman kehutanan.
 Kecepatan perbanyakan melalui kultur jaringan sangatlah
mengagumkan.
 Morel pada tahun 1964 memproyeksikan sebanyak empat juta
tanaman anggrek cymbidium per tahun dari satu pucuk yang sehat.
 Murashige memproyeksikan 700.000 tanaman asparagus per
tahun.
 Kultur jaringan pisang di Taiwan memproyeksikan kira-kira sejuta
tanaman per tahun.
 Angka-angka tersebut merupakan jumlah yang tidak mungkin dicapai
dengan metode konvensional.
Prospek Kultur Jaringan Tanaman

 Pennel (1987) memberikan formulasi untuk menghitung potensi


jumlah planlet yang dapat dihasilkan secara teoritis dalam satu
periode (satu tahun) dengan rumus sebagai berikut:

Y = A n x B x F 1 x F2 x F3

Y = jumlah plantlet yang dapat dihasilkan


A = jumlah tunas yang dihasilkan pada setiap subkultur (faktor multiplikasi)
n = jumlah subkultur pada periode tertentu (per tahun)
B = jumlah eksplan awal yang tumbuh
F1 = persentase keberhasilan kultur pada tahap multiplikasi
F2 = persentase keberhasilan kultur pada tahap perakaran.
F3 = persentase keberhasilan aklimatisasi
Tipe Kultur Jaringan Tanaman
No Tipe Kultur Penggunaan
A Kultur Embrio - Memperpendek siklus pemuliaan
- Menghindari inkompatibilitas
B Kultur Meristem - Mengeliminasi patogen
- Mengkloning massal tanaman
- Mengoleksi plasmanutfah
- Kriopreservasi (penyimpanan jangka
panjang)
C Kultur Kalus - Mengkloning tanaman
- Menghasilkan varian-varian tanaman
- Mengeliminasi patogen
- Sumber protoplas
- Memproduksi metabolit sekunder

D Kultur Anter - Menghasilkan homozigot


- Menginduksi mutasi
E Kultur Protoplas - Hibridisasi somatik
- Transformasi
Manipulasi yang Dapat Dilakukan pada Kultur
Jaringan Tanaman
TANAMAN

KRIOPRESERVASI EKSPLAN MULTIPLIKASI

TRIPLOID KALUS EMBRIOGENESIS

HAPLOID METABOLIT
SEKUNDER
SUSPENSI SEL

TRANSFORMASI PROTOPLAS

FUSI PROTOPLAS

KULTIVAR BARU
Jenis-jenis /
Tipe Kultur Jaringan
KULTUR EMBRIO
a. merupakan isolasi dan pertumbuhan aseptik
embrio zigotik matur dan immatur yang bertujuan
mendapatkan tanaman yang viabel.
b. Mengatasi aborsi embrio karena hambatan
inkompatibilitas
c. Mengatasi dormansi biji dan self-sterility dari biji
(mendapatkan tanaman yang viabel setelah
persilangan sendiri)
d. Penyelamatan embrio pada hibridisasi jarak jauh
(interspecific or intergeneric) dimana
perkembangan endospermanya kurang baik
e. Mempersingkat siklus pemuliaan/ Mempercepat
siklus pemuliaan melalui pengkulturan in vitro bagi
embrio yang lambat berkembang
KULTUR MERISTEM
a. Merupakan isolasi dan
pertumbuhan aseptik
ujung tunas (shoot-tips)
atau merisem secara in
vitro
b. Produksi plasma nutfah
bebas virus
c. Produksi massal genotipe
yg diinginkan
d. Memfasilitasi pertukaran
Penggunaan Kultur Meristem untuk
plasmanutfah antar lokasi
Propagasi Klon Secara Massal
e. Kriopreservasi (cold (Pierik, 1987)
storage) atau konservasi
in vitro plasmanutfah
KULTUR KALUS
a. Merupakan induksi dan pertumbuhan aseptik kalus
(sekelompok sel yang tidak terorganisir) secara in vitro
b. Menghasilkan varian genetik baru yang berguna (variasi
somaklonal)
c. Penyaringan sel-sel secara in vitro bagi tipe-tipe yang
memiliki karakter berguna
d. Memproduksi produk kimia yang bermanfaat (metabolit
sekunder)
e. Regenerasi melalui embriogenesis somatik atau
organogenesis
Pembentukan PLB dan
regenerasi planlet pada
tiap tahap perkembangan
kalus Oncidium ‘Gower
Ramsey’.
(A) Kalus berbentuk granular
dan proembriogenesis. (B)
Regenerasi kalus terlihat
lebih kompak dan hijau (C)
Formasi PLB dan
pemunculan tunas setelah 2
bulan dikulturkan. (D) Tunas
setelah 4 bulan. (E)
Regenerasi setalah 6 bulan.
(F) Propagasi massal
tanaman dari kalus setelah 6
bulan pembentukan PLB
(bar = 1 mm pada A–E; 1 cm
pada F).

Fang-Yi Jheng, Yi-Yin Do, Yuh-Waan Liauh, Jen-Ping Chung, Pung-Ling Huang (2006)
KULTUR ANTER
a. Merupakan isolasi steril dan perkembangan kultur kalus
haploid dari polen secara in vitro.
b. Kultur anther adalah kultur yang diinisiasi dari seluruh
kepala sari. Produksi tanaman haploid
c. Produksi galu-galur diploid homozigot melalui
penggandaan kromosom, dg demikian mereduksi waktu
yg dibutuhkan untuk memproduksi galur inbred
d. Mengungkap mutasi atau fenotipe resesif
e. Seleksi bentuk-bentuk mutan
Teknik untuk mendapatkan tanaman homozigot adalah melalui
penanaman anther tanaman F 1 setelah dilakukan persilangan
dari tetua tanaman yang kita kehendaki. Kalus haploid yasng
terbentuk kemudian diseleksi. Tanaman homozigot diperoleh
melalui aplikasi kolkisin (penggandaan kromosom).
Tahapan kultur antter
gandum durum.
(A) Anter dari lapang pada
media induksi 3 minggu
setelah kutur menunjuk-
kan bakal embrio dan
kalus.
(B) Anter lain yang berasal
dari greenhouse.
(C) Berbagai anter dari
lapang.
(D) Kalus dari anter green
house.
(E) Kalus dari anter asal
lapang.
(F) Massa tunas dan akar
dari anter asal
greenhouse.
(G) Planlet albino.
(H) Planlet sehat pada media
regenerasi MS 8 minggu
setelah kultur awal.
(I) Tanaman kimera
KULTUR OVARI
a. Produksi tanaman haploid
b. Eksplan yg biasa digunakan untuk inisiasi kultur
embriogenik somatik
c. Mengatasi aborsi embrio hibrida pada tahap
perkembangan awal karena hambatan inkompatibilitas
d. Fertilisasi in vitro untuk memproduksi hibrida yang
berkerabat jauh mencegah inkompatibilitas stigma dan
stilus yg menghambat perkecambahan polen dan
pertumbuhan tabung polen
Regenerasi Tanaman A.
chinense melalui kultur
ovari:
(a) bunga; (b) potongan ovari; (c)
organogenesis setelah 4 minggu;
(d) inisiasi tunas setelah 5
minggu; (e) pembentukan tunas
setelah 8 minggu; (f) (g)
pebentukan bulblet pada bebera
tunas; (h) pembungaan in vitro .
KULTUR PROTOPLASMA

a. adalah isolasi steril protoplas (sel-sel muda yang telah


dinding selnya dilepas dengan menggunakan enzim)
yang bertujuan untuk memodifikasi genetik sel
b. Biasanya kultur protoplasma ditujukan untuk hibridisasi
somatik (fusi protoplasma intraspesifik atau
interspesifik)
c. Injeksi DNA langsung (mikroinjeksi dan microprojectile
bombardment)
Regenerasi Tanaman
Hasil Fusi
a, b – mikrokalus pada media
SW11 , c – kalus pada media
Shepard D, d – kalus pada
media padat Shepard D, e –
regenerasi kalus
KULTUR SUSPENSI SEL

 adalah kultur sel bebas pada media cair


dengan shaker (pengocokan). Pada
umumnya kultur suspensi diinisiasi dari
kalus
EmbrIogenesis dan regenerasi planlet dari kultur sus pensi tanaman jahe:
(A) Kultur suspensi embriogenik somatik. (B) Embrio somatik matang. (C)
Rediferensiasi embrio somatik. (D) Regenerasi planlet
Kultur Organ - Organ culture
 Setiap organ dapat digunakan sebagai
eksplan untuk menginisiasi kultur
 Merupakan kultur yang diinisiasi dari
organ tanaman seperti : ujung pucuk,
tunas aksilar, ujung akar, hipokotil dan
embrio.
Kultur Biji - Seed culture
 Meningkatkan efisiensi perkecambahan
biji yang sulit berkecambah secara in vivo
 Mempercepat perkecambahan melalui
aplikasi zat pengatur tumbuh (hormon)
 Produksi bibit yg bebas H & P untuk
eksplan atau kultur meristem
Perkecambahan biji dan pertumbuhan tanaman setelah kriopreservasi. (A) Protokorm memanjang (P)
Bar: 1.0 mm. (B) Detail protokorm yang memanjang (P) terlihat primodia daun (L) dan bakal akar (R).
Bar: 0.4 mm. (C) Perkembangan bibit. (D) Pertumuhan tanaman di greenhouse.
Polinasi In vitro - In vitro pollination

 Produksi hibrida yang sulit diproduksi


melalui penyelamatan embrio
Metode studi zigot. Skema yang menunjukkan fertilisasi dan embriogenesis
pada bunga
Embriogenesis Somatik - Somatic
embryogenesis

 Lintasan utama regenerasi


 Multiplikasi massal
 Produksi biji sintetik
 Sumber material bagi protoplas
embriogenik
 Dapat dipakai secara mekanisasi dan atau
untuk bioreaktor
Embriogenesis somatik dan regenerasi planlet
Organogenesis
 Salah satu lintasan regenerasi
 Mutiplikasi/perbanyakan secara massal
 Konservasi plasmanutfah secara in vitro
Meningkatkan tunas aksilar

 Mikropropagasi
Penggunaan Kultur Kalus untuk Seleksi Tanaman Toleran
terhadap Herbisida

Tanaman Sehat yang Berbunga

Kultur Anter

IInduksi dan Pertumbuhan Kalus Haploid

Penebaran Sel pada Medium yang Mengandung


Herbisida

Kalus Toleran Terseleksi

Regenerasi Tanaman dari Sel-Sel Toleran

Tanaman Haploid

Diploidisasi dengan Perlakuan Kolkisin

Analisis Genetik melalui Persilangan

Bahan Pemuliaan untuk Varietas Tahan Herbisida


Mutagenesis in vitro

 Induksi poliploidi
 Introduksi keragaman genetik
Pembungaan in vitro

 Untuk tujuan tertentu, seperti tanaman


hias
Sambung mikro -
Micrografting
 Mengatasi inkompatibilitas penyambungan
 Produksi massal bibit berkualitas
 Memungkinkan tanaman yang sulit
berakar untuk bertunas
 Mengembangkan tanaman bebas virus
Mikropropagasi kultivar cherimoya melalui teknik micrografting
Transformasi Genetik -
Genetic transformation
 Many different explants can be used,
depending on the plant species and its
favored method of regeneration as well as
the method of transformation
 Introduction of foreign DNA to generate
novel (and typically desirable) genetic
combinations
 Used to study the function of genes
Tunas Aksilar Tunas Adventif
Pengumbian in vitro Pembungaan in vitro
Perkembangan Ovari Rizogenesis
Grafting in vitro Bulbil development
Embriogenesis Somatik
pada Kapas
Aplikasi in vitro lainnya...

 Biosintesis
 Bioreaktor
History of plant tissue culture

• TOTİPOTENSİ Cell theory


• SCHLEIDEN 1838 in plants,
• SCHWANN 1839 in plants and animals
• Among the lower plants any cell can be
separated from the plant and continue
to grow. Thus, entire plants may consist
of cells whose capacity for independent
life can be clearly demonstrated.
Haberland (1902 )
Pertama kali melakukan kultur aseptik pada
larutan nutrisi
White (1934)
Pertama kali kultur akar
Penanaman in vitro dilakukan secara simultan oleh WHITE
yang bekerja dengan tembakau serta GAUTHERET dan
NOBECOURT bekerja dengan wortel pada 1939.
Gautheret
Pertama kali kultur kalus
Skoog (1954)
Murashige

• Murashige ve Skoog medium


Maheswari (1960)
Pertama kultur anter
Nitsch (1974)
Kultur microspore
Cocking (1960)
Kultur protoplas


Morel (1960) : mikropropagasi
Melchers (1978) : fusi protoplas “Pomato”
Nickell
Produksi metabolit sekunder
* *

laminar flows
Beberapa Istilah dalam Kultur
Jaringan

 Eksplan adalah potongan jaringan atau


organ yang diisolasi dari tanaman yang
digunakan untuk inisiasi suatu kultur in
vitro.
 Plantlet adalah tanaman lengkap hasil
regenerasi dari kultur jaringan
 Sub kultur adalah pemindahan sel,
jaringan atau organ dari media lama ke
media baru yang sama atau berbeda.
 Akuades adalah air hasil destilasi yang
hanya mengandung H2O
 Aklimatisasi adalah proses penyesuaian
peralihan lingkungan heterotrof menjadi
autotrof pada plantlet yang diperoleh
melalui teknik kultur jaringan.
 Aseptik adalah bebas dari semua
mikroorganisme, virus, bakteri, jamur,
mikoplasma dan sebagainya.
 Browning adalah pencoklatan eksplan
yang juga dikeluarkan ke media karena
persenyawaan polifenol yang teroksidasi
pada permukaan luka.
 Regenerasi adalah proses pembentukan
organ-organ dari suatu eksplan yang
digunakan dalam kultur in vitro.
 Induksi adalah inisiasi dari suatu proses
khusus yang menghasilkan
perkembangan dari suatu organ.
 In vitro adalah dalam media gelas.
 Kultur in vitro adalah usaha
menumbuhkan bagian-bagian tanaman
dalam wadah yang tembus cahaya pada
media buatan dan dengan lingkungan fisik
yang terkendali serta aseptik.
Kultur Jaringan Tanaman

DESAIN &
FASILITAS
LABORATORIUM

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Laboratorium Kultur
Jaringan
 Agar pelaksanaan kultur jaringan dapat
berjalan dengan baik, maka diperlukan
laboratorium dengan segala fasilitasnya.

 Di dalam laboratorium harus tersedia alat-


alat kerja, sarana pendukung tercip-tanya
kondisi aseptik terkendali, serta fasilitas
dasar, seperti air, listrik, dan bahan bakar.
Laboratorium Kultur
Jaringan
 Laboratorium kultur jaringan sebaiknya
mempunyai pembagian ruang yang diatur
sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan
terpisah satu dengan lainnya, tetapi juga
saling berhubungan.
 Penataan ruangan dalam laboratorium
dikaitkan dengan langkah-langkah dalam
prosedur kultur jaringan dan alat-alat yang
dibutuhkan.
Laboratorium Kultur
Jaringan
 Kegiatan kultur jaringan di dalam
laboratorium dibagi dalam tiga kelompok,
yaitu:

1. Persiapan; baik persiapan media,


maupun bahan tanaman.
2. Isolasi dan penanaman.
3. Inkubasi dan penyimpanan kultur.
Laboratorium Kultur
Jaringan
 Penempatan ruang kerja di Laboratorium
Kultur Jaringan (ruang persiapan, ruang
isolasi dan penanaman, serta ruang
inkubasi) perlu memperhatikan alur kerja.
Untuk menjaga agar kontaminasi dapat
ditekan sekecil mungkin

 Karena setiap kegiatan harus terpisah satu


sama lain, dengan peralatan tersendiri,
maka akan dibutuhkan beberapa ruangan
yang terpisah.
Desain Laboratorium Kultur Jaringan
Ruang Persiapan
 Ruang persiapan dipergunakan untuk
mempersiapkan bahan tanaman dan media
tanam, untuk mencuci alat laboratorium,
serta tempat menyimpan peralatan gelas.

 Dalam ruang ini diperlukan meja untuk


meletakkan alat (seperti timbangan) dan
untuk melakukan berbagai persiapan
lainnya serta lemari untuk penyimpanan
bahan kimia.
Peralatan yang diperlukan
1. Meja kerja
2. pH-meter
3. Kulkas
4. Freezer
5. Hot-plate-magnetic stirer
6. Jerigen berkran tempat aquades
7. Timbangan kasar (akurat hingga 0.01 g)
8. Oven mikrowave
9. De-ionizer
10. Rak pengering
11. Peralat/bahan penutup wadah kultur
Ruang peralatan gelas

1. Gelas piala
2. Labu ukur
3. Erlenmeyer
4. Gelas ukur
5. Petridish
6. Tabung reaksi
7. Botol kultur
Ruang cuci
1. Autoklaf
2. Bak cuci
3. Rak-rak
4. Ala cuci otomatis
5. Bahan-bahan pembersih (Bayclin dll)
6. Deterjen
7. Alat-alat pembersih (Gundar, spon
dll)
8. Kompor Gas
Ruang Isolasi dan Penanama

1. LAFC
2. AC
3. Mikroskop
4. Bunsen
5. Kertas saring
6. Petri dish
7. Gunting, pisau, pinset
8. Peralatan sterilisasi kering
 Sentrifus kecepatan rendah
 Sodium hipoklorit
 Tissue
 Alkohol
 Spiritus
Ruang penyimpan bahan-bahan
kimia

1. Lemari
2. Kulkas
3. Timbangan analitik 0,01 g
Ruang lain-lain

1. Ruang khusus untuk analisis biokimia


dan histologi
2. Bengkel perbaikan, pemeliharaan dan
studio foto
Laminar Air-Flow Cabinet
 Laminar air-flow cabinet merupakan alat
memfalisitasi kegiatan sterilisasi bahan
(eksplan dan penanaman ekeplan).
 Bentuknya LAFC adalah kotak empat
persegi panjang yang dilengkapi dengan
alat penyaring udara (filter), blower, lampu
UV dan lampu neon
 Udara dari luar LAFC dihisap masuk ke
dalam.
 Sebelum udara yang dihisap keluar kembali
di dalam kotak laminar udara mengalami
minimal 2 kali penyaringan.
Laminar Air-Flow Cabinet
Laminar Air-Flow Cabinet
 Sebagai alat penyaringan digunakan
filter HEPA.
 Saringan tersebut mampu menyaring
mikroorganisme kontaminan yang
terbawa oleh udara.
 Blower berfungsi mencegah udara kotor
masuk dari bagian depan laminar,
sehingga bagian dalam akan tetap steril.
 Lampu UV berfungsi untuk sterilisasi
ruang dalam laminar.
 Bila tidak digunakan sebaiknya LAFC
ditutup plastik agar tidak berdebu.
 Untuk perawat LAFC sebaiknya diservis 1
x setahun.
 Filter yang digunakan harus dibersih
secara reguler dan diganti.
Sterilisasi Media Nutrisi

 Sterisasi media umumnya dilakukan


dengan autoklaf.
 Beberapa bahan kimia heat labile
disterilisasi dengan penyeringan
(filtrasi).
 Sterilisasi juga dapat dilakukan
dengan iradiasi.
 Bahan atau alat yang telah disterilisasi,
seperti media nutrisi, peralatan gelas dan
alat deseksi diletakkan pada kotak yang
sebelumnya telah disterilisasi dengan
alkohol 96 %.
 Otoklaf merupakan alat sterilisasi yang
menggunakan uap air pada tekanan dan
suhu tinggi.
 Hampir bisa dipastikan seluruh
mikroorganisme akan mati setelah melalui
sterilisasi otoklaf.
Jenis otoklaf

1. Otoklaf yang sumber panasnya berasal


dari listrik. Harganya jauh lebih mahal
karena dilengkapi dengan pengatur
waktu untuk sterilisasi.
2. Otoklaf yang sumber panasnya api.
Harganya lebih murah dari otoklaf
listrik.
Jenis otoklaf
 Sterilisasi bergantung pada waktu,
suhu dan volume objek yang akan
disterilisasi.
 Keuntungan pemakaian otoklaf:
1. Cepat
2. Mudah
3. Mampu mematikan virus
 Kerugian penggunaan otoklaf :
1. pH media akan berubah
2. Komponen kimia menjadi berubah
3. Atau hilang aktivitas kimianya
Senyawa kimia yang mudah rusak karena
otoklaf :
 Sukrosa
 Kolkisin
 Zeatin
 Giberelin
 Vitamin B1
 Ekstrak tanaman
 Enzim
 Media yang mengandung bahan ini sebaiknya
disterilisasi dengan filter agar tidak rusak.
Sterilisasi Filter
 Proses sterilisasi filter dilakukan dengan melewatkan
melalui membran filter yang akan menyaring seluruh
partikel dan mikroorganisme yang lebih besar dari
diameter pori-pori filter.
 Keuntungan sterilisasi filter adalah senyawa-senyawa
yang heat labile (thermolabile) tidak akan mengalami
kerusakan.
 Kerugian sterilisasi filter adalah senyawa-senyawa kimia
tertentu teradsorpsi pada filter, partikel virus akan lolos
pori-pori filter, prosedurnya amat mahal dan tidak
semudah otoklaf.
 Apabila menggunakan sterilisasi filter disarankan untuk
menggunakan filter cellolose acetate atau cellulose
nitrate yang berdiameter 0.22 µm.
 Filter diletakkan pada ujung alat penyuntik dan larutan
dari alat penyuntik dikeluarkan melalui filter.
Sterilisasi Filter
Sterilisasi bahan tanaman
 Bahan tanaman (eksplan) yang bebas
kontaminasi merupakan langkah awal dalam
keberhasilan kultur jaringan .
 Tingkat kontaminasi permukaan bahan
tanaman tergantung pada : (a) jenis
tanaman; (b) bagian yang dipergunakan; (c)
morfologi permukaan; (d) lingkungan
tumbuh; (e) musim; (f) umur tanaman; dan
(g) kondisi tanaman
Bahan sterilan dan lama
perendaman
Bahan Sterilan Kosentrasi Lama Perendaman
Kalsium hipoklorid 1 – 10 % 5 – 30 menit
Natrium hipoklorif 1–2% 7 – 15 menit
Hidrogen Peroksida 3 – 10 % 5 – 15 menit
Gas klorin - 1 – 4 jam
Perak Nitrat 1% 5 – 30 menit
Merkuri klorid 0.1 – 0.2 % 10 – 20 menit
Betadine 10% 5 – 10 menit
Benlate 2 g/L 20 – 30 menit
Antibiotik 50 mg ½ - 1 jam
Alkohol 70% ½ - 1 jam
Kultur Jaringan Tanaman

PREPARASI &
KOMPOSISI MEDIA

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Pendahuluan
 Tingkat keberhasilan kultur sel atau kultur jaringan
tanaman sangat ditentukan oleh media yang
digunakan
 Media nutrisi yang digunakan dalam kultur jaringan
biasanya terdiri atas garam-garam inorganik,
sumber karbon (karbohidrat), viamin, zat pengatur
tumbuh
 Komponen-komponen lain seringkali ditambahkan
untuk tujuan tertentu seperti senyawa-senyawa
nitrogen organik, senyawa-senyawa asam
trikarbosilat dan ekstrak tanaman.
 Nutrisi penting pertumbuhan dan perkembangan
tanaman. Tanaman tidak akan mampu hidup tanpa
ada air dan nutrisi mineral, in vivo, maupun in vitro
tidak sepenuhnya autotrof.
 Faktor fisik juga penting untuk
pertumbuhan dan perkembangan
tanaman in vitro dan in vivo.
 Faktor-faktor fisik tersebut memiliki
efek terhadap proses-proses fisiologis,
seperti pengambilan air dan mineral,
evapotranspirasi, fotosintesis,
respirasi dan pertumbuhan
 Faktor penting lainnya yang menentukan
pertumbuhan in vitro adalah kelompok senyawa
organik yang termasuk zat pengatur tumbuh.
 Senyawa kimia tersebut hanya dibutuhkan dalam
konsentrasi rendah.
 Zat pengatur tumbuh seperti, sitokinin dan auksin
mengatur perkembangan organ jaringan yang
ditumbuhkan secara in vitro.
 Zat pengatur tumbuh juga sangat penting untuk
perkembangan struktur perkembangan embrio
dalam kultur suspensi dan kultur kalus.
 Pengetahuan mengenai kebutuhan media dan
kebutuhan metabolisme dalam kultur jaringan
sangatlah berharga, bukan hanya untuk
menentukan tipe media yang akan digunakan, tetapi
juga bagaimana mempersiapkan media tersebut.
Komposisi Media

 Dewasa ini sangat banyak variasi media


yang disajikan dalam berbagai literatur.
 Pemilihan media ditentukan oleh tujuan
teknologi kultur jaringan yang akan
dilakukan dan species atau tipe tanaman
yang hendak dikulturkan.
Senyawa Kimia Konsentrasi (mg/liter)
MS B5 N6 NN
Nutrisi Makro
KNO3 1900 2500 2830 950
NH4NO3 1650 720
MgSO4.7H2O 370 250 185 185
KH2PO4 170 400 68
NaH2PO4.H2O 150 166
CaCl22H2O 440 150 166
(NH4)2.SO4 134 463
Nutrisi Mikro
H3BO3 6.2 3 1.6 10
MnSo4.4H2O 15.6 10 3.3 19
ZnSo4.7 H2O 8.6 2 1.5 10
NaMoO4.2H2O 0.25 0.25 0.25 0.25
CuSO4.5H2O 0.025 0.025 0.025 0.025
CoCl 2.6H2O 0.025 0.025 0.025
Kl 0.83 0.75 0.8
FeSo2.7H2O 27.8 27.8
Disodium EDTA 37.3 37.3
EDTA sodium ferric acid 40 100
Glycine 40 5
3 3 3 3
Sukrosa 30 x 10 20 x 10 50 x 10 20 x 10
Vitamin
Thiamine hydrocloride 0.5 10 1 10
Pyridoxine hydrocloride 0.5 1 0.5 1
Nicitinic acid 0.5 1 0.5 1
Myo-inositol 0.5 100 100
PH 100 5.5 5.8 5.5
 Komposisi garam-garam MS (Murashige-
Skoong, 1962) atau LS (Linsmaier dan
Skoog, 1965) sering kali digunakan untuk
tujuan regenerasi tanaman.
 Media B5 (Gamborg, et al., 1968) serta
Nitsch dan Nitsch, banyak digunakan untuk
spesies tanaman yang berbeda dan untuk
tujuan kultur yang berbeda.
 Media nutrisi untuk kultur jaringan terdiri
atas elemen-elemen inorganik yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman.
 Dalam media juga terkandung karbon atau
sumber energi, vitamin, zat pengatur
tumbuh, dan suplemen organik bila
diperlukan
Garam-Garam Inorganik
 Garam-garam mineral yang digunakan sebagai
komponen kultur jaringan tanaman jumlahnya relatif
sedikit. Umumnya media mengandung paling sedikit
30mM nitrogen dan kalium inorganik.
 Amonium dapat digunakan dalam jumlah 2-20mM,
akan tetapi pengaruh amonium dapat sangat
bervariasi dari menghambat hingga sangat penting
bergantung pada jaringan yang digunakan dan tujuan
 Penggunaan garam-garam omonium dari malat atau
sitrat memungkinkan penggunaan amonium sebagai
sumber nitrogen tunggal. Kalsium, sulfat, fosfor dan
magnesium dengan konsentrasi 1 hingga 3 mM sudah
mencukupi.
Sumber Karbon
 Sukrosa dan glukosa merupakan sumber
gula standar.
 Fruktosa kadang-kadang juga digunakan.
 Gula-gula yang lain digunakan hanya untuk
tujuan khusus.
 Banyak media yang juga mengandung m-
inositol, yang berperan penting sebagai
komponen metabolisme dinding sel.
Vitamin
 Tanaman mampu mensintesis seluruh
vitamin.
 Sel-sel dalam kultur membutuhkan thiamine
 Thiamine mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan sel atau jaringan yang
dikulturkan
Zat Pengatur Tumbuh
 Empat kelas senyawa mempunyai aktivitas
pengaturan pertumbuhan adalah auksin, sitikinin,
geiberelin, dan asam abisik.
 Senyawa-senyawa indole dan NAA digunakan untuk
menginduksi pembentukan akar.
 Pengunaan auksin sering kali dikombinasikan dengan
pengunaan sitokinin.
 Sitokinin yang digunakan merupakan turunan dari
adenine (amininopurine).
 Sitokinin berperan penting dalam diferensiasi dan
regenerasi tanaman
 Giberelin digunakan dalam regenerasi tanaman dari
meristem dan setelah terbentuknya primordia tunas.
 Asam absisik digunakan dalam embriogenesis
somatik
Senyawa Singkatan BM Preparasi
Sitokinin
Benzyladenine BA 225.2 Larutkan dalam 2-5 ml 0.5 N HCL,

Isopentenyl adenine 2-iP 203.2 panaskan, sesuaikan volumenya,


Kinetin k 215 sesuaikan pH(5).
Zeatin Z 219
Auksin
2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 221 Larutkan dalam 2-5 ml etanol
secara

2,4- Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 255.5 bertahap tambahkan air, panaskan,


2,4,5-Trychlorophenoxyacetic acid NAA 186.2 sesuaikan volume , sesuaikan
pH(5).
Naphthaleneacetic acid ABA 203.2
Indoleacetic acid IAA 175.2
ZPT lainnya
Gibberelin acid GA 364.4 Larutkan dalam 2-5 ml 0.2 M KoH,
Picloram P 241.2 sesuaikan volume, sesuaikan
pH(5).s
Absisic acid ABA 264
Asam Amino

 Penambahan asam amino dapat


meningkakan pertumbuhan dan
memfasilitasi deferensiasi ke arah
regenerasi tanaman
 Sel-sel tanaman dapat tumbuh hanya
dengan menambahkan L-glutamine sebagai
satu-satunya nitrogen.
 Media khusus yang menggantikan seluruh
nitrogen dengan asam amino cukup efektif
untuk tujuan tertentu.
Senyawa Organik Komplek
 Berbagai suplemen organik yang dapat
ditambahkan dalam media.
 Senyawa organik yang banyak digunakan
adalah hydroyzates dan air kelapa(coconut
milk).
 Penggunaan protein hydroyzates seperti K-
amine Tipe A lebih disukai karena
mengandung asam amino.
 Hidrolisis asam dapat merusak beberapa
asam amino.
Bahan Pemadat
 Agar merupakan polisakarida dengan bobot molekul
yang tinggi.
 Agar digunakan sebagai bahan pemadat media (jeli).
 Agar merupakan deviratif rumput laut.
 Agar Difco Bacto merupakan agar yang seringkali
digunakan untuk penelitian kultur jaringan yang
memerlukan tingkat ketelitian yang tinggi, misalnya
untuk kultur kalus atau kultur protoplas.
 Kosentrasi agar Difco Bacto yang sering kali digunakan
adalah 0.6 hingga 1.0%.
 Untuk tujuan jaringan mikropropagasi biasanya
digunakan agar komersial yang harganya relatif murah.
 Perlu diperhatikan bahwa agar juga mengandung
kontaminan organik dan inorganik seperti calsium,
barium, sulfat, nitrogen, besi dan lainnya.
 Jenis agar lain yang dapat digunakan adalah biogel
P200, Gelrite, dan Alginat.
Bahan-Bahan Media Kultur
 Garam-garam mineral, smber karbon, vitamin, zat
pengatur tumbuh, dan senyawa organik harus
selalu tersedia. Senyawa yang tidak tahan panas
(heat labile), seperti giberelin, tiamin, L-glutamin,
dan asam indolasetate baiknya disentralisasi
dengan filter.
 Asam amino yang digunakan hanyaL-isomer. Salah
satu senyawa nitrogen organik yng sangat efektif
ada L-glutamin yang juga dapat digunakan sebagai
sumber nitrogen tunggal.
 Protein hydrolyzate yang tersedia ada dalam bentuk
asam dan enzimatik. Dalam bentuk enzimatik lebih
disukai karena tidak ada asam amino yang rusak
selama proses hidrolisis enzimatik
 Air kelapa dari buah kelapa muda atau tua
keduanya dapat digunakan.
 Bila hendak disimpan, air kelapa harus
dipanaskan 80 derajat sambil diaduk,
disaring, dan disimpan dalam keadaan beku.
 Terdapat beberapa senyawa yang dapat
digunakan untuk memroduksi gel.
 Agar standar dapat disubstitusi dengan
senyawa lain, seperti Gelrite.
 Air yang digunakan harus didemineralisasi
atau destilasi hingga cukup murni.
 Pemilihan media yang akan digunakan
seringkali menyulitkan bagi para pemula
yang hanya sedikit mempunyai pengalaman
dalam penelitian kultur jaringan.
 Media yang mana yang akan digunakan bila
tidak ada literatur yang menyokongnya?
 De Fossard(1976) memberikan alternatif
pemecahan dengan melakukan penelitian
yang diberi nama spektrum-luas (broad-
spectrum).
 De Fossard membagi empat kelompok
komponenyang penting dalam media nutrisi
yaitu: gula, garam-garam makro, auksin, dan
sitokinin.
 Untuk mengetahui beberapa banyak
kebutuhan senyawa tersebut di atas,maka
keempat komponen media nutrisis tersebut
dipilah menjadi tiga berdasarkan tingkat
konsentrasinnya( rendah, sedang, tinggi).

a.Gula (sakarosa) : 1 – 2 - 4%
b.Garam makro(MS) : 1/4 - ½ - 1
c.Auksin(misalnya IBA : 0.01 - 0.5 - 5.0 mg/L
d.Sitokinin(misanya BAP: 0.01 - 0.5 - 5.0 mg/L
 Masing-masing komponen dari 4 kelas
komponen yang diuji terdiri atas tiga
konsentrasi sehingga akan diperoleh 81
kombinasi untuk mendapatkan konsentrasi
yang optimal.
 Selanjutnya sangatlah perlu untuk untuk
melakukan percobaan yang lebih kritis.
 Sebagai contoh, dari hasil penelitian
pertama diperoleh bahwa 0.5 mg/L
merupakan konsentrasi auksin yang
optimal.
 Untuk memperoleh konsentrasi auksin yang
lebih kritis lagi, maka perlu diuji dalam
selang konsentrasi yang lebih kecil
yaitu:0.05-0.1-0.3-0.8-1.0-1.8 mg/L
Wadah(Botol)Kultur
 Kultur in vitro dapat dilakukan dengan mengunakan
wadah berbahan baku plastik atau gelas /kaca.
 Bentuk dan ukuran wadah juga sangat bervariasi.
 Wadah gelas memiliki beberapa keuntungan, seperti
dapat lebih lama digunakan dan tahan diotoklaf.
 Wadah terbuat dari plastik biasanya hanya digunakan
sekali dan kebanyakan tidak diotoklaf.
 Wadah plastik yang tahan otoklaf harganya relatif mahal.
Lama pengunaanya wadah kultur tergantung pada
resistensi terhadap panas(otoklaf) dan terhadap
deterjen (bahan pencuci).
 Pengunaan wadah plastik juga dapat merugikan, karena
dapat mengakumulasi etilen yang dapat meruak
eksplant/planlet.
 Pemilihan wadah kultur berbahan baku
gelas juga bergantung pada bermacam-
macam penelitian yang dilakukan.
 Untuk penelitian-penelitian , seperti
protoplas, kultur sel tunggal, dan kultur
meristem disarankan untuk menggunakan
Pyrex.
 Perlu diketahui bahwa beberapa wadah
gelas plastik dapat bersifat toksik, kerena
mengeluarkan senyawa toksik (misalnya
arsenik) ke dalam media.
 Untuk kebutuhan partikal, tidak diperlukan wadah
gelas seperti Pyrex.
 Wadah glas yang lebih murah dapat dignakan tanpa
mengakibatkan kerusakan.
 Untuk kebutuhan yang sama , wadah plastik juga dapat
digunakan.
 Perlu diperhatikan bahwa wadah plastik seringkali
tertutup dengan rapat. Hal tersebut dapat
mengakibatkan akumulasi etilen dan CO2 yang
berlebihan.
 Wadah gelas seringkali digunakan dalam kultur
jaringan.

1. Tabung reaksi
2. Cawan petri
3. Botol erlenmeyer
4. Botol bekas jeli, jus, atau bahan lainnya.
 Pada laboratorium kultur jaringan
komersial, khususnya untuk perbanyakan ,
seringkali menggunakan wadah pastik.
 Apabila wadah plastik tidak diotoklaf, maka
sterilisasinya dilakukan dengan
memasukkan wadah tersebut kedalam
kantung plastik (tanpa media) dan
disterilisasi dengan menggunkan sinar
gamma.
 Selanjutnya media yang telah
disterilisasikan ke dalam wadah yang sudah
steril di dalam laminar air flow cabinet.
 Ukuran dan bentuk wadah juga memiliki
konsekuensi yang tinggi.
 Contoh: penggunaan tabung reaksi dan cawan
petri.
 Tabung reaksi memiliki volume yang luas dan
area permukaan yang sangat kecil, sehingga
proses aerasi dan pengeringan sangat kecil.
Dengan demikian , tingkat kontaminasinya juga
rendah.
 Sebaliknya, cawan petri memilki volume yang
kecil dan memilki area permukaan yang luas.
Akibatnya , kontaminasi relatif tinggi.
 Secara umum kultur dalam wadah yang
berukuran besar menghasilkan
pertumbuhan dan perkembangan lebih baik
dibandingkan dengan wadah berukuran
kecil.
 Hal ini dapat disebabkan oleh: a. volumenya
luas, sehingga toksisitas (oleh etilen dan
CO2) dapat dihindarai dan atau b. tersedia
nutrisi yang lebih banyak.
 Sebagai bahan penutup wadah kultur
dapat digunakan alumunium foil atau
plastik bening.
 Beberapa wadah kultur memiliki tutup
botol plastik berulir.
 Penggunaan tutup plastik mempunyai
keuntungan dalam manfaat cahaya.
Akan tetapi, penggunaan kurang
praktis
Preparasi Media
 Media nutrisi tersusun atas sejumlah
senyawa kimia dan sering kali merupakan
campuran senyawa.
 Untuk mencegah kontaminasi disarankan
untuk menggunakan spatula yang berbeda
untuk tiap senyawa yang akan digunakan.
 Senyawa yang tersisa tidak dikembalikan ke
wadah penyimpanan.
 Konsentrasi senyawa dapat disajikan
dengan berbagai cara, antara lain:
 Persentase volume: Digunakan untuk air kelapa, jus
tomat, dan lain-lain, 5% air kelapa sama dengan 50 ml air
kelapa ditambahkan kedalam 950 ml air.
 Persentase bobot:Digunakan bila menggunakan agar
atau gula; 2% gula sama dengan 20 g gula tiap 1000g
(liter) media nutrisi.
 Molar: 0.01 sama dengan 1/1000 mol per liter (I mol =
gram bobot molekul). Serengkali digunakan untuk zat
pengatur tumbuh.
 Miligram per liter (mg/L): 10-7 sama dengan 0.1 mg/L,
10-6 sama dengan 1 mg/l. Seringkali digunakan untuk
zat pengatur tumbuh.
 Mikrogram per liter (mg/L) : 10-7 sama dengan 0.1 mg/L,
10-6 sama dengan 1 mg/l. Seringkali digunakan untuk
zat pengatur/l
 Parts per milion(ppm): 1 ppm sama dengan I mg/l.
Sehubungan dengan hal diatas, konsentrasi senyawa
tertentu dalam media perlu dipertimbangkan. Untuk
tujuan tersebut, dapat dilakukan dengan dua cara:
Unit Bobot
 Misalnya mg/l atau g/l. Di dalam literatur konsentrasi 1
mg/L ditulis dengan 10-3 dan konsentrasi 1 mg/L ditulis
10-6.
 Demikian juga dengan ppm: 1 ppm ditulis 10-6 atau 1
mg/L.
 Ahli fisiologis berpendapat bahwa penggunaan unit
bobot tidak dapat diterima, karena untuk
membandingkan aktivitas fisiologis tidak dapat
dilakukan dengan membandingkan 1 mg/L IAA dan 1
mg/L IBA.
 Perbandingan yang betul adalah 1µM IAA dengan 1µM
IBA, karena 1µM IAA memiliki jumlah molekul yang sama
dengan 1µM IBA.
 Hal ini disebabkan bobot molekul IAA dan IBA tidaklah
sama.
 Untuk kebanyakan senyawa terutama zat pengatur
tumbuh disarankan untuk menggunakan konsentrasi
molar.
Konsentrasi
Molar(M), milimolar(mM), atau mikromolar (µM): Satu
molar larutan (M) mengandung jumlah gram yang sama
dengan bobot molekul; 1 milimolar (mM) = 10-3 M dan 1
mikromolar (µM) = 10-6 M = 10-3 mM
Konsentrasi dalam Molar ini seringkali digunakan dalam
kultur jaringan tanaman. Berikut ini disajikan contohnya:
 Bobot molekul IAA = 175.18
 1 M larutan IAA mengandung 175.18g/L
 1 mM IAA mengandung 0.17518 g/L = 175.18 mg/L
 1 µM larutan IAA mengandung 0.00017518 g/L =
0.17518 mg/L.
 Untuk membandingkan dua media yang berbeda
dengan adil, maka sangat penting untuk menghitung
jumlah mg per liter dalam mM, seperti pada contoh
berikut in:
Perbandingan Dua Macam Media Kultur
Medium X Medium Y
1650 m/l NH4NO3 500 mg/l NH4NO3
1900 mg/l KNO3 500 mg/l KNO3
440 mg/l CaCl2.2H2O 347 mg/l Ca(NO3)2

Jika dihitung dalam mmol, berarti per liter =

20.6 mM NH4O3 6.25 mM NH4O3


18.8 mM KNO3 4.95 mM KNO3
2.99 mM CaCl2.2H2O 2.11 mM Ca(NO3)2
+ +
20.6 mM NH2 6.25 mM NH2
- -
39.4 mM NO 15.42 mM NO
+ +
18.8 mM K 4.95 mM K
2+ 2+
2.99 mM Ca 2.11 mM Ca
- -
5.98 mM Cl 0 mM Cl
60.0 mM N Total 21.67 mm Total
 Dari perhitungan diatas terlihat bahwa
media X memilki sekitar tiga kali lipat
kandungan nitrogen (NO3- dan NH4+)
dibandingkan media Y.
 Sebelum melakukan pembuatan media,
maka perlu dilakukan pembuatan larutan
stok.
 Fungsi larutan stok terutama memudahkan
penyediaan senyawa kimia dalam jumlah
kecil, seperti unsur mikro tertentu.
 Larutan stok memudahkan pemakai untuk
tidak berulang menimbang senyawa kimia.
 Larutan stok biasanya dibuat dengan
meningkatkan konsentrasi 10-100 kali lipat.
 Garam-garam inorganik, vitamin dan bahkan
sukrosa dapat disiapkan dalam konsentrasi 10
kali.
 Macam larutan stok yang dibuat sangat
bervariasi.
 Masing-masing cara pembuatan larutan stok
disesuaikan dengan kebutuhan dan
kenyamanan pembuatnya.
 Larutan stok terdiri atas kelompok senyawa
kimia, bahkan hampir seluruh senyawa kimia
pembentuk media.
 Apabila tidak dipergunakan, larutan stok
sebaiknya disimpan dalam lemari es.
 Media dapat langsung dibagikan kedalam
wadah kultur sebelum diotoklaf atau wadah
kultur dan media diotoklaf secara terpisah.
 Kondisi otoklaf yang digunakan biasanya
120°C selama 15 hingga 20 menit.
 Setelah diotoklaf media segera dikeluarkan
dan didinginkan.
 Suhu yang sesuai untuk penyimpanan media
adalah 10°C.
a. Preparasi Media Basal MS
Garam Mayor MS (10 x) Gram/liter
KNO3 19
NH4NO3 16.5
MgSO4.7H2O 3.7
CaCl2.2H2O 4.4
KH2PO4 1.7

Garam Minor MS (100 x) Mg/100 ml


H3BO3 620
MnSO4.4H2O 2230
Zn SO4.7H2O 860
Na2MoO4.2H2O 25
CuSO4.5H2O 2.5
CoCl2.6H2O 2.5

Vitamin MS (100 x) disimpan baku Mg/100 ml


Nicotinic acid 50
Thiamine hydrocloride 50
Pyridoxine hydrocloride 10
Myo-Inositol 1000
Garam EDTA sodium ferric
Garam EDTA sodium ferric dapat diperoleh dari toko kimia
secara langsung atau dengan membuatnya sendiri. Caranya
adalah dengan melarutkan 7.45 g disodium EDTA dan 5.57 g Fe
SO4.7H2O dalam satu liter.

b. Preparasi Madia Basal MS (dalam 1 liter)

Air destilasi 400 ml


Nutrisi makro dari larutan stok MS 100 ml
Nutrisi mikro dari larutan stok MS 10 ml
Vitamin dari larutan stok MS 10 ml
EDTA sodiumferric dari larutan stok 5 ml
Sukrosa 30 g

Tambahkan zat pengatur tumbuh dan bahan lain.


Sesuaikan pH hingga 5.8 dan tambahkan air destilasi hingga mencapai
1 liter.
Kultur Jaringan Tanaman

PREPARASI
EKSPLAN

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Eksplan
 Eksplan adalah sepotong jaringan tanaman
yang diletakkan pada media kultur jaringan.
 Eksplan dapat berkembang menjadi kalus
sebagai respon dari pelukaan yang
mengandung sel-sel yang aktif membelah
yang tidak terorganisir.
 Kalus dapat juga diproduksi tanpa adanya
pelukaan, yaitu melalui perkecambahan
beberapa biji pada media yang mengandung
zat pengatur tumbuh, seperti 2,4-D.
Eksplan
 Sel kalus lebih variatif dalam hal ukuran, bentuk,
pigmentasi, dan kadang-kadang ekspresi genetiknya.
 Karakteristik sel-sel kalus adalah memiliki vakuola
sentral yang besar dan nukleus terletak pada bagian
tepi.
 Sebaliknya sel-sel meristematik yang tidak
berdiferensiasi adalah isodiametrik, kecil, jarang
memiliki vakuola, sitoplasmik, dan memiliki nukleus
sentral yang besar.
 Sel-sel meristematik kadang-kadang dapat diinisiasi dari
massa kalus dan menjadi daerah meristemoid. Dari
daerah meristemoid dapat muncul akar adventif, tunas
ad-ventif, atau embrio somatik adventif.
Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi
Pemilihan Eksplan
 Umur fisiologis (ontogenik) yang akan
digunakan sebagai sumber eksplan
 Musim pada saat eksplan diambil
 Ukuran dan lokasi eksplan
 Kualitas tanaman induk
 Tujuan dari kultur sel
Umur Fisiologis Eksplan

 Umur fisiologis eksplan akan sangat mempengaruhi


pertumbuhan dan perkembangan eksplan.
 Secara fisiologis, eksplan yang berasal dari
jaringan muda lebih responsif dalam kultur in vitro.
 Pada banyak kasus, jaringan tua tidak akan
membentuk kalus yang mampu beregenerasi. Di
samping itu, karena jaringan muda relatif baru
terbentuk akan lebih untuk melakukan sterilisasi
permukaan, sehingga akan diperoleh kultur yang
bebas kontaminan
Musim
 Musim berpengaruh terhadap kontaminasi dan
respon dalam kultur.
 Hal ini berkaitan erat dengan dormansi dari
organ/jaringan tanaman induk.
 Sebagai contoh, eksplan (tunas/mata tunas) yang
diambil pada musim semi, pada saat tunas baru
muncul, akan lebih responsif dibandingkan eksplan
yang diambil pada musim lain (musim panas, gugur,
atau dingin), pada saat eksplan dalam keadaan
dorman.
 Jaringan yang secara fisiologis dorman umumnya
tidak responsif dalam kultur hingga kebutuhan
dormansinya dipenuhi
Ukuran Eksplan
 Ukuran eksplan berpengaruh terhadap respon jaringan.
Umumnya, semakin kecil ukuran eksplan, maka akan semakin
sulit untuk dikulturkan.
 Dalam hal ini media kultur biasanya perlu dilengkapi dengan
komponen tambahan.
 Eksplan yang berukuran besar biasanya mengandung
cadangan makanan dan zat pengatur tumbuh lebih banyak
yang akan mempertahankan kultur.
 Ukuran eksplan yang besar juga akan mempersulit untuk
mendapatkan eksplan yang steril.
 Tanaman memiliki keseimbangan hormonal yang berbeda
bergantung pada lokasi eksplan. Sehingga eksplan dapat
memiliki kandungan zat pengatur tumbuh yang berbeda pula.
 Konsekuensi perbedaan hormon internal tersebut akan
berpengaruh terhadap respon eksplan secara in vitro.
Kualitas Tanaman

 Disarankan untuk mengambil eksplan dari


tanaman induk yang sehat.
 Jangan mengambil eksplan dari tanaman
yang sedang mengalami cekaman
lingkungan, misalnya cekaman
air/kekeringan, atau tanaman induk yang
terserang penyakit, terutama penyakit-
penyakit sistemik
Tujuan
 Pemilihan jaringan yang digunakan untuk eksplan juga bergantung
pada tipe respon yang diinginkan dari kultur jaringan.
 Setiap bagian (jaringan) tanaman dapat digunakan sebagai bahan
eksplan. Sebagai contoh, bila tujuan kultur adalah untuk
perbanyakan klonal, maka sebaiknya menggunakan eksplan tunas
terminal atau tunas lateral. Sedangkan bila tujuan kultur adalah
ingin menginduksi kalus, maka gunakanlah potongan kotiledon,
hipokotil, batang, daun, atau embrio sebagai eksplannya.
 Eksplan yang baik untuk induksi kalus adalah jaringan kecambah
yang diambil dari biji yang dikecambahkan secara aseptik atau dari
bagian bunga yang muda.
 Jaringan daun dari kecambah aseptik merupakan bahan yang baik
untuk isolasi protoplas.
 Untuk memproduksi tanaman haploid atau kalus, eksplan yang
digunakan adalah anter atau polen.
Kultur Jaringan Tanaman

TEKNIK ASEPTIK &


PENGGUNAAN
ANTIBIOTIKA

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Teknik aseptik…….

 Kemampuan teknik kultur jaringan


ditentukan oleh kemampuan untuk
mengeliminasi segala bentuk kontaminasi
 Kontaminasi dapat terjadi setiap saat
dalam masa kultur
Sumber kontaminan

1. Eksplan, baik eksternal maupun internal


2. Organisme yang berukuran kecil
3. Botol kultur dan Alat tanam
4. Lingkungan kerja dan ruang kultur
5. Kecerobohan dalam pelaksanaan
Teknik sterilisasi yang perlu
dicermati

1. Sterilisasi lingkungan kerja


2. Sterilisasi alat dan media
3. Sterilisasi bahan tanaman (eksplan)
Sterilisasi Lingkungan Kerja

 Seluruh ruangan terlibat dalam kegiatan kultur


jaringan mutlak diperhatikan kebersihannya.
 Ruang kultur, ruang stok media, dan ruang
mikroskop (analisis) dibersihkan secara rutin
dengan menggunakan desinfektan yang sesuai.
 Ruang tanam selain dibersihkan secara rutin,
biasanya juga dilengkapi dengan lampu ultra
violet (UV)
Laminar Air Flow Cabinet
 Kotak tanam (laminar air flow cabinet) biasanya
sudah dilengkapi lampu UV.
 Aliran udara dalam kotak pindah tersebut
dilengkapi dengan filter HEPA (high efficiency
particulate air) dengan pori-pori < 0.3 M.
 Kotak tanam juga dapat disterilisasi
menggunakan alkohol 70%. Caranya dengan
menyemprotkan atau melap permukaan dalam
kotak tanam dengan menggunakan kapas steril
yang telah dicelup alkohol.
Laminar air flow cabinets
Sterilisasi Alat
 Alat yang paling umum digunakan untuk
mensterilkan alat bantu tanam dan media
adalah autoklaf.
 Alat bantu tanam, seperti pinset, gunting, cawan
petri, dan gagang scalpel bila hendak
disterilisasi menggunakan autoklaf perlu
dibungkus terlebih dahulu menggunakan kertas.
 Suhu yang digunakan untuk sterilisasi alat
adalah 1210C pada tekanan 17.5 psi selama 1
jam.
Sterilisasi Media
 Media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan
yang heatlabile dapat disterilisasi menggunakan
autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 17.5 psi, dalam
waktu 25-30 menit bergantung dari volume wadah
dan volume media.
 Setelah waktu sterilisasi yang diinginkan tercapai,
tekanan dalam autoklaf tidak boleh diturunkan
secara mendadak. Hal tersebut dapat
mengakibatkan media atau akuades dapat mendidih
dan meluap.
Table 1. Minimum autoclaving time for plant tissue culture medium

Volume of Volume of
Minimum Minimum
medium per medium per
Autoclaving ---- Autoclaving
vessel vessel
(min)* (min)*
(ml) (ml)

25 20 500 35

50 25 1000 40

100 28 2000 48

250 31 4000 63

*Minimum autoclaving times include the time required for the medium to
reach 121 Degrees Celcius. Nevertheless, autoclaving times may vary due
to autoclave differences and may require your validation
Working
Sterilizing
Component Type Solvent Conc. Comments
Method
(mg/L)

Autoclave, ETOH / May lose some activity when


IBA 0.1-10.0
Filter 1N NaOH autoclaved.

ETOH /
2,4-D Autoclave 0.01-5.0
1N NaOH
Auxins 2-4 times less active than 2,
Picloram Autoclave Water 0.002-20.0
4-D
NAA Autoclave 1N NaOH 0.1-10.0

Autoclave, ETOH / May lose some activity when


IAA 0.01-3.0
Filter 1N NaOH autoclaved.
Autoclave, May lose some activity
BA 1N NaOH 0.1-5.0
Filter when autoclaved
Autoclave, May lose some activity when
Zeatin 1N NaOH 0.01-5.0
Filter autoclaved
Zeatin
Filter 1N NaOH 0.01-5.0
riboside
Autoclave, May lose some activity when
Kinetin Cytokinins 1N NaOH 0.1-5.0
Filter autoclaved
Kinetin
Filter 1N NaOH 0.01-5.0
Riboside
Autoclave, May lose some activity when
2-iP 1N NaOH 1.0-30.0
Filter autoclaved
Autoclave, May lose some activity when
IPA 1N NaOH 0.1-10.0
Filter autoclaved
90% loss of activity when
GA3 Filter ETOH 0.01-5.0
autoclaved
GA4 Gibberellins Filter ETOH 0.01-5.0

GA7 Filter ETOH 0.01-5.0


Degraded rapidly at pH's
Thiamine (B1) Autoclave 500-5,000
much above 5.5
Pyridoxine
Autoclave
(B6)
Nicotinic acid
Autoclave 500-
(niacin) Vitamins
Cyanocobala
min (B12)

Calcium
Filter
pantothenate

tCA (trans- Autoclave, ETOH / May lose some activity when


Antiauxin 0.1-10.0
cinnamic acid) Filter 1N NaOH autoclaved.

Coconut Complex
Autoclave 10-20%
water Additive
Activated
Autoclave 0.2%
Charcoal
Degradation of sucrose into
Carbon Autoclave, D-glucose and D-fructose
Sucrose Water 2-3%
Source Filter may be inhibitory to some
cultures
Sterilisasi Bahan Tanaman
 Bahan tanaman (eksplan) yang bebas
kontaminasi merupakan langkah awal dalam
keberhasilan kultur jaringan.
 Bahan tanaman yang berasal dari lapang
mengandung berbagai kontaminan, baik
dipermukaan luar maupun kontaminan internal.
 Tingkat kontaminasi permukaan bahan tanaman
tergantung pada : (a) jenis tanaman; (b) bagian
yang dipergunakan; (c) morfologi permukaan;
(d) lingkungan tumbuh; (e) musim; (f) umur
tanaman; dan (g) kondisi tanaman.
Kultur nonsteril

 Kontaminasi kultur biasanya muncul


setelah eksplan kontak dengan medium
selama 24 – 36 jam. Pada beberapa
keadaan infeksi dapat tidak terlihat secara
visual selama beberapa minggu.
 Kontaminasi internal tanaman dapat
dieliminasi melalui sterilisasi ulang
(resterilisasi) bahan tanaman dan
lingkungan sekitarnya.
Kontaminasi Kultur Jaringan
Tanaman
 Kontaminasi berbagai mikroorganisme
merupakan faktor utama yang
menyebabkan kegagalan kultur in vitro
berbagai tanaman. Organisme yang
dapat bertindak sebagai agen kontaminan
adalah virus, bakteri, jamur, mites, thrips.
 Kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri
merupakan hal yang paling serius
Bakteri
 Berbagai jenis bakteri penyebab kontaminasi
pada kultur jaringan telah didestripsikan, baik
genus maupun speciesnya.
 Bakteri-bakteri tersbut antara lain adalah
Acinobacter, Agrobakterium, Bacillus dan
Staphylococcus. Kebanyakan bakteri tersebut
termasuk ke dalam genus yang diketahui
sebagai patogen rhizosphere (patogen pada
bagian atas tanaman).
Jamur
 Identifikasi jamur didasarkan atas uji
morfologi, seperti bentuk, koloni, tipe
koloni dan miselium
 Jamur yang kerapkali ditemui pada kultru
jaringan adalah Neuspora, Aspergillus dan
Clodosporum. Kontaminasi jamur
semakin meningkat apabila berasosiasi
dengan vektor mites dan thrips.
Pengaruh konaminan terhadap
pertumbuhan tanaman
 Kontaminan telah diketahui mampu tumbuh dengan baik pada
media tanpa adanya bahan tanaman.
 Salah satu pengaruhnya terhadap media adalah mereduksi
pH hingga dibawah 3.
 Hal ini dapat terjadi karena kontaminan mampu
memetabolisme karbohidrat yang tersedia dan menghasilkan
senyawa racun (fitotoksik) hasil fermentasi, seperti etanol dan
asetat. Keadaan tersebut akan mengakibatkan tanaman akan
kekurangan nutrisi karbohidrat, mengakibatkan beberapa
nutrisi menjadi tidak tersedia, dan menyebabkan pengaruh
toksik pada jaringan tanaman melalui senyawa sekunder
yang dihasilkan.
Antibiotika
 Antibiotik yang baik haruslah mudah larut dalam media
nutrisi dan tidak secara signifikan merubah konsentrasi
garam media.
 Antibiotik juga harus stabil pada berbagai kondisi yang
kurang baik, seperti cahaya dan periode inkubasi yang
lama.
 Antibiotik juga harus tidak terpengaruh oleh perubahan
pH dan kompatibel terhadap berbagai senyawa
penyusun media.
 Antibiotik harus bersifat sistemik dalam jaringan
tanaman dan tidak menimbulkan efek sampingan pada
jaringan tanaman.
 Karena spektrum kontaminan kisarannya
cukup luas, maka antibiotik harus memiliki
spektrum antibakteri yang luas juga.
 Resiko berkembangnya resistensi pada
bakteri-bakteri tertentu juga harus minimal.
 Harga antibiotik harus murah dan
sebaiknya bukan antibiotik yang umum
digunakan di rumah sakit.
Pencegahan kontaminasi yang lebih
disukai adalah menggunakan teknik
aseptik secara lebih hati-hati,
penggunaan laminar air flow cabinet,
dan penggunaan desinfektan kimia.
Kultur Jaringan Tanaman

PROPAGASI
IN VITRO

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Perbanyakan In Vitro
 Metode in vitro memiliki beberapa keuntungan dibandingkan metode
konvensional, yaitu:

1. Kultur dimulai dari sepotong kecil tanaman (eksplan), setelah itu tunas-
tu-nas yang berukuran kecil diperbanyak. Sehingga digunakan
terminologi mikropropagasi. Ini berarti hanya perlu sedikit ruang untuk
menjaga dan memperbanyak sejumlah besar tanaman
2. Propagasi berlangsung dalam kondisi aseptik, bebas dari patogen. Sekali
saja tanaman bisa dikulturkan, maka tidak mungkin hilang karena
serangan pe-nyakit. Planlet yang dihasilkan pada akhirnya akan bebas
bakteri dan fungi
3. Metode kultur jaringan dapat digunakan untuk membebaskan tanaman
dari virus
4. Lingkungan pertumbuhan tanaman da-pat diatur
5. Mampu menghasilkan klon tanaman yang secara secara konvensional sulit
diperbanyak secara vegetatif
6. Produksi tanaman dapat dilakukan sepanjang tahun, tidak bergantung
musim
7. Bahan tanaman dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama
8. Efisien dalam penggunaan tenaga kerja
Perbanyakan In Vitro
 Metode in vitro memiliki beberapa kerugian, yaitu:

1. memerlukan tenaga yang terampil dan ahli di bidang


tersebut,
2. fasilitas laboratoriumnya mahal,
3. untuk mendapatkan hasil yang optimum diperlukan metode
yang spesifik, sehingga harga propagulnya relatif mahal.
4. Planlet yang dihasilkan masih berukuran kecil, meskipun
dapat diproduksi dalam jumlah banyak
5. Tanaman yang dihasilkan tidak sepenuhnya autotrof,
sehingga ada periode transisi untuk dapat tumbuh secara
in vivo
6. Tanaman belum sepenuhnya dapat berfotosintesis dan
tanaman akan rentan terhadap kehilangan air
7. Kemungkinan terjadi perubahan genetik
Mikropropagasi
 Secara teoritis, metode perbanyakan in vitro dapat
dilakukan dengan, yaitu:
1. Multiplikasi tunas dari mata tunas aksilar
2. Pembentukan tunas adventif dan/atau pembentukan
embrio

 Metode kedua dapat dilakukan secara langsung dari


sepotong jaringan atau organ (eksplan) yang diambil
dari tanaman induk atau tidak langsung melalui jaringan
kalus (atau kultur suspensi) yang dapat diperoleh
melalui proliferasi sel-sel dari eksplan dan melalui
jaringan kalus yang semi-organised (seperti protocorm
atau pseudo-bulbil) yang didapat dari eksplan.
Tahap Mikropropagasi
 Tahapan mikropropagasi telah dikembangkan oleh
Prof Murashige kemudian dilengkapi oleh Deberg
dan Maene (1981).
 Murashige (1974) membagi mikropropagasi menjadi
tiga tahap (Tahap I, II, dan III).
 Deberg dan Maene (1981) menambah dua tahapan
lagi, yaitu tahap preparasi (Tahap 0) dan tahap
aklimatisasi (Tahap IV).
 Dengan demikian keseluruhan mikropropagasi
menjadi lima tahap (Tahap 0 - Tahap IV).
Tahap 0: Seleksi dan Preparasi Tanaman Induk

 Sebelum mikropropagasi dilaksanakan, diperlukan kehati-


hatian untuk menyeleksi tanaman induk.
 Selain tanaman induk harus merupakan tipikal dari
varietasnya, tanaman induk juga harus bebas penyakit.
 Keberhasilan kultur in vitro ditentukan juga oleh perlakuan
terhadap tanaman induk (atau bagian dari tanaman induk).
 Tahap reduksi kontaminan eksplan juga merupakan tahap-an
yang tidak kalah pentingnya.
 Pertumbuhan, morfogenesis, dan laju propagasi secara in
vitro dapat ditingkatkan melalui perbaikan lingkungan dan
praperlakuan kimia terhadap tanaman induk.
 Pada tahap ini juga diperlukan pengetahuan untuk
mendeteksi, mereduksi, dan mengeliminasi penyakit yang
disebabkan oleh virus.
Tahap I: Pemantapan Kultur Aseptik

 Tahapan awal proses mikropropagasi adalah untuk


mendapatkan kultur aseptik dari eksplan tanaman
induk yang sudah diseleksi.
 Keberhasilan pada tahap ini ditandai oleh: 1)
keselamatan eksplan ditransfer ke lingkungan
kultur dan 2) reaksi eksplan setelah di-transfer ke
lingkungan kultur, seperti pertumbuhan ujung tunas
atau pembentukan kalus.
 Tahap I dapat dikatakan selesai bila telah diperoleh
sejumlah eksplan yang hidup dan bebas
kontaminan.
Tahap II: Produksi Propagul

 Tujuan Tahap II adalah untuk menghasilkan multiplikasi organ


dan struktur yang selanjutnya mampu untuk menghasilkan
tanaman utuh.
 Sesuai dengan prosedur mikropropagasi in vitro, bahwa
adanya multiplikasi dapat dilihat dari munculnya tunas aksilar
atau tunas adventif yang baru, embrioid, atau organ
perbanyakan dan organ peyimpanan mini.
 Pada beberapa metode mikropropagasi, Tahap II juga meliputi
induksi pusat-pusat meristematik yang dapat menghasilkan
organ-organ adventif.
 Tunas yang dihasilkan pada Tahap II juga dapat dianggap
sebagai propagul (misalnya tunas yang dapat
dimultiplikasikan pada perbanyakan berikutnya) yang
biasanya dapat dikulturkan kem-bali untuk meningkatkan
jumlahnya.
Tahap III: Preparasi untuk Dapat Tumbuh pada
Lingkungan Alamiah
 Tunas-tunas dan planlet yang dihasilkan pada
Tahap II ukurannya masih kecil dan belum mampu
untuk tumbuh di tanah.
 Langkah yang akan dilakukan pada Tahap III adalah
menumbuhkan planlet agar dapat berfotosintesis
dan mampu tumbuh tanpa pasokan karbohidrat
artifisial.
 Beberapa planlet membutuhkan perlakuan pada
tahap ini sehingga tidak akan menjadi kerdil atau
dorman pada saat dikeluarkan dari lingkungan
kultur. Tahap II meliputi juga pengakaran secara in
vitro tunas-tunas sebelum ditransfer ke tanah.
Tahap III: Preparasi untuk Dapat Tumbuh pada
Lingkungan Alamiah
 Meskipun beberapa species tanaman dapat membentuk akar
adventif pada tunas-tunas yang terbentuk secara in vitro
selama Tahap III berlangsung, akan tetapi pada banyak
species tanaman yang lain amat penting untuk memanjangkan
tunas sebelum dilakukan pengakaran pada media
pengakaran.
 Untuk mereduksi biaya mikropropagasi, beberapa
laboratorium komersial melakukan pengakaran tunas-tunas
yang belum berakar di luar wadah kultur.
 Dengan demikian, mikropropagasi pada kultur hanya untuk
memperoleh tunas adventif atau tunas aksilar.
 Debergh dan Maene (1981) membagi Tahap III menjadi dua,
yaitu: 1) Tahap IIIa: perpanjangan mata tunas yang
dihasilkan dari Tahap II untuk menyeragamkan tunas-tunas
untuk Tahap IIIb dan 2) pengakaran tunas-tunas yang
dihasilkan dari Tahap IIIa secara in vitro atau extra vitrum.
Tahap IV: Transfer ke Lingkungan Alamiah
(Aklimatisasi)
 Pada tahap ini planlet yang dihasilkan ditransfer dari kondisi
in vitro ke lingkungan luar. Tahap ini memerlukan kehati-
hatian, bila tidak maka akan banyak tanaman yang mati.
Kematian tanaman dapat disebabkan oleh dua hal, yaitu:
 Tunas-tunas yang dihasilkan selama kul-tur diproduksi dalam
kondisi kelembaban yang tinggi dan intensitas cahaya yang
rendah. Keadaan tersebut mengakibat-kan tanaman yang
dihasilkan hanya mengandung sedikit wax epikutikuler.
Akibatnya, tanaman akan mudah kehi-langan air bila
diletakkan pada kondisi eksternal
 Pemberian sukrosa (atau karbohidrat yang lain) serta kondisi
cahaya yang ren-dah mengakibatkan planlet tidak
bergan-tung pada hasil fotosintesisnya sendiri. Dibutuhkan
beberapa hari agar planlet mampu untuk menggunakan CO2
sebagai sumber karbon (menjadi autotrof).
Kultur Pucuk

Kultur pucuk telah banyak digunakan dalam laboratorium-laboratorium


komersial. Kultur pucuk dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu:

Kultur Pucuk (Shoot Tip Culture)

 Eksplan yang digunakan adalah ujung tunas lateral atau terminal


yang panjangnya sekitar 2 cm. Pengaruh dominasi apikal dapat
dihi-langkan dengan penambahan zat pengatur tumbuh, terutama
sitokinin, ke dalam media. Dengan cara tersebut akan dihasilkan
tunas dalam jumlah banyak.
 Ukuran pucuk yang digunakan juga kerapkali mempengaruhi
keberhasilan kultur pucuk. Ukuran pucuk yang lebih besar ternyata
lebih tahan pada saat dipindahkan ke dalam kondisi in vitro,
pertumbuhannya lebih cepat, dan menghasilkan lebih banyak mata
tunas aksilar. Namun kelemahannya adalah sulit mendapatkan kultur
aseptik bila ukuran eksplannya besar serta memerlukan bahan
tanam lebih banyak..
Kultur Pucuk

Kultur Mata Tunas (Single Node Culture)

 Teknik ini kerapkali digunakan apabila ada pengaruh dominasi


apikal pada kultur pucuk yang mengakibatkan pucuk aksilar
menjadi dorman. Ada dua teknik yang dapat diterapkan dalam
kultur ini, yaitu:
 Setiap buku yang mengandung satu mata tunas aksilar
diletakkan secara horizontal di atas media padat
 Pucuk yang mengandung mata-mata tu-nas lateral seluruhnya
dikulturkan secara horizontal di atas media tanpa dipotong-
potong seperti cara pada butir 1 (in vitro layering)
 Pucuk aksilar yang tumbuh dari kedua teknik tersebut di atas
dapat dipakai sebagai sum-ber eksplan untuk subkultur
berikutnya atau dapat diakarkan untuk memperoleh tanaman
yang lengkap (planlet)
Kultur Jaringan Tanaman

KERAGAMAN
GENETIK IN VITRO

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Penyebab Keragaman
 Tanaman-tanaman yang dihasilkan melalui
mikropropagasi secara genetik sama dengan
tanaman induknya.
 Akan tetapi, dari hasil penelitian diperoleh bahwa
ada populasi dari klon tanaman yang berbeda
diban-dingkan induknya.
 Derajat keragaman tanaman in vitro biasanya tidak
lebih besar bila dibandingkan mutasi yang terjadi
pada propagasi konvensional (makropropagasi).
Penyebab Keragaman
 Keragaman genetik pada populasi tanaman yang
dihasilkan melalui mikropropagasi dapat terjadi karena:
1. Tingginya laju multiplikasi. Bila eksplan tunas yang
ditanam pada kultur ujung tunas terdiri atas beberapa
varian, maka melalui subkultur berulang varian
tersebut akan dengan cepat menjadi banyak.
Sehingga planlet off type yang dihasilkan akan banyak
juga. Untuk itu diperlukan kehati-hatian dalam
mereinisiasi kultur dari induk dengan interval waktu
tertentu.
2. Penggunaan teknik yang tidak sesuai. Varian dapat
diperoleh melalui multiplikasi tanaman secara in vitro
yang akan menghasilkan perubahan genetik
Penyebab Keragaman
 Pada keadaan normal, perbanyakan vegetatif
tanaman akan menghasilkan klon tanaman yang
merupakan duplikat atau merupakan kopi dari
tanaman induknya.
 Keragaman genetik dalam hal ini biasanya sangat
tidak diinginkan.
 Sebaliknya, variasi genetik amat diinginkan untuk
seleksi galur sel dalam upaya meningkatkan
kapasitas sintesis metabolisme sekunder atau
sebagai sumber mutan tanaman dalam program
pemuliaan tanaman.
Keragaman Genetik
Modifikasi Genom.

 Fenotipik tanaman ditentukan oleh konstitusi genetik


(genotipe), lingkungan, dan interaksi antara genotipe dan
lingkungan.
 Setiap genotipe tersusun atas paket unik informasi genetik
(genom) yang dikode dalam unit-unit hereditas yang disebut
gen.
 Gen-gen tanaman dikelompokkan dalam organela yang
disebut kromosom yang terdapat di dalam nukleus (inti) sel.
 Setiap tanaman memiliki jumlah kromosom dasar yang
berbeda.
 Selama fase pertumbuhan vegetatif, normalnya sel-sel
tanaman memiliki komplemen kromosom dua kali kromosom
dasar atau diploid.
 Species lain ada yang haploid, triploid, atau tetraploid.
Keragaman Genetik
Modifikasi Genom.

 Komplemen kromosom yang mencirikan tanaman atau


populasi sel disebut kariotipe.
 Kromosom sel-sel kalus atau sel-sel pada kultur suspensi
dapat memiliki jumlah kromosom yang tidak seperti biasanya.
 Jumlah kromosomnya bisa pasti (poliploid) atau tidak pasti
(aneuploid).
 Sel-sel yang lain mungkin dipengaruhi oleh struktur
kromosomnya.
 Sel-sel yang mengalami modifikasi tersebut akan berubah
potensial genetiknya dan tanaman yang diregenerasikan dari
sel tersebut secara genetik akan berbeda dari induknya.
 Tanaman yang diperbanyak melalui metode in vitro yang lain
umumnya secara genetik stabil, meskipun kadang-kadang
masih juga ditemui adanya keragaman.
Keragaman Genetik
Dasar Perubahan Genetik.

Keragaman genetik dapat berasal dari perubahan seluler pada tanaman


induk atau (yang lebih sering terjadi) keragaman terjadi karena perubahan
dalam kariotipe normal yang diinduksi selama kultur.
 Perubahan pada tanaman induk.
 Bagian vegetatif tanaman tersusun atas sel-sel yang seluruhnya memiliki
potensial genetik yang sama (genotipe).
 Akan tetapi, beberapa tanaman dapat tersusun atas sel-sel yang genotipenya
berbeda pada segemen/lapisan yang lain atau sel-sel yang berbeda terdapat
secara acak.
 Mosaik genetik (mixoploid) tampaknya hanya ditemukan pada tanaman yang
secara alamiah poliploid.
 Pada saat pembentukan sel (meristematik), kromosom dapat berduplikasi
tanpa pembelahan nukleus seperti biasanya terjadi (mitosis) atau tanpa
pembelahan sitoplasma (sitokinesis) dan tanpa pembentukan dinding sel.
 Bila endoreduplikasi tersebut terjadi, maka sel menjadi endopoliploid.
 Sel-sel endopoliploid yang memiliki jumlah kromosom abnormal dapat
distimulir selama inisiasi pertumbuhan kalus.
Keragaman Genetik
Dasar Perubahan Genetik.

 Perubahan genetik yang muncul dalam kultur.


 Sel-sel poliploid atau aneuploid, atau sel-sel yang
mempunyai kromosom dengan struktur yang berbeda
dapat muncul secara langsung dari kultur, di samping
dapat berasal dari keragaman genetik jaringan tanaman
induk.
 Beberapa sel pada kultur jaringan menjadi endopoliploid
dengan cara yang sama dengan sel-sel tanaman tertentu
yang berdiferensiasi secara alamiah.
 Sel-sel endopoliploid secara in vitro normalnya tidak
membelah, akan tetapi jika terjadi pembelahan, maka akan
dihasilkan sel-sel yang memiliki komplemen kromosom
tetraploid atau oktaploid.
 Endoreduplikasi lebih sering terjadi pada kultur yang
diinkubasi dalam jangka waktu yang panjang.
Keragaman Genetik
Dasar Perubahan Genetik.

 Perubahan genetik yang muncul dalam kultur.


 Poliploid pada sel-sel kultur dapat juga terjadi karena
gagalnya pembentukan spindle pada saat mitosis atau
terjadinya spindle multipolar yang abnormal.
 Kegagalan pembentukan spindle mengakibatkan dua sel
putatif akan bergabung.
 Hasilnya adalah sel-sel dengan jumlah kromosom ganda.
Pembentukan spindle multipolar atau fusi inti dapat
disebabkan oleh galur-galur sel yang memiliki ploidi yang
tidak biasa, seperti haploi atau triploid. Sel-sel aneuploid
dihasilkan dari kesalahan lain selama pembelahan inti,
seperti lag kromosom pada anafase yang menghasilkan sel
daughter yang satu lebih besar dari sel daughter yang lain
dibandingkan kromosom normalnya.
Keragaman Genetik
Dasar Perubahan Genetik.

 Perubahan jumlah kromosom pada kultur jaringan juga dapat


disebabkan oleh perubahan struktur individu kromosom.
 Hasil dari perubahan tersebut seperti halnya aneuploid atau
poliploid bertanggungjawab terhadap variasi yang ditemukan
pada regeneran.
 Hanya saja pada kejadian ini, jumlah kromosom tidak bisa
menjadi ukuran stabilitas keragaman kultur jaringan.
 Modifikasi kriptik dari genom meliputi pemutusan dan
penggabungan kromosom, penggantian segmen-segmen
kromosom ke posisi lain pada kromosom yang sama atau
penempelan segmen kromosom ke kromosom lain
(translokasi), delesi atau perputaran (inversi) segmen-segmen
kromosom, dan reposisi elemen-elemen transposon yang
dapat memodifikasi ekspresi gen di sekitarnya.
Faktor Penyebab Keragaman
 Penyebab perubahan genetik selama kultur jaringan
belum sepenuhnya dipahami.
 Keberhasilan hidup dari sel-sel yang telah mengalami
perubahan genetik bergantung pada seberapa besar
daya hidup sel-sel tersebut pada lingkungan yang ada.
 Ada sel-sel tertentu yang memiliki kemampuan untuk
tumbuh dan membelah lebih cepat dibandingkan sel-sel
induknya. Akibatnya sel-sel tersebut mendominasi sel-
sel yang lain.
 Perubahan genetik lebih banyak dipengaruhi oleh
metode kultur yang digunakan. Pada kondisi tertentu,
keragaman genetik yang dihasilkan melalui kultur
jaringan lebih besar dibandingkan yang diperoleh dari
induksi agen mutagenik.
Faktor Penyebab Keragaman
Zat Pengatur Tumbuh

 Beberapa peneliti menyatakan bahwa zat pengatur tumbuh


sintetik merupakan alat untuk menginduksi perubahan
genetik dalam kultur jaringan.
 Akan tetapi hingga saat ini belum jelas apakah zat
pengatur tumbuh mempengaruhi secara aktual
karakteristik kromosom atau meningkatkan jumlah sel-sel
yang secara genetik abnormal melalui pengaruh laju
pembelahan yang berbeda.
 Komposisi genetik populasi sel dapat dipengaruhi oleh
konsentrasi sitokinin dan auksin.
 Selsel dengan ploidi normal kerapkali ditemukan pada
media yang tidak ditambah zat pengatur tumbuh atau
kalaupun diberi zat pengatur tumbuh konsentrasinya
sangat rendah.
Faktor Penyebab Keragaman
Zat Pengatur Tumbuh

 Auksin 2,4-D seringkali mengakibatkan peningkatan frekuensi abnormalitas


genetik dan jumlah sel poliploid yang dihasilkan dari pemberian 2,4- D
seringkali lebih tinggi dibandingkan akibat pemberian NAA.
 Hasil penelitian Sunderland terhadap Vigna sinensis menunjukkan bahwa
jumlah kromosom maksimum pada kultur yang diberi NAA adalah sektaploid,
sedangkan jumlah kromosom yang dihasilkan pada kultur yang diberi 2,4-D
adalah oktaploid.
 Sitokinin cenderung meningkatkan laju pembelahan sel dan dapat
menurunkan kisaran ploidi pada suspensi sel.
 Sebaliknya dilaporkan juga bahwa konsentrasi benzyladenine yang tinggi (30
mg/l) akan meningkatkan keragaman genetik kultur kalus padi dibandingkan
dengan penggunaan 2 mg/L
 Baik sitokinin maupun auksin mulai menginduksi anomali kromosom kalus
Vicia faba bila kedua zat pengatur tumbuh tersebut ditambahkan dengan
konsentrasi 0.1 mg/L (1 mg/L untuk kinetin).
 Frekuensi mitosis abnormal akan semakin meningkat dengan semakin
meningkatnya konsentrasi zat pengatur tersebut.
Faktor Penyebab Keragaman
Komposisi Media

 Komposisi/jenis media yang digunakan dalam kultur jaringan


ternyata juga mampu mempengaruhi jumlah sel-sel yang
komposisi kariologinya berbeda.
 Jumlah galur sel wortel yang abnormal akan meningkat bila
dikulturkan pada medium basal MS atau medium yang
mengandung separuh level fosfat.
 Galur sel Datura innoxia ( 30% sel diploid, tetraploid, atau
aneuploid) tetap mempertahankan ploidinya pada medium
standar, akan tetapi komposisi sel-sel diploid dan
tetraploidnya menjadi dominan bila dikulturkan pada media
yang hanya mengandung nitrogen organik.
 Agen-agen pengkelat (chelating agents) dan beberapa
mikronutrisi metal diketahui juga menginduksi kerusakan
kromosom.
Faktor Penyebab Keragaman
Kondisi Kultur

 Peningkatan poliploidi terjadi bila sel-sel Hevea


dikulturkan pada suspensi, akan tetapi poliploidinya
menurun bila direkulturkan sebagai kalus pada media
solid.
 Kalus tembakau yang diinkubasi pada suhu 35°C tetap
dominan diploid, sebaliknya bila jaringan yang sama
dikulturkan pada 25°C menunjukkan instabilitas
kariologi dan sebagian besar menjadi tetraploid.
 Untuk mencegah adanya perubahan ploidi sebaiknya
kultur suspensi sel disubkulturkan secara periodik.
Kultur Jaringan Tanaman

PERTUMBUHAN &
MORFOGENESIS

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Pertumbuhan dan Morfogenesis
Pertumbuhan dan morfogenesi tanaman secara in
vitro dipengaruhi oleh beberapa faktor:
1. Genotipe
2. Media kultur
3. Lingkungan fisik
4. Fisiologi jaringan eksplan
Faktor Genotipe
 Genotipe dari sumber bahan tanaman yang
digunakan kerapkali amat berpengaruh terhadap
pertumbuhan dan morfogenesis secara in vitro.
 Komposisi media dan lingkungan fisik yang
dibutuhkan kerapkali berbeda, baik untuk satu
genus dengan genus lain, atau antara satu species
tanaman tertentu dengan species tanaman yang
lain.
 Kerapkali juga dijumpai kebutuhan yang berbeda
antara varietas yang memiliki karakter/sifat yang
dekat
Faktor Genotipe
Inisiasi Kultur
 Keberhasilan inisiasi kultur antara lain ditentukan oleh
daya tahan eksplan (bahan tanam) terhadap perlakuan
sterilisasi (sterilisasi permukaan).
 Dari hasil penelitian diperoleh bahwa beberapa species
Eucalyptus marginata memiliki ketahanan yang berbeda
terhadap sterilisasi yang berbeda.
 Pada beberapa kultivar peach juga diperoleh adanya
perbedaan ketegaran tunas yang dihasilkannya.
Sedangkan pada tanaman kentang, meskipun daya
multiplikasi tunasnya hampir sama, akan tetapi terjadi
perbedaan pola inisiasi tunasnya.
Faktor Genotipe
Pertumbuhan Kalus

 Terdapat perbedaan kemampuan eksplan untuk


membentuk kalus dan laju pembentukan kalusnya.
 Kemampuan jaringan untuk membentuk kalus dan laju
pertumbuhan kalus bergantung pada media (termasuk
zat pengatur tumbuh) dan faktor lingkungan.
 Terdapat perbedaan tekstur kalus, warna kalus, dan
kemampuan morfogenesis kalus yang dihasilkan dari
jaringan tanaman varietas-varietas yang memiliki
hubungan yang dekat.
Faktor Genotipe
Morfogenesis Langsung

 Tingkat kemudahan satu species tanaman untuk membentuk


tunas adventif secara in vitro dapat dilihat kemampuannya
apabila diperbanyak secara in vivo.
 Beberapa tanaman, seperti Sainpaulia (violces) dan Begonia,
mudah sekali untuk membentuk tunas dari daun yang ditanam
secara in vivo.
 Secara in vitro, tanaman-tanaman tersebut juga menunjukkan
kemampuan yang sama.
Faktor Genotipe
Morfogenesis Langsung

 Ada juga tanaman yang secara in vivo sulit membentuk tunas secara
langsung (dari jaringan daun, petiol, batang, atau bagian pedikel
bunga dan tunas bunga yang muda), akan tetapi pembentukan tunas
secara in vitro jauh lebih mudah.
 Hal ini terjadi pada tanaman Chrysanthemum morifolium.
Pembentukan tunas secara langsung biasanya terjadi pada tanaman
dikotil. Hal tersebut sangat jarang terjadi pada tanaman monokotil.
Kemampuan pembentukan tunas juga ditentukan oleh bagian
tanaman yang digunakan sebagai eksplan.
 Species tanaman yang berbeda juga menunjukkan kemampuan
pembentukan akar yang berbeda. Setiap species tanaman
membutuhkan nutrisi dan lingkungan fisik yang berbeda.
Pembentukan akar juga dipengaruhi oleh juvenilitas eksplan.
Faktor Genotipe
Morfogenesis Secara Tidak Langsung

 Secara umum faktor genotipe akan mempengaruhi


pola pembentukan organ adventif dari kalus.
 Kemampuan untuk membentuk tunas dan akar
secara terpisah atau embriogenesis dari kalus
berbeda antara famili maupun antara genera.
 Laju perkembangan kalus tanaman-tanaman yang
memiliki hubungan dekat dapat digunakan sebagai
indikator kemampuan morfogenetik dari kalus
tersebut.
Faktor Genotipe
Kontrol Genetik

 Pengaturan pertumbuhan atau penghambatan morfogenesis


suatu jaringan secara in vitro bukanlah pengaruh langsung
dari regulasi gen, akan tetapi merupakan efek sekunder dari
gen yang dikenal dengan istilah Pleiotropy.
 Dengan adanya korelasi antara laju pertumbuhan kalus
dengan kemampuan untuk membentuk tunas adventif secara
in vitro dapat disimpulkan bahwa ada sekelompok gen yang
mengatur perubahan pola pertumbuhan suatu tanaman,
meliputi proses proliferasi dan morfogenesisnya.
 Seperti gen-gen yang mengatur konsentrasi yang efektif dari
zat-zat yang dapat mendorong pertumbuhan. Zat-zat
pendorong pertumbuhan yang dikandung oleh setiap species
tanaman (endogen) bervariasi antara genotipe.
Faktor Genotipe
Faktor Kelamin

 Kelamin dari tanaman induk juga mempengaruhi daya


regenerasi kalus membentuk tunas.
 Dilaporkan bahwa regenerasi kalus yang berasal dari jaringan
tanaman betina lebih banyak beregenerasi dibandingkan yang
berasal dari jaringan tanaman jantan pada tanaman Actinidia
chinensis.
 Pemberian BAP pada tanaman Populus ciliata akan
mengakibatkan pembentukan tunas secara langsung pada
eksplan daun muda tanaman betina, akan tetapi hal ini tidak
terjadi pada tanaman jantan.
 Perbedaan tersebut diduga karena konsentrasi zat pengatur
tumbuh endogen antara tanaman jantan dan betina tidak sama
Faktor Media
Komposisi Media

 Umumnya pembentukan tunas secara Umumnya


pembentukan tunas secara in vitro bergantung
pada jenis dan konsentrasi yang tepat dari senyawa
organik, inorganik, dan zat pengatur tumbuh.
 Hal ini bukan berarti bahwa suatu kombinasi media
hanya sesuai untuk satu jenis tanaman.
 Sebagai contoh, media MS (Murashige dan Skoog)
dapat digunakan untuk banyak jenis tanaman.
 Banyak media yang digunakan sekarang ini
merupakan modifikasi dari media MS
Faktor Media
Zat Pengatur Tumbuh

 Secara in vitro, pertumbuhan dan organogenesis


amat bergantung kepada interaksi antara zat
pengatur tumbuh endogen dengan zat pengatur
tumbuh sejenis yang ditambahkan ke dalam media.
 Zat pengatur tumbuh yang paling efektif dan
kombinasinya yang tepat juga bergantung pada
jenis kombinasi media yang dipilih.
Faktor Media
Interaksi antara ZPT dengan Genotipe

 Untuk pertumbuhan dan perkembangan kultur in vitro


diperlukan komposisi dan atau zat pengatur tumbuh yang
berbeda untuk satu varietas dengan varietas lain dari suatu
jenis tanaman yang sama.
 Di samping konsentrasi, jenis zat pengatur tumbuh yang
digunakan juga memberi respon yang bervariasi anatar
varietas.
 Sebagai contoh, pemakaian thidiazuron dan zeatin
pengaruhnya sama terhadap pertumbuhan kalus P. lunatus
cv. Jackson Wonder, akan tetapi pada cv. P1.260415 aktivitas
thidiazuron sepuluh kali lebih besar dibandingkan zeatin..
Faktor Media
Kondisi Fisik Media

 Kondisi fisik media kultur jaringan yang dapat digunakan ada


tiga jenis, yaitu padat, semi padat, dan cair. Pertumbuhan
kalus dan laju pembentukan tunas dapat dipengaruhi oleh
keadaan fisik media tersebut. Penggunaan media padat
memiliki beberapa keuntungan, antara lain:
 Eksplan berukuran kecil mudah terlihat
 Tidak memerlukan alat bantu aerasi
 Tunas dan akar tumbuh teratur
 Untuk tujuan kultur kalus (bila menggunakan media cair,
maka kultur kalus akan menjadi kultur suspensi).
Faktor Media
Kondisi Fisik Media

 Umumnya media cair digunakan untuk kultur suspensi. Akan


tetapi, dapat digunakan juga untuk kultur organ dan kultur
kalus untuk meningkatkan laju pertumbuhan. Laju
pertumbuhan pada media cair dapat lebih tinggi karena
permukaan eksplan kontak langsung dengan media, sehingga
permukaan penyerapan hara atau zat pengatur tumbuh
menjadi lebih luas. Di samping itu, dapat mengeliminir
terakumulasinya senyawa toksik di sekitar jaringan karena
adanya pengocokan.
 Penggunaan media padat yang dikombinasikan dengan media
cair ternyata dapat digunakan untuk perbanyakan cepat yang
efisien. Sebagai contoh, inisiasi tunas dilakukan pada media
padat, kemudian ke media cair untuk mempercepat
pertumbuhan tunas
Faktor Lingkungan Fisik
Suhu

 Suhu rata-rata kultur in vitro biasanya lebih tinggi dibandingkan suhu


untuk pertumbuhan in vivo pada tanaman yang sama. Suhu ruang
inkubasi umumnya diatur sama, baik siang maupun malam. Pada
kebanyakan tanaman, jaringan akan tumbuh baik pada suhu 17°C
hingga 32°C. Bebereapa peneliti menggunakan suhu ruang inkubasi
yang disesuaikan dengan suhu alami tempat tanaman tumbuh, pada
siang hari diberikan suhu lebih tinggi dari suhu rata-rata dan pada
nalam hari lebih rendah 6°-8°C.
 Tanaman tropika biasanya menghendaki suhu yang lebih tinggi
dibandingkan tanaman subtropika, yaitu rata-rata 27.7°C dengan
selang antara 24°C - 32°C. Setiap jenis tanaman memiliki suhu
optimum untuk pertumbuhan dan perbanyakannya. Suhu ruang
inkubasi dalam kultur jaringan akan mempengaruhi keberhasilan
hidup eksplan, laju perkembangan kalus, dan morfogenesis/
organogenesis.
Faktor Lingkungan Fisik
Suhu

 Suhu rendah kerapkali digunakan untuk tujuan mematahkan


dormansi, antara lain untuk mematahkan dormansi mata tunas
dan umbi. Dormansi kadang-kadang berlangsung pada saat
tanaman dikulturkan atau setelah planlet diaklimatisasi.
Untuk merang-sang pertumbuhan tanaman atau umbi yang
dorman, dapat dilakukan dengan memberikan suhu rendah
beberapa minggu. Dormansi juga dapat dipatahkan dengan
memberi perlakuan zat pengatur tumbuh. Sebagai contoh,
dormansi tunas kultur pucuk tanaman Clematis dapat
dipatahkan dengan memberikan perlakuan GA3 100 mg/L
Faktor Lingkungan Fisik
Kelembaban Udara

 Kelembaban udara dalam kultur jaringan jarang


sekali dibahas. Padahal kelembaban yang rendah
dapat mengakibatkan kekering-an bahan tanaman,
sebaliknya kelembaban yang tinggi kerapkali
mengakibatkan tanaman mengalami vitrous.
Kelembaban relatif di ruang inkubasi adalah sekitar
70%, di dalam botol dibutuhkan kelembaban yang
lebih tinggi.
Faktor Lingkungan Fisik
Cahaya

 Ada tiga hal dalam pemberian cahaya yang


mempengaruhi kultur in vitro, yaitu panjang
gelombang cahaya, intensitas cahaya, dan
fotoperidisitas. Pertumbuhan organ tanaman
secara in vitro yang optimal seringkali memerlukan
adanya cahaya. Namun tidak demikian dengan
proses pembelahan sel. Pada awal pembelahan sel
dari eksplan yang dikulturkan dan pertumbuhan
kalus kadang-kadang dihambat oleh adanya
cahaya.
Faktor Lingkungan Fisik
Jenis Wadah Kultur

 Berbagai macam wadah dapat digunakan dalam kultur in


vitro. Wadah yang terbuat dari gelas dapat digunakan
berulang-ulang. Sedangkan wadah yang terbuat dari pelastik
hanya sekali pakai. Wadah yang terbuat dari gelas, apalagi
dibuat dari bahan boro-silicate, harganya cukup mahal.
Tabung reaksi ataupun petridis juga dapat digunakan dalam
kultur in vitro. Hanya saja penggunaan petridis memiliki
kelemahan dalam mengontrol kontaminasi. Dalam satu
petridis biasanya dikulturkan beberapa eksplan, bila satu
eksplan saja terkontaminasi, maka eksplan yang lain juga
mudah terkena. Wadah kultur yang terbuat dari pelastik
(polypropylene) biasanya digunakan sekali. Wadah ini
umumnya untuk laboratorium komersial, sehingga dapat
mengurangi biaya untuk pencucian dan sterilisasi.
Faktor Lingkungan Fisik
Jenis Wadah Kultur

 Pertumbuhan dan morfogenesis jaringan juga dapat


dipengaruhi oleh volume wadah kultur. Hal ini
mungkin disebabkan oleh konsentrasi O2, etilen,
dan gas-gas lainnya yang terdapat dalam wadah
kultur. Sebagai contoh, tunas tanaman Saintpaulia
berukuran lebih besar dan lebih vigor bila
ditumbuhkan dalam wadah berukuran 120 ml
dibandingkan 60 ml. Laju multiplikasi Saintpaulia
dua kali lebih banyak dibandingkan dengan yang
dikulturkan dalam wadah berukuran 30 ml
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
 Pertumbuhan dan morfogenesis kultur dipengaruhi
juga oleh kondisi fisik dan fisiologi jaringan eksplan.
Kondisi tersebut biasanya tidak berkaitan dengan
genetik, meskipun interaksi antara keduanya pasti
terjadi. Ada tiga faktor utama yang berperan
terhadap pertumbuhan dan morfogenesis yang
berkaitan satu sama lain, yaitu:
 Bagian dari ekspresi total potensial genetik
tanaman (plant’s total genetic)
 Perlakuan yang diberikan kepada tanaman induk
sebelum eksplan diambil
 Eksplan
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan

Ekspresi Genetik

 Seperti telah diuraikan sebelumnya bahwa sel-sel dari


jaringan tanaman yang berbeda hanya mentranslasi
sebagian informasi genetik total (genom) yang
dikandungnya. Informasi yang digunakan untuk
pembentukan dan pemeliharaan sel-sel akar tentunya
tidak akan sama dengan informasi yang digunakan untuk
pembentukan jaringan kalus.
 Pola ekspresi gen yang stabil dan dapat diturunkan dari
satu generasi ke generasi berikutnya (kecuali diganggu
oleh pengaruh eksternal) disebut epigenetik.
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan

Ekspresi Genetik

 Beberapa status semipermanen dapat diinduksi dan


dipelihara/dijaga dalam kultur in vitro, sebagai
contoh:
 Berbagai fase fisiologi pertumbuhan
 Meristem apikal untuk memproduksi organ
tertentu dalam jangka waktu yang lama
 Kapasitas atau kompetensi jaringan tanaman
untuk tumbuh dan/atau morfogenesis
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
Perlakuan pada Tanaman Induk

 Tanaman induk yang akan diambil eksplannya sebaiknya


dipilih dari tanaman yang sehat, vigornya tinggi, dan sedang
aktif tumbuh tanpa mengalami cekaman (stres). Perubahan
suhu, lama penyinaran, intensitas cahaya, dan cekaman air
akan menghasilkan perubahan kandungan karbohidrat,
protein, dan zat pengatur tumbuh pada tanaman induk. Hal ini
akan mempengaruhi respon jaringan yang dikulturkan bila
pengambilan eksplan dilakukan pada waktu yang berbeda.
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
Perlakuan pada Tanaman Induk

 Penyinaran yang diberikan kepada tanaman induk sebelum


eksplan diambil juga dapat mempengaruhi respon
pertumbuhan eksplan secara in vitro. Petioele daun Begonia x
Hiemalis yang diberi penyinaran selama 15 - 16 jam sehari
pada suhu 18°C - 20°C akan membentuk tunas adventif dan
akar, sedangkan petiole yang diberi penyinaran 7 - 8 jam pada
suhu 15°C tidak terjadi organogenesis. Daun tanaman
Streptocarpus akan menghasilkan tunas dan akar lebih
banyak bila tanaman induk sumber eksplan ditumbuhkan pada
suhu 12°C dibandingkan yang ditumbuhkan pada suhu 18°C.
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
Perlakuan pada Tanaman Induk

 Perlakuan dengan zat pengatur tumbuh pada tanaman induk


sebelum eksplan diambil juga sudah banyak diteliti. Sebagai
contoh, tanaman induk petunia yang diberi penyinaran sinar
merah (yang mempunyai pengaruh sama dengan sitokinin)
ternyata meningkatkan percabangan dan juga meningkatkan
jumlah tunas bila dikulturkan secara in vitro. Eksplan daun
Mulberry yang diambil dari tanaman induk yang diperlakukan
dengan BAP akan membentuk tunas adventif bila dikulturkan
in vitro.
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
Eksplan

 Keberhasilan morfogenesis suatu kultur in vitro sangat dipengaruhi


oleh eksplan yang dikulturkan. Eksplan yang dimaksud adalah
menyangkut jenis, ukuran, umur, dan cara mengkultukan eksplan.
Umur eksplan dapat ditentukan dengan tiga cara: 1) umur bahan
yang dikulturkan atau periode terbentuknya jaringan (cara paling
mudah menentukan umur suatu organ), 2) fase pertumbuhan (umur
fisiologis), dengan cara ini dikenal istilah muda (diambil dari bagian
dewasa) atau tua (diambil dari bagian juvenil yang sedang aktif
tumbuh), dan 3) umur sekuensial, artinya umur eksplan termuda
adalah bagian yang tidak berdiferensiasi dan aktif membelah
(meristem apikal). Apabila eksplan yang digunakan berasal dari
planlet in vitro, maka istilah umur eksplan adalah periode kultur, yaitu
periode waktu dari saat pertama kali dikulturkan secara in vitro
sampai siap dipakai sebagai sumber eksplan. Umur eksplan lebih
jauh diuraikan pada bagian preparasi eksplan.
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
Eksplan

 Periode kultur kalus akan mempengaruhi potensial


morfogenetik dari sel tersebut. Potensialnya akan
meningkat hanya dalam waktu singkat (satu atau
dua kali subkultur), diikuti dengan kemampuan
regenerasi yang tinggi. Setelah itu potensial
morfogenesisnya akan menurun. Penurunan
morfogenesis (daya regenerasi) akibat subkultur
yang terus menerus belum diketahui penyebabnya
dengan pasti. Hal tersebut diduga oleh karena:
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
Eksplan

 Perbedaan genetik populasi sel. Kondisi kultur yang


optimum untuk pembelahan sel secara cepat ternyata
bertentangan dengan kemampuan untuk
melangsungkan proses morfogenesis. Beberapa
perlakuan cekaman (untuk kegiatan seleksi) juga dapat
mengakibatkan sel kehilangan informasi genetik
totipotensi-nya.
 Adanya senyawa pendorong morfogenesis.
Berkurangnya senyawa pendorong morfogenesis (atau
meningkatnya aku-mulasi senyawa penghambat
morfogenesis) dalam eksplan akan mengakibatkan
penurunan kemampuan regenerasi.
Faktor Fisiologi Jaringan Eksplan
Eksplan

 Terjadi perubahan epigenetik. Selama proses subkultur


mekanisme pengaturan informasi genetik yang mengontrol
morfogenesis bisa tidak berfungsi. Hal ini bisa disebabkan
karena: 1) hilangnya daya totipotensi sel-sel yang tidak
kompeten dan 2) hilangnya/berkurangnya kemampuan
morfogenesis sel-sel tersebut.
 Ukuran eksplan juga akan menentukan keberhasilan kultur.
Eksplan yang berukuran terlalu kecil akan kurang daya
tahannya bila dikulturkan. Sebaliknya eksplan yang
berukuran terlalu besar akan sulit untuk mendapatkan
eksplan yang steril. Setiap jenis tanaman maupun organ
memiliki ukuran eksplan yang optimum untuk dikulturkan..
Kultur Jaringan Tanaman

FAKTOR LINGKUNGAN
YANG MEMPENGARUHI
PERTUMBUHAN DAN
PERKEMBANGAN

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Ruang Kultur
 Ruang kultur (ruang inkubasi) harus
dilengkapi dengan cahaya dan suhu
yang dapat dikontrol
 Satu ruang kultur tidaklah memadai
terutama bila bekerja dengan berbagai
species yang memiliki kebutuhan suhu
yang berbeda
 Untuk pengatur suhu dilakukan
dengan AC dan untuk pengatur cahaya
digunakan lampu neon.
 Untuk negara subtropik diperlukan
alat pemanas ruangan
 Posisi rak kultur harus tidak
mengganggu ventilasi yang
mengakibatkan kekurangan oksigen
dan CO2 untuk respirasi dan
fotosintesis
 Lampu neon diletakkan di bawah rak
atau di atas kultur, cahaya lebih
seragam tetapi suhu lebih tinggi
 Lampu neon diletakkan diantara rak
secara sentral, suhu tinggi dapat
dihindari tetapi iradiasi menjadi
kurang baik.
 Sulit untuk menentukan apakah kultur
akan ditumbuhkan pada kondisi gelap
atau terang ?.
 Kultur akan ditumbuh pada suhu
rendah atau tinggi ?.
 Untuk memutuskan keadaan tersebut
adalah dengan mencobakan secara in
vitro.
Faktor fisik
 Cahaya merupakan masalah yang
rumit : panjang hari, intensitas cahaya
dan kualitas cahaya.
 Panjang hari yang umum digunakan 12
– 16 jam per hari, meskipun ada kultur
yang diberi cahaya terus menerus.
 Pada beberapa kasus pertumbuhan
dilakukan pada keadaan gelap terus
menerus seperti eksplan yang
mengalami pencoklatan atau kalus.
 Pada dasarnya panjang hari yang
terbaik secara in vitro akan sama
dengan pertumbuhan stek atau
tanaman utuh.
Iradiasi
 Iradiasi memiliki informasi yang lebih
banyak, iradiasi yng tinggi biasa
terjadi di lapang atau pada fitotron
(300 – 700 µmol m-2 s-1) tanpa kecuali
akan merusak pada kultur in vitro.
 Pertumbuhan umumnya berlangsung
pada iradiasi 80 – 150 µmol m-2 s-1
 Lampu neon (mengeluarkan cahaya
UV) hampir selalu digunakan untuk
kultur in vitro.
 Cahaya UV dapat menghambat
pertumbuhan tunas.
 Pertumbuhan jaringan tembakau + IAA
lebih baik pada cahaya merah
daripada cahaya biru.
 Pada beberapa kasus penggunaan
lampu sodium dengan tekanan tinggi
memberikan pertumbuhan yang cukup
baik.
 Cahaya merah menstimulir
perumbuhan akar adventif.
 Pertumbuhan kalus lebih baik pada
cahaya putih dan biru daripada cahaya
merah.
Suhu
 Suhu biasanya diatur 24 - 28°C.
 Suhu < 18°C dan > 28°C tergantung pada
species.
 Suhu optimal untuk pertumbuhan dan
perkembangan in vitro umumnya 3 - 4°C > in
vivo.
 Suhu rendah atau sangat rendah dapat
digunakan untuk menghentikan
pertumbuhan kultur in vitro (freezing).
Kelembaban
 Sangat sedikit yang diketahui mengenai
kelembaban ruang inkubasi terhadap
pertumbuhan dan perkembangan tanaman
secara in vitro.
 Kelembaban dalam tabung reaksi relatif
tinggi.
 Kelembaban yang tinggi dalam ruang
inkubasi akan mengakibatkan tingginya
infeksi.
Air
 Ketersediaan air (yang dapat dikintrol
melalui konsentrasi agar)
mempengaruhi vitrifikasi
 Secara umum ketersediaan air hanya
berpengaruh kecil pada pertumbuhan
kultur
Oksigen
 Aerasi yang baik merupakan faktor
penting untuk pertumbuhan sel,
jaringan, dll.
 Pasokan oksigen pada tabung reaksi
dapat disokong melalui penggunaan
tutup metal, tidak menggunakan tutup
kapas dan menggunakan media cair.
 Pembentukan organ, khususnya
pembentukan akar adventif disokong
oleh pasukan oksigen yang baik.
 Pertumbuhan kalus juga disokong
melalui aerasi wadah kultur
Karbondioksida
 Meskipun CO2 dapat digunakan sebagai
sumber karbon bagi kultur in vitro, akan
tetapi kenyataan sukrosa merupakan
sumber karbon yang lebih baik.
 Penambahan CO2 in vitro tidaklah terlalu
memberipengaruh karena [CO2] dalam
tabung sangat tinggi
 Fs in vitro < kondisi normal
Arus/Aliran Listrik
 Apabila arus lemah (1µA) dilewatkan
diantara jaringan dan media kultur, akan
terlihat pertumbuhan kalus yang dramatik.
 Efek tersebut bergantung pada arah arus,
bila kalus dibuat negatif maka laju
pertumbuhan meningkat 70 %.
 Bila arus dibalik hanya sedikit pertambahan
pertumbuhan kalus
Komponen lain
 Etilen, etanol, dan asetaldehid senyawa
yang didapatkan daam kultur in vitro.
 Pengaruh terhadap pertumbuhan dan
perkembangan tergantung konsentrasi,
jaringan dan species yang dikultur
 Pada umumnya senyawa ini menghambat.
Kultur Jaringan Tanaman

KULTUR KALUS,
KULTUR SUSPENSI,
DAN SELEKSI IN VITRO

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Kalus……..?
 Kalus pada dasarnya merupakan kumpulan
sel-sel yang tidak/belum terorganisir.
 Secara alamiah kalus dapat muncul dari
pelukaan jaringan atau organ.
 Pada banyak spesies tanaman pertumbuhan
dan perkembangan kalus dapat dirangsang
melalui pemberian zat pengatur tumbuh dan
media tertentu.
 Kalus dapat terus dipertahankan dan
diperbanyak dengan pengaturan
media.
 Pada kondisi tertentu dan kerapkali
secara spontan, kalus mampu
bergenerasi membentuk organ-organ
adventif dan /atau emrio.
Tiga Tahapan Kultur Kalus

 Induksi (Induction): Sel-sel pada


eksplan mulai berdediferensiasi dan
mulai membelah
 Proliferasi/Perbanyakan (Proliferative):
Pembelahan sel yang cepat
 Diferensiasi (Differentiation)
(sometimes): lintasan metabolik atau
organogenesis
INDUKSI KALUS
 Tanaman terdiri atas sel-sel yang telah
terdiferensiasiasi
 Perlu dediferensiasi sebelum proses
pembelahan sel dan pembentukan kalus
berlangsung.
 Jika eksplan telah memiliki jaringan merismatik,
maka pembentukan kalus dapat segera
berlangsung.
 Setelah dediferensiasi, kalus dapat terbentuk
melalui pengaturan zat pengatur tumbuh yang
terdapat pada media.
Induksi Kalus

© 1998-2003, Branch of Shemyakin&Ovchinnikov IBCh RAS


Kalus

© 1998-2003, Branch of Shemyakin&Ovchinnikov IBCh RAS


Photo 2. Callus forming on caper leaf (A)
and stem cutting (B) 2 weeks after culture
on MS12 medium containing 2 mg/L 2,4-D,
1 mg/L NAA, and 0.1 mg/L GA3.
Pembelahan Kalus

E. Sutton, UC Davis
Diferensiasi
 Organogenesis
 Embriogenesis Somatik
 Berbagai tipe organ (akar, batang, daun,
bunga) dan jaringan dapat digunakan
sebagai bahan awal pembentukan kalus
 Bahan yang digunakan, umur dan posisi asal
bahan tanaman amat berpengaruh terhadap
proses pembentukan kalus, sekaligus
mempengaruhi pembentukan organ.
 Respon pembentukan kalus pada tanaman
monokotil berbeda dibandingkan tanaman
dikotil.
 Hal ini mengakibatkan perlunya
penambahan auksin sebagai stimulus untuk
induksi kalus.
 Karena amat sulit untuk membentuk kalus
pada tanaman monokotil, maka kerapkali
digunakan emrio, bibit atau bunga muda
untuk bahan awal inisiasi kalus.
 Umumnya tanaman memerlukan tambahan zat
pengatur tumbuh untuk menginisiasi kalus.
 Zat pengatur tumbuh eksogen yang dibutuhkan
sangat bergantung pada genotipe dan
kandungan zat pengatur tumbuh endogen.
 Untuk inisiasi kalus kebanyakan tanaman
memerlukan auksin, tanaman lain memerlukan
auksin dan sitokinin, atau sitokinin saja.
 Komponen lain seperti sumber dan konsentrasi
karbohidrat, senyawa aditif media (cesein
hydrolysate, malt extract, air kelapa dll.) amat
penting dalam pembentukan kalus.
Kultur Kalus
 Setelah induksi , kalus selanjutnya
ditumbuhkan pada media baru.
 Subkultur pertama biasanya dilakukan
pada media solid dengan kondisi
pertumbuhan sama seperti untuk
induksi kalus. Hanya saja konsentrasi
auksin dan sitokininnya lebih rendah.
 Jaringan kalus yang berasal dari spesies
tanaman yang berbeda akan memiliki
struktur dan pertumbuhan kalus yang
berbeda juga.
 Warna dan kekerasan kalus juga
berbeda.
 Pertumbuhan kalus pada tanaman yang
sama juga seringkali berbeda
bergantung pada posisi asal eksplan dan
kondisi pertumbuhan.
 Kultur kalus pada media solid umumnya
lebih lambat dibandingkan media cair
(dengan di shaker).
 Laju pertumbuhan yang berbeda dapat
disebabkan oleh kontak antara kalus
dengan media serta pengambilan
oksigen yang lebih baik pada media cair.
 Pembentukan organ-organ adventif
dan/atau emrio somatik dapat terjadi
bergantung pada spesies tanaman dan
asal kalus muncul.
 Kapasitas regenerasi jaringan kalus
dapat berkurang atau sama sekali hilang
jika pertumbuhan kultur berlangsung
terlalu lama. Sejauh ini tidak diketahui
penyebabnya.
 Kalus biasanya lebih mudah untuk
beregenerasi menjadi akar adventif
dibandingkan tunas adventif.
 Pembentukan akar biasanya berlangsung
pada media yang mengandung konsentrasi
auksin tinggi dan konsentrasi sitokinin
rendah.
 Sebaliknya pembentukan tunas dapat terjadi
pada jaringan kalus yang ditumbuhkan pada
media yang mengandung konsentrasi auksin
rendah dan sitokinin tinggi.
 Embrio yang dihasilkan dari kalus disebut
dengan embrio somatik.
 Emrio somatik memiliki kemiripan yang amat
besar dengan embrio zigotik.
 Sel-sel kalus yang akan membentuk embrio
seringkali berukuran kecil, sitoplasmanya
tebal, nukleus besar, nukleoli jelas, vakuola
kecil dan banyak mengandung butiran pati.
 Perkembangan embrio dari sel-sel
embriogenik umumnya terjadi pada media
yang tidak mengandung auksin.
 Embriogenesis sangat jarang
digunakan untuk tujuan propagasi.
 Teknik ini seringkali digunakan untuk
menghasilkan mutan atau somaklon
yang digunakan untuk program
pemuliaan tanaman.
Kultur Suspensi
 Kultur suspensi sel tanaman secara luas
digunakan sebagai model untuk
mempelajari lintasan motabolisme
sekunder, ekspresi gen, dan amat
berguna pada tahap seleksi in vitro dan
transfer gen.
 Kebanyakan kultur suspensi diperoleh
melalui kelompok kalus yang diagitasi
pada media cair dengan komposisi media
yang sama dengan komposisi media
untuk pertumbuhan kalus.
 Laju agitasi berkisar antara 30-150pm
 Pada media tahap awal subkultur ke
media baru, kalus yang berukuran besar
sebaliknya dipisahkan menjadi kalus
yang berukuran kecil.
 Untuk setiap kultur sel terdapat ukuran
minimal kalus, apabila dibawah ukuran
tersebut maka kultur tidak akan tumbuh
 Jumlah sel pada kultur suspensi dapat
ditentukan/ dihitung dengan
haeomocytometer.
Seleksi In Vitro
 Seleksi terhadap sel-sel yang dikulturkan dapat
menghasilkan mutan dalam jumlah yang amat
banyak.
 Mutan-mutan yang dihasilkan umumnya
diseleksi untuk melihat tingkat resistensinya.
 Sel-sel resisten dalam jumlah yang banyak
dapat diseleksi dengan melihat kemampuannya
untuk tumbuh pada media yang mengandung
inhibitor, sel-sel yang sensitif tertentu tidak
akan tumbuh.
 Percobaan seleksi in vitro telah banyak
dilakukan untuk menghasilkan tanaman tahan
herbisida serta tanaman tahan kekeringan dan
kadar aram yang tinggi.
 Prosedur seleksi sel-sel tanaman yang
resisten terhadap inhibitor melalui kalus
agak lebih sulit dibandingkan seleksi pada
tingkat sel.
 Pada prosedur ini potongan kecil kalus yang
seragam (25-250mg bobot basah) diletakkan
pada media solid yang telah diberi
perlakuan inhibitor dengan konsentrasi
letal, subletal, dan borderline lethal.
 Selama inkubasi, sel resiten biasanya
diketahui dengan melihat bagian yang
tumbuh lebih vigor.
 Seleksi resistensi galur sel yang berasal
dari sel atau protoplas memilki beberapa
keuntungan.
 Kultur protoplas dan kultur sel dapat
langsung disiapkan langsung dari
seluruh bagian tanaman.
 Klon yang berasal dari galur sel yang
didapatkan dari seleksi dengan
menggunakan sel tunggal lebih pasti
hasilnya dibandingkan yang berasal dari
kultur kalus.
Kultur Jaringan Tanaman

KERAGAMAN
SOMAKLONAL

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Keragaman Somaklonal

Keragaman genetik pada tanaman


yang dihasilkan dari tanaman hasil
kultur jaringan dan dapat dideteksi
karakter genetik atau fenotipiknya
Gambaran Dasar Keragaman
Somaklonal
 Keragaman kariotipe, karakteristik isozim, dan
morfologi somakonal juga dipelajari.

 Calliclone (clones of callus), mericlone (clones


of meristem) and protoclone (clones of
Protoplast) were produced.

 Generally heritable mutation and persist in plant


population even after plantation into the field
Mekanisme Keragaman Somaklonal

1. Genetik (Keragaman/variasi yang diturunkan)


• Pre-existing variations in the somatic cells of
explant
• Caused by mutations and other DNA changes
• Occur at high frequency

2. Epigenetik (Variasi yang tidak diturunkan)


• Variations generated during tissue culture
• Caused by temporary phenotypic changes
• Occur at low frequency
Callus Tissue

Organogenesis Somaclonal Variants

Regenerated plants Hardening and Selfing

Steps involved in induction and selection of Somaclonal


Variations
Physiological Biochemical
Cause Cause

Genetic Cause
Penyebab Fisiologis

 Adanya zat pengatur tumbuh

 Kondisi kultur
Penyebab Genetis

1. Perubahan jumlah kromosom


 Euploidi: perubahan set kromosom
 Aneuploidi: perubahan sebagian set kromosom
 Poliploidi: Organisme yang memiliki lebih dari 2 set
kromosom
 Monoploidi: Organisme yang memiliki satu set
kromosom

2. Perubahan struktur kromosom


 Delesi
 Inversi
 Duplikasi
 Translokasi
Penyebab Genetis
3. Mutasi Gen
 Tansisi
 Transversi
 Insersi
 Delesi
4. Mutasi Plasmagen

5. Aktivasi Elemen Transposon


Penyebab Genetis
6. DNA sequence

 Change in DNA
 Detection of altered fragment size by using Restriction
enzyme

 Change in Protein
 Loss or gain in protein band
 Alteration in level of specific protein

 Methylation of DNA
 Methylation inactivates transcription process.
Penyebab Biokimia

 Lack of photosynthetic ability due to


alteration in carbon metabolism

 Biosynthesis of starch via carotenoid


pathway

 Nitrogen metabolism

 Antibiotic resistance.
Deteksi dan Isolasi Keragaman
Somaklonal
1. Analisis Karakter Morfologi
 Karakter kualitatif: tinggi tanaman, waktu
pematangan, waktu pembungaa, luas daun
 Karakter kuantitatif: hasil bunga, biji dan kandungan
wakx di berbagai bagian tanaman

2. Deteksi varian oleh studi sitologis


 Staining jaringan meristematik seperti ujung akar,
ujung daun dengan feulgen dan acetocarmine
menghasilkan jumlah dan morfologi dan kromosom.

3. Deteksi varian dengan kandungan DNA


 Deteksi Cytophotometer staining inti dapat digunakan
untuk mengukur kandungan DNA.
Deteksi dan Isolasi Keragaman
Somaklonal
4. Variant detection by gel electrophoresis
 Change in concentration of enzymes, proteins and
hemical products like pigments, alkaloids and amino acids
can be detected by their electrophoretic pattern
5. Detection of disease resistance variant
 Pathogen or toxin responsible for disease resistance can
be used as selection agent during culture.
6. Detection of herbicide resistance variant
 Plantlets generated by the addition of herbicide to the cell
culture system can be used as herbicide resistance plant.
Deteksi dan Isolasi Keragaman
Somaklonal
7. Detection of environmental stress tolerant
variant
 Selection of high salt tolerant cell lines in tobacco
 Selection of water-logging and drought resistance cell
lines in tomato
 Selection of temperature stress tolerant in cell lines in
pear.
 Selection of mineral toxicities tolerant in sorghum plant
(mainly for aluminium toxicity)
Keuntungan Keragaman
Somaklonal
 Menolong perbaikan tanaman
 Menghasilkan keragaman genetik
 Meningkatkan dan memperbaiki produksi
metabolit sekunder
 Seleksi resisten tanaman terhadap berbagai
toksin, herbisida, konsenterasi garam yang
tinggi, dan keracunan mineral
 Sesuai untuk pemuliaan spesies pepohoan
Kerugian Keragaman
Somaklonal
 Apabila tujuannya adalah untuk perbanyakan secara
massal genotipe-genotipe elit yang seragam, maka
dengan adanya keragaman somaklonal
mengakibatkan kerugian
 Kadang-kadang dihasilkan sifat yang tidak
dikehendaki
 Varian yang dihasilkan bersifat acak dan tidak stabil
secara genetik
 Membutuhkan percobaan lapang yang luas
 Tidak sesuai bagi karakter agronomis yang komplek,
seperti pane, kualitas, dll.
 Dapat berkembang varian yang pleiotropik
Kultur Jaringan Tanaman

PRODUKSI
TANAMAN BEBAS
VIRUS

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Infeksi Virus
 Virus adalah paket kecil informasi genetik (RNA atau DNA) yang
merupakan benda asing bagi tanaman inang.
 Tanaman-tanaman budidaya yang terinfeksi patogen selain
mengakibatkan penurunan vigor, kualitas, dan hasil panen juga
merupakan penghalang bagi pertukaran plasmanutfah
internasional.
 Tidak seperti fungi dan bakteri yang menyerang tanaman,
penyakit akibat virus bersifat persisten dan tidak dapat diobati
dengan perlakuan pestisida.
 Replikasi virus dalam tanaman inang memiliki pengaruh yang
amat besar.
 Gejala-gejala yang muncul lebih banyak disebabkan oleh
kejadian-kejadian sekunder daripada oleh replikasi virus itu
sendiri. B
 eberapa virus yang memiliki tingkat replikasi tinggi ternyata
hanya memunculkan gejala yang ringan, bahkan tanpa gejala.
 Kadang-kadang manipulasi lingkungan atau penyemprotan zat
pengatur tumbuh dapat membantu memperbaiki/menghilangkan
gejala tanpa mereduksi replikasi virus.
Infeksi Virus
 Hingga saat ini sudah dibuktikan bahwa virus tanaman tidak mengandung
enzim, toksin, atau senyawa lain yang terlibat dalam patogenisitas dan
mengakibatkan berbagai gejala pada inangnya.
 Satu-satunya determinan penyakit tersebut adalah asam nukleat virus (RNA
atau DNA). Pada umumnya virus akan mengakibatkan penurunan
fotosintesis melalui penurunan jumlah klorofil per daun, efisiensi klorofil, dan
luas daun per tanaman. Kerapkali virus mengakibatkan penurunan jumlah
zat pengatur tumbuh endogen dalam tanaman dan sebaliknya meningkatkan
senyawa penghambat tumbuh. Fenomena lain pada tanaman terinfeksi virus
adalah adanya penurunan nitrogen terlarut pada saat sintesis virus. Di
samping itu, tanaman yang memunculkan gejala mosaik biasanya terjadi
penurunan jumlah karbohidrat pada jaringannya
 Untuk meningkatkan keberhasilan eliminasi virus dari tanaman diperlukan
beberapa tahapan yang harus dikembangkan: a) metodologi untuk
mengidentifikasi tanaman yang terinfeksi virus harus tersedia (seperti ELISA
atau hibridisasi dot blot asam nukleat) dan b) teknik kultur jaring-an untuk
eliminasi virus harus dikembangkan (kultur tunas aseptik atau kultur kalus
embrionik).
Eliminasi Penyakit Melalui Kultur
Jaringan
Kultur Meristem

 Virus umumnya menyebar tidak merata pada tanaman yang


terinfeksi.
 Meristem apikal seringkali bebas dari partikel virus atau kalaupun
ada konsentrasinya sangat rendah.
 Alasan yang mendasari meristem apikal bebas dari invasi virus
adalah: a) pergerakan virus pada tubuh tanaman berlangsung
melalui sistem vaskular, sistem tersebut tidak ditemukan pada
meristem; b) mitosis pada sel meristem berkompetisi dengan
multiplikasi virus ; c) sistem inaktivasi virus pada meristem
memiliki aktivitas yang tinggi; d) konsentrasi auksin pada meristem
mungkin menghambat multiplikasi virus; dan e) kerusakan jaringan
yang disebabkan pemotongan meristem mengakibatkan degradasi
virus.
Eliminasi Penyakit Melalui Kultur
Jaringan
Kultur Meristem

 Peneliti awal kultur meristem dilakukan oleh Morel dan Martin


(1952) yang pertama kali mendemonstrasikan konsep regenerasi
tanaman bebas virus dari ujung meristem tanaman dahlia.
 Sejak saat itu, kultur meristem secara ekstensif digunakan untuk
memproduksi tanaman bebas patogen.
 Meskipun teknik kultur jaringan yang lain (seperti kultur kalus)
telah berhasil digunakan untuk mengeliminasi virus dari tanaman,
kultur meristem tetap merupakan teknik yang paling
menguntungkan.
 Tanaman-tanaman yang telah berhasil dibebaskan dari virus
antara lain adalah asparagus, pisang, ubikayu, kentang, tebu,
strawberi, dan cauliflower.
 Meskipun pada dasarnya kultur meristem digunakan untuk
eliminasi virus, akan tetapi kultur meristem juga sekaligus dapat
digunakan untuk mengeliminasi patogen sistemik lainnya seperti
fungi, bakteri, dan mikoplasma.
Eliminasi Penyakit Melalui Kultur
Jaringan
Eliminasi Penyakit Melalui Kultur Meristem dan
Termoterapi Tanaman Tebu
Eliminasi Penyakit Melalui Kultur
Jaringan
Kultur Kalus

 Kultur kalus telah digunakan untuk memproduksi


tanaman bebas penyakit.
 Eksplan yang diambil dari tanaman yang terinfeksi
mungkin dapat bebas virus dengan sendirinya atau
kalus yang berkembang menjadi bebas virus setelah
beberapa kali subkultur.
 Pada kalus terlihat bahwa area yang bebas virus
berkembang dari sektoring kalus.
 Regenerasi dari kalus tersebut memungkinkan
diperolehnya tanaman yang bebas virus.
Eliminasi Penyakit Melalui Kultur
Jaringan
Metode In Vitro Lainnya

 Adanya populasi sel yang tidak terinfeksi meskipun tanaman


terinfeksi penyakit dengan berat serta sifat totipotensi sel
tanaman dalam kultur memungkinkan diregenerasikan
tanaman yang bebas virus.
 Metode yang digunakan adalah regenerasi cepat dari
jaringan daun untuk meminimalkan pembentukan kalus
serta kemungkinan terjadinya keragaman somaklonal.
 Hormon yang menginduksi pengkalusan, seperti 2,4-D, juga
sebaiknya tidak digunakan.
 Metode yang lain adalah dengan meregenerasikan tanaman
dari protoplas yang bebas virus.
 Tanaman-tanaman bebas virus juga dapat diperoleh dari
jaringan gametofitik, seperti nuselus dan ovul.
Eliminasi Penyakit Melalui
Termoterapi
 Prinsip dasar dari terapi panas untuk eradikasi
virus adalah pada suhu tertentu banyak dari virus
tanaman yang menjadi inaktif dengan sedikit atau
tanpa merusak jaringan tanaman inangnya.
 Suhu yang rendah juga telah dicobakan dengan
hasil yang cukup baik.
 Secara umum suhu yang sesuai untuk perlakuan
panas adalah suhu yang menghambat multiplikasi
virus atau suhu yang sesuai untuk meningkatkan
pertumbuhan vegetatif tanaman yang akan
menghasilkan tunas baru yang bebas virus.
Eliminasi Penyakit Melalui
Termoterapi
 Beberapa metode perlakuan panas adalah air panas, udara panas,
udara panas, atau aerated steam.
 Temperatur yang seringkali digunakan adalah 50 hingga 55°C
selama 30 menit hingga 3 jam.
 Faktor pembatas termoterapi untuk eradikasi virus adalah kecilnya
proporsi tanaman yang hidup setelah perlakuan panas.
 Jika potongan jaringannya berukuran panjang maka diperlukan
waktu pemanasan yang lebih lama.
 Perpanjangan waktu pemanasan akan berpengaruh terhadap titik
tumbuh tanaman.
 Aplikasi perlakuan panas bersamaan dengan kultur jaringan
biasanya dilakukan bila kontaminasinya berat.
 Teknik umum yang telah banyak dilakukan adalah kultur ujung
meristem dengan perlakuan termoterapi.
 Teknik ini telah banyak digunakan dan berhasil untuk
membebaskan virus tanaman krisan, carnation, strawberi, ubi
jalar, tebu, tembakau, dan kentang.
Eliminasi Penyakit Melalui
Kemoterapi
 Perlakuan kimia terhadap penyakit virus tanaman masih belum
banyak dilakukan.
 Hingga saat ini tidak ada senyawa kimia yang dapat mengontrol
virus pada tanaman inang.
 Kebanyakan senyawa kimia yang diuji bersifat fitotoksik dan virus
akan bermultiplikasi setelah perlakuan kimia selesai diterapkan.
 Salah satu kelompok senyawa antiviral yang banyak digunakan
untuk pengujian eleminasi virus adalah nukleosida (Virazole, 2-
Thiouracil, 6-Azauracil) yang mampu membalikkan metabolisme
asam nukleat dari virus.
 Virazole merupakan agen antiviral yang telah banyak digunakan
untuk eradikasi partikel virus pada tanaman tembakau, akan tetapi
Virazole, seperti halnya kebanyakan antiviral, bersifat fitotoksik.
 Thiouracil telah digunakan dalam media pada kultur ujung
meristem dan diperoleh bibit yang bebas virus.
Deteksi dan Diagnosis Virus
 Eksistensi virus pada tanaman atau bagian tanaman dapat
diketahui dengan satu atau beberapa metode pengujian
virus.
 Metode pengujian virus yang umumnya digunakan adalah: a)
tanaman indikator, b) serologi, c) mikroskopi elektron, dan d)
elektroforesis.
 Teknik yang dipakai tergantung kepada macam virus yang
hendak diteliti dan fasilitas yang tersedia.
 Uji serologi dilakukan berdasarkan reaksi protein virus
sebagai antigen dengan antibodi hewan.
 Antiserum yang mengandung antibodi diperoleh dari darah
hewan, umumnya kelinci, yang sebelumnya telah diinjeksi
dengan virus.
 Dengan kondisi penyimpanan yang sesuai antiserum yang
diperoleh dapat disim-pan dalam jangka waktu yang lama.
Deteksi dan Diagnosis Virus
 Uji serologi memiliki beberapa keuntungan dibandingkan uji yang
lainnya, yaitu antara lain hasil dapat lebih cepat diperoleh,
pengujian lebih akurat, tidak memerlukan tenaga kerja yang
banyak, dan tidak perlu tempat yang luas untuk pertumbuhan
tanaman.
 Berdasarkan kepekaannya, metode serologi dipilah men-jadi dua
kelompok, yaitu: 1) uji serologi dengan kepekaan rendah, seperti
uji pre-sipitasi, difusi agar ganda, dan uji aglutinasi lateks, dan 2)
uji serologi dengan ke-pekaan tinggi, seperti enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA), dot immuno-binding, dan
immunosorbent electron microscopy (ISEM).
 Akhir-akhir ini metode identifikasi virus secara rutin sudah semakin
berkembang.
 Metode tersebut meliputi identifikasi coat protein virus atau asam
nukleat yang terkandung dalam coat protein. Berikut ini disajikan
beberapa teknik untuk mengidentifikasi virus.
Deteksi dan Diagnosis Virus
Metode untuk Mendeteksi Virus
VIRUS

PROTEIN COAT NUCLEIC ACID

SAP

ANTIBODY CLONED SEGMENT

ELISA TEST DETECTION SYSTEM


Deteksi dan Diagnosis Virus
Enzyme Linked-Immunosorbent Assay (ELISA)

 Akhir-akhir ini pengujian virus tanaman secara serologi


telah berkembang dengan pesat. Antiserum yang tersedia
sekarang memiliki kisaran yang luas untuk berbagai jenis
virus dan dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan
virus-virus tersebut. Teknik ELISA merupakan uji serologis
yang sensitif untuk banyak virus tanaman.

 Teknik ELISA yang digunakan dalam virologi tanaman dapat


dilakukan secara langsung, yaitu antigen dideteksi secara
langsung dengan antibodi spesifik yang berlabel enzim.
Teknik ELISA juga dapat dilakukan secara tidak langsung,
yaitu antigen dideteksi dengan antibodi yang kemudian
dideteksi lagi dengan antibodi spesifik yang berlabel enzim.
Deteksi dan Diagnosis Virus
Enzyme Linked-Immunosorbent Assay (ELISA)

 ELISA double antibody sandwich (dasELISA) merupakan teknik


yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi virus tanaman.
 Prosedurnya adalah antibodi virus tertentu telah teradsorbsi pada
lubang sumur plat ELISA.
 Sampel tanaman yang mengandung virus kemudian dimasukkan ke
dalam lubang sumur tersebut.
 Partikel virus yang ada pada sampel akan terikat pada antibodi
yang ada dalam lubang sumur plat.
 Kemudian tambahkan antibodi kedua yang berlabel enzim,
sehingga akan terbentuk sandwich antibodi ganda.
 Komplek antigen-antibodi kemudian dideteksi dengan
menambahkan substrat tertentu yang dapat bereaksi dengan
enzim dan menghasilkan warna tertentu dan dapat diukur dengan
spektrofotometer.
 Apabila tidak ada virus, maka tidak akan terbentuk komplek
antigen-antibodi, sehingga label enzimnya juga tidak ada dan tidak
akan terbentuk warna bila ditambahkan substrat.
Deteksi dan Diagnosis Virus
Enzyme Linked-Immunosorbent Assay (ELISA)

 Akhir-akhir ini pengujian virus tanaman secara serologi


telah berkembang dengan pesat.
 Antiserum yang tersedia sekarang memiliki kisaran yang
luas untuk berbagai jenis virus dan dapat digunakan untuk
mendeteksi keberadaan virus-virus tersebut.
 Teknik ELISA merupakan uji serologis yang sensitif untuk
banyak virus tanaman.
 Teknik ELISA yang digunakan dalam virologi tanaman
dapat dilakukan secara langsung, yaitu antigen dideteksi
secara langsung dengan antibodi spesifik yang berlabel
enzim.
 Teknik ELISA juga dapat dilakukan secara tidak langsung,
yaitu antigen dideteksi dengan antibodi yang kemudian
dideteksi lagi dengan antibodi spesifik yang berlabel
enzim.
Deteksi dan Diagnosis Virus
Deteksi melalui Hibridisasi Asam Nukleat

 Karena partikel virus adalah RNA atau DNA, maka pelacak


untuk virus adalah segmen-segmen DNA komplementernya.
 Pelacak tersebut mampu mendeteksi dan melekat pada
RNA virus.
 Dengan menggunakan radioaktif atau biotin yang terikat
pada segmen komplementernya, maka proses pelekatan
dapat diamati dan virus dapat dideteksi.
 Nukleotida yang berlabel radioaktif 32P merupakan pelacak
yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi virus yang
kemudian dapat dideteksi dengan autoradiografi.
 Biotin merupakan pelabel enzimatik nonradioaktif. Biotin
akan terikat kuat pada protein yang akan mengikat ke
enzim.
Kultur Jaringan Tanaman

KULTUR HAPLOID

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Tanaman Haploid
 Tanaman haploid adalah tanaman yang mempunyai
jumlah kromosom sama dengan kromosom gamet.
 Tanaman haploid memiliki banyak kegunaan dalam
penelitian genetika dan pemuliaan tanaman, antara
lain: pada keadaan monohaploid semua sifat dapat
ditampilkan (resesif/dominan), pada tingkat haploid
(mono/di) seleksinya jauh lebih mudah dibandingkan
tingkat ploidi yang lebih tinggi, penggandaan
monohaploid menghasilkan tanaman dihaploid
homozizot.
 Penggandaan selanjutnya menghasilkan tetraploid
homozigot, hibridisasi seksual atau somatik tetraploid
x diploid menghasilkan tanaman triploid, kultur haploid
digunakan untuk menghasilkan tanaman super jantan
(asparagus), dan tanaman diploid dan tetraploid dapat
dirilis sebagai kultivar baru.
Tanaman Haploid
 Telah diketahui banyak cara untuk mendapatkan
individu-individu haploid.
 Pada sejumlah species, haploid terjadi secara
spontan.
 Produksi individu haploid dapat dilakukan melalui
seleksi kembar (twin selection), persilangan
dengan species liar, dan melalui teknik in vitro.
 Melalui teknik in vitro, haploid dapat diperoleh
melalui kultur anter, kultur polen, dan kultur ovul
bergantung kepada kemampuan kita untuk
mendapatkan jaringan dengan jumlah kromosom
haploid (n).
Haploid untuk Genetika dan
Pemuliaan Tanaman
 Tanaman haploid dapat digunakan untuk mendeteksi
besarnya interaksi gen, keterkaitan, pendugaan jumlah gen
yang mempengaruhi ciri-ciri kuantitatif dan lokasi
Quantitative Trait Loci atau QTL.
 Pada program pemuliaan tanaman kita dapat
menggandakan jumlah kromosom individu-individu tersebut
dan dengan segera dapat menghasilkan galur-galur
homozigot tanpa membutuhkan 6 – 8 generasi hasil
persilangan sendiri.
 Dengan demikian penggunaan tanaman haploid dapat
mempercepat proses pemuliaan tanaman.
 Berikut ini disajikan contoh program pemuliaan tanaman
Brassica napus.
Haploid untuk Genetika dan
Pemuliaan Tanaman
Pendekatan Konvensional

Tahun 1 Tetua A x Tetua B

Biji F1

Tahun 2 Progeni F2

6 – 8 persilangan sendiri (single seed descent)

Tahun 6 Inbred Homozigot


Haploid untuk Genetika dan
Pemuliaan Tanaman
Pendekatan Kultur Anter

Tahun 1 Tetua A x Tetua B

Anter F1

Tahun 2 Haploid dari Kultur Anter

Perlakuan Penggandaan Kromosom

Tahun 3 Inbred Homozigot


Haploid untuk Genetika dan
Pemuliaan Tanaman
 Dari Brassica napus, sekitar 1 – 3 embrioid dapat
diperoleh dari setiap kultur anter.
 Beberapa genotipe dapat diperoleh lebih dari 190 per
anter. Untuk species tertentu, seperti tembakau, dapat
diperoleh 80 – 100 embrioid dari setiap anternya.
 Untuk sebagian besar species, seperti serealia,
kentang, dan tomat, efisiensinya rendah, hanya sekitar
1 – 5% anter yang terbentuk planlet.
 Pada beberapa species, embriogenesis langsung
terjadi dari polen dalam anter.
 Sedangkan tanaman lain (termasuk tomat), kalus
terbentuk dari polen dan tanaman harus
diregenerasikan dari kalus tersebut.
Haploid untuk Genetika dan
Pemuliaan Tanaman
 Karena kultur anter pertama kali diperoleh dari
kultur Datura innoxia pada tahun 1964 tekniknya
telah banyak digunakan secara luas di seluruh
dunia dalam program pemuliaan tanaman.
 Kultivar-kultivar yang berasal dari kultur anter atau
kultur mikrospora yang telah dirilis meliputi:
Brassica napus, tembakau, padi, gandum, dan
jagung.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Anter
Banyak faktor yang dapat mempengaruhi kemampuan
anter untuk membentuk kalus, embrioid, atau tunas.
1. Fisiologi tanaman donor (fotoperiodisitas, suhu,
status nutrisi)
2. Tahap perkembangan polen
3. Praperlakuan anter/kuncup bunga (dingin, gelap)
4. Komposisi medium basal
5. Keseimbangan fitohormon
6. Densitas plating
7. Lingkungan Kultur (cahaya, fotoperiodisitas, suhu)
8. Genotipe donor (kerapkali ini merupakan faktor yang
paling penting).
Prosedur Kultur Anter

Identifikasi Tahapan Perkembangan Polen

 Pada banyak species tanaman, anter akan baik


untuk dikulturkan apabila polennya uniseluler dan
uninukleat, atau pada saat memasuki mitosis I .
 Dengan demikian, sangatlah penting untuk
menemukan seperti apa bentuk kuncup bunga
pada saat polen telah memasuki fase yang sesuai.
 Pada tanaman tomat, hal ini amat bervariasi dari
ukuran kuncup bunga 3 mm – 6 mm, bergantung
pada kondisi pertumbuhan dan genotipe tanaman
donor.
Prosedur Kultur Anter
Tahapan Perkembangan Polen
Prosedur Kultur Anter
Untuk tujuan pemuliaan tanaman, tanaman donor haruslah hibrid F1
atau generasi awal backcross (BC1, BC2, atau BC3).
1. Ambilah kuncup bunga contoh dari tanaman donor, dengan
panjang berkisar 2 – 8 mm
2. Keluarkan anter dari tiap kuncup bunga
3. Fiksasi anter dalam etanol : asam asetat glasial (3 : 1) selama
kurang lebih satu jam
4. Gantikan dengan larutan HCl 1M pada suhu 60°C selama 15 menit
untuk hidrolisis jaringan
5. Gantikan HCl dengan pelarut Feulgens paling sebentar 30 menit
6. Letakkan anter pada wadah gelas, buka dengan jarum deseksi
untuk mengeluarkan polen
7. Teteskan setetes acetocarmin
8. Amati perkembangan polen di bawah mikroskop
Prosedur Kultur Anter

Sterilisasi permukaan kuncup bunga

1. Pilihlah kuncup bunga pada tahapan yang tepat


2. Cuci dengan etanol 70% selama satu menit
3. Rendam dalam sodium hipoklorit 1% (ditambah 1
tetes Tween-20) selama 15 menit
4. Bilas dengan air destilasi steril sebanyak tiga kali
5. Permukaan luar kuncup bunga sekarang telah
bebas dari kontaminan. Tentunya jaringan di
dalam kuncup bunga akan juga steril. Seluruh
prosedur selanjutnya harus dilakukan dalam
laminar air-flow cabinet, karena jaringan telah
bebas kontaminan
Prosedur Kultur Anter
Kultur Anter untuk Induksi Kalus

Pada seluruh tahapan berikut ini diperlukan kehati-hatian agar tidak


merusak dinding anter yang dapat mengakibatkan hilangnya respon
pertumbuhan polen dan induksi kalus dari dinding anter yang memiliki
jumlah kromosom somatik (Gambar 12.2). Tahapan pekerjaannya
adalah sebagai berikut:
1. Potong dan buka kuncup bunga untuk mengeluarkan pistil dan
anternya
2. Pisahkan anter dari filamennya. Hal ini penting agar filamen tidak
ikut dikulturkan karena filamen merupakan jaringan diploid
3. Letakkan anter dari satu bunga pada media MS yang ditambah NAA
(1 mg/L) dan Kinetin (1mg/L)
4. Seal petridis dengan Parafilm
5. Inkubasikan pada suhu 24/32°C, dengan cahaya 200 mol m-2 s-1
dengan panjang hari 16 jam
Prosedur Kultur Anter
Kultur Anter untuk Induksi Kalus

 Induksi kalus dapat dilihat melalui mikroskop


setelah 21 hari.
 Kalus yang terbentuk dari polen biasanya
berwarna kuning atau putih.
 Sedangkan kalus yang berasal dari filamen
biasanya berwarna hijau.
 Kalus yang berwarna hijau tersebut biasanya bisa
dipotong dan dibuang.
 Pada kondisi ini biasanya akan didapatkan lebih
dari 65% anter membentuk kalus.
 Setelah 40 hari pada media induksi, kalus dapat
ditransfer ke media regenerasi tunas
Prosedur Kultur Anter
Anter Tomat dengan Filamennya
Prosedur Kultur Anter

Regenerasi Tunas dari Kalus

 Untuk regenerasi tunas dari kalus yang


berasal dari anter, jaringan harus ditransfer
dari media induksi kalus ke media regenerasi
tunas dengan sitokinin tinggi dan auksin
rendah atau tanpa auksin.
 Media padat yang mengandung 2 mg/l kinetin
atau BAP dapat mendorong pembentukan
tunas melalui organogenesis.
Prosedur Kultur Anter
Regenerasi Akar pada Tunas

 Setelah tunas muncul dan mencapai ukuran


panjang sekitar 10 mm, maka tunas dapat
ditransfer ke media perangsang induksi akar.
 Tunas dipotong dari kalus dengan pisau/scalpel
dan forcep.
 Kemudian letakkan bagian yang terpotong ke
media solid MS yang tidak mengandung hormon
atau pada media yang ditambah IAA konsentrasi
rendah (0.1 mg/L).
 Regenerasi akar sebaiknya dilakukan pada
tabung reaksi (bukan petridis) agar memberikan
ruang untuk pertumbuhan tunas..
Prosedur Kultur Anter
Identifikasi Tanaman Haploid

 Pada tahap ini diperlukan pengamatan untuk mengindentifikasi


tanaman-tanaman yang haploid.
 Sejumlah tanaman dapat tetap memiliki jumlah kromosom diploid
(2n = 24, untuk tomat), baik karena penggandaan kromosom
secara spontan, jaringan gamet yang nonreduksi, atau tanaman
muncul dari jaringan somatik seperti dinding anter atau filamen.
 Tidak perlu untuk membuang tanaman-tanaman tersebut, karena
mungkin tanaman-tanaman tersebut dihasilkan dari penggandaan
kromosom secara spontan, yang memang diinginkan oleh
program pemuliaan tanaman.
 Tanaman-tanaman haploid yang diperoleh tentunya kita yakini
berasal dari polen.
 Jaringan yang terbaik untuk penghitungan kromosom adalah
ujung akar yang akan dapat segera membelah atau bila tidak bisa
dengan akar, maka digunakan ujung daun muda.
Prosedur Kultur Anter
Uji Progeni

 Jika tanaman memiliki biji, kita dapat menduga bahwa tanaman


tersebut diploid, meskipun pada beberapa kasus ditemukan
aneuploid pada level diploid (terbentuk dari keragaman
gametoklonal).
 Meskipun demikian, kita dapat memastikan bahwa tanaman-tanaman
yang berbiji bukan merupakan tanaman haploid.
 Akan tetapi, kita harus mampu membedakan antara tanaman-
tanaman yang berasal dari jaringan haploid atau yang berasal dari
jaringan somatik.
 Hal ini dapat dilakukan melalui uji progeni. Sebagai contoh, biji
(sekitar 20 biji) dikecambahkan dan ditanam dalam pot di Green
House.
 Tanaman yang berasal dari jaringan gametik adalah tanaman yang
homozigot, sedangkan tanaman yang berasal dari jaringan somatik
adalah tanaman heterozigot.
 Dengan demikian segregasi dapat dilihat dari karakter progeni
melalui pembandingan dengan tanaman induknya.
Kultur Jaringan Tanaman

KULTUR EMBRIO

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Prinsip Dasar Kultur Embrio
 Kultur embrio merupakan isolasi steril dan pertumbuhan
embrio muda atau embrio matang secara in vitro, yang
bertujuan untuk mendapatkan tanaman yang viabel.
 Hannig (1904) adalah ilmuwan yang pertama mendapatkan
tanaman viabel dari embrio Cruciferae secara in vitro.
 Tahun 1924 dilakukan upaya pertama untuk memecah
dormansi embrio secara in vitro
 Tahun 1929 upaya pertama untuk mengisolasi embrio Linum
yang gugur in vivo dan diselamatkan serta tumbuh hingga
matang secara in vitro.
 Tahun 1932, Tuckey berhasil mendapatkan hormon tanaman
dari ribuan embrio yang gugur dari kultivar berbagai stone-
fruit.
Prinsip Dasar Kultur Embrio
Pada prinsipnya ada dua tipe kultur embrio, yaitu:
1. Kultur embrio muda yang berasal dari biji-biji yang
belum matang. Tipe kultur embrio ini terutama
digunakan untuk mencegah keguguran embrio (tahap
awal kematian embrio) dengan tujuan untuk
mendapatkan tanaman viabel. Tipe kultur ini amat sulit,
bukan hanya karena pekerjaan diseksinya, akan tetapi
juga karena kompleknya kebutuhan media nutrisi.
2. Kultur embrio matang yang berasal dari biji-biji yang
matang. Tipe kultur ini relatif mudah dan biasanya
digunakan untuk mengeliminasi penghambatan
perkecambahan biji. Penggunaan media yang
sederhana dengan agar dan gula serta mineral pada
tipe kultur ini umumnya sudah mencukupi.
Prinsip Dasar Kultur Embrio
Jika beberapa embrio muda in vitro dan in vivo di
bandingkan dimulai dari tahap globular, maka embrio in
vitro biasanya memiliki:
1. Pertumbuhanya lebih besar dan berbentuk pear
2. Ekpresi morfogenetik dihambat, tahap globular lebih
lama
3. Pada awalnya hanya terbentuk satu kotiledon (pada
tanaman dikotil), kemudian muncul dua kotiledon
secara simultan
4. Kemungkinan menunjukkan perkembangan
polikotiledon (lebih dari dua kotiledon) yang sangat
jarang terjadi secara in vivo
Embrio yang diseleksi secara in vitro biasanya
menunjukkan perkembangan yang cepat karena hilangnya
inhibitor bila kulit biji dihilangkan.
Teknik Kultur Embrio
 Kultur embrio biasanya tidak akan menghadapi
masalah desinfeksi.
 Biji yang telah matang didesinfeksi secara eksternal,
kemudian embrio dikeluarkan setelah kulit biji
dibuka.
 Diseksi embrio menghasilkan lebih banyak masalah.
Mendeseksi embrio yang berukuran besar dapat
dilakukan tanpa menggunakan mikroskop.
 Akan tetapi, untuk embrio berukuran kecil perlu
menggunakan mikroskop dengan sumber cahaya
yang dingin.
 Selama tahapan deseksi diperlukan jarum inokulasi
dan pisau yang khusus. Perlu kehati-hatian pada
saat memotong kulit biji, karena akan dengan mudah
merusak embrio.
Teknik Kultur Embrio
Beberapa contoh prosedur isolasi embrio adalah sebagai
berikut:
1. Isolasi embrio cherry. Biji dikeluarkan dari buah,
kemudian biji dimasukkan ke dalam wadah air untuk
melihat apakah biji tanaman memiliki embrio yang baik
atau tidak. Bila biji tenggelam, maka diduga embrionya
baik. Biji tersebut kemudian didesinfeksi. Biji cherry steril
kemudian dipecah dan embrio akan terlihat. Embrio
dikeluarkan dengan bantuan forcep dan diinokulasikan ke
media padat.
2. Tanaman barley. Buah dicuci dengan air steril dan
diletakkan di petridis dengan bagian rachilla di bawah
serta bagian lemma di atas. Setelah lemma, dinding buah,
dan kulit biji dibuang, maka embrio akan terlihat. Embrio
dipotong dengan pisau dan diinokulasikan ke media
Kultur Ovari/Ovul

 Karena embrio kadang-kadang sulit dideseksi,


maka kultur ovari dan kultur ovul dapat digunakan.
 Kultur ovari dan kultur ovul lebih sesuai karena:
1. Diseksi embrio seringkali sulit (embrio mudah
sekali rusak selama isolasi) dan butuh banyak
waktu serta personalia pelaksana yang betul-
betul terlatih.
2. Media yang dibutuhkan untuk kultur embrio
jauh lebih kompleks dibandingkan dengan
media yang dibutuhkan untuk kultur ovari atau
kultur ovul
Kultur Ovari/Ovul

 Pada tahun 1967, Braak berhasil mengkulturkan


ovul tanaman tomat, Rhododendron, tulip, selada,
lili, bawang, Hibiscus, carnation, dan gerbera.
Bajaj dan Bopp (1971) melaporkan hasil
penelitiannya dengan tanaman Hevea, Papaver,
dan Nicotiana.
 Akhir-akhir ini dikenal istilah kultur ovul embrio
yang diintroduksikan selain kultur ovul, kultur
ovari, dan kultur ovul terbuahi. Kultur ovul menjadi
tidak berarti apabila endosperma
mengekskresikan inhibitor bagi perkembangan
embrio
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Genotipe

 Pada beberapa species tanaman, embrionya


mudah tumbuh dan pada beberapa species lainnya
sulit tumbuh.
 Bahkan terdapat perbedaan respon di antara
kultivar dari species yang sama.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Tahap Perkembangan Embrio pada Waktu Isolasi

 Umumnya embrio yang berukuran amat kecil sulit untuk


tumbuh secara in vitro.
 Semakin embrio berkembang secara in vivo, maka akan
semakin mudah untuk dikulturkan secara in vitro.
 Kadang-kadang dengan penggunaan teknik tertentu
embrio yang berukuran sangat kecil dapat dikulturkan,
antara lain: dengan mengkulturkan secara bersamaan
antara endosperma atau antara sepotong jaringan
hipokotil dengan embrio atau embrio muda
ditransplantasikan ke endosperma biji normal dari
species tanaman yang sama.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Kondisi Pertumbuhan Tanaman Induk

 Biasanya tanaman induk ditumbuhkan di Green House,


meskipun kadang-kadang digunakan bahan tanam yang
diambil dari lapang, misalnya barley yang ditanam di lapang
dipotong kemudian ditransfer ke larutan nutrisi yang diberi
aerasi dalam fitotron.
 Peningkatan pertumbuhan tanaman induk pada kondisi
terkontrol umumnya menghasilkan perkembangan
endosperma yang baik, dengan demikian akan dihasilkan
pertumbuhan embrio yang baik.
 Beberapa tanaman (inflorescences) kadang-kadang perlu
diperlakukan dengan Giberelin sebelum embrio diisolasi. Hal
tersebut akan meningkatkan ukuran embrio sehingga mudah
untuk menanganinya.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Komposisi Media Nutrisi

 Embrio muda membutuhkan komposisi media yang lebih kritis


dibandingkan dengan embrio matang. Akan tetapi, baik embrio muda
atau embrio matang membutuhkan elemen makro dan elemen mikro
serta gula. Biasanya digunakan media solid dengan pH 5 - 6. Untuk
kultur embrio banyak digunakan mineral yang berbeda.
 Gula amat penting sebagai sumber energi, meskipun juga berperan
menurunkan (negatif) potensial osmotikum media nutrisi, khususnya
untuk embrio muda. Embrio matang umumnya ditumbuhkan pada 2 -
3% sakarosa, sedangkan embrio muda lebih baik ditanam pada
konsentrasi sukrosa yang tinggi (8 - 12%). Kebutuhan gula berkurang
dengan semakin besarnya ukuran embrio.
 Konsentrasi agar yang digunakan biasanya adalah 0.6 - 0.8%.
Konsentrasi agar yang tinggi mengakibatkan penghambatan
pertumbuhan. Kadang-kadang keberhasilan pertumbuhan diperoleh
pada media cair.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Komposisi Media Nutrisi

 Auksin dan sitokinin umumnya tidak digunakan


untuk kultur embrio, karena kerapkali menginduksi
pembentukan kalus.
 Kadang-kadang giberelin memiliki efek promotif,
khususnya bila berkaitan dengan dormansi.
 Pada beberapa kasus, kultur embrio memerlukan
tambahan vitamin.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Komposisi Media Nutrisi

 Meskipun saat ini media sintetik yang digunakan, akan tetapi


beberapa referensi menyatakan perlunya penambahan
senyawa aditif alamiah seperti air kelapa, casein
hydrolysate, dan ekstrak malt.
 Senyawa kompleks tersebut sesuai untuk kultur embrio
muda. Diduga bahwa asam-asam amino tertentu yang
terkandung di dalamnya penting sebagai sumber nitrogen.
Terlihat bahwa glutamin dibutuhkan untuk pertumbuhan
embrio muda.
 Karena kebutuhan nutrisi berubah selama pertumbuhan dan
perkembangan embrio, maka kerapkali diperlukan subkultur.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Oksigen

 Oksigen merupakan faktor yang penting untuk


pertumbuhan kultur.
 Kerapkali kebutuhan oksigen pada kultur embrio lebih
tinggi dibandingkan konsentrasi normal oksigen udara
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Cahaya

 Kadang-kadang embrio yang diisolasi membutuhkan


kondisi gelap selama 7 - 14 hari.
 Setelah periode tersebut dapat dipindahkan ke kondisi
terang untuk pembentukan klorofil.
Faktor yang Mempengaruhi
Keberhasilan Kultur Embrio
Suhu

 Suhu optimum bergantung pada species tanaman yang


digunakan.
 Normalnya dibutuhkan suhu yang tinggi untuk
pertumbuhan (22-28°C), meskipun beberapa species,
seperti lili membutuhkan suhu rendah (17°C).
 Suhu yang rendah (4°C) penting untuk mematahkan
dormansi
Aplikasi Praktis
1.Eliminasi inhibisi perkecambahan biji. Pada beberapa species,
perkecambahan secara in vivo amat sulit terjadi. Dalam hal ini
kultur embrio sangat dibutuhkan, seperti untuk tanaman
Colacasia esculenta, Musa balbisiana, dan Pinus armandie x P.
Koraiensis.
2.Perkecambahan biji parasit obligat tanpa inang secara in vivo
tidak mungkin terjadi, akan tetapi dapat dilakukan melalui
kultur embrio.
3.Memperpendek siklus pemuliaan. Banyak species yang
menunjukkan dormansi biji yang disebabkan oleh kulit biji atau
oleh endospermanya. Dengan menghilangkan bagian-bagian
tersebut, maka biji dapat segera berkecambah. Kadang-
kadang biji sulit mengambil air dan oksigen. Pada kasus ini,
kultur embrio dapat mempercepat perkecambahan. Perlu
diingat bahwa kultur embrio muda dapat sangat
memperpendek siklus pemuliaan.
Aplikasi Praktis
4.Produksi tanaman haploid. Persilangan antara Hordeum
vulgare x H. bulbosum dapat terjadi, akan tetapi
kromosom H. bulbosum dieliminasi. Hasilnya adalah
embrio haploid H. vulgare yang hanya viabel melalui
kultur embrio. Setelah penggandaan kromosom akan
diperoleh H. vulgare homozigot.
5.Pencegahan aborsi embrio tanaman stone-fruits.
Persilangan tanaman stone-fruits (peach, cherry, apricot,
plum) menghasilkan aborsi embrio muda. Hal ini terjadi
karena transpor air dan nutrisi ke embrio muda kerapkali
terhenti lebih awal, sehingga embrio gugur (aborsi).
Dengan demikian, persilangan antara tanaman stone-
fruits menjadi tidak mungkin. Penggunaan kultur embrio
dalam hal ini merupakan satu-satunya cara.\
Aplikasi Praktis
6.Pencegahan aborsi embrio karena inkompatibilitas.
Persilangan interspesifik, intergenerik, serta persilangan
antara diploid dengan tetraploid menghasilkan perkembangan
endosperma yang buruk atau tidak ada sama sekali. Hal ini
karena embrionya aborsi. Kultur embrio kerapkali digunakan
setelah dilakukan persilangan interspesifik pada tanaman
Phaseolus, lili, flax, kapas, tomat, padi dan barley. Contoh
kultur embrio yang baik adalah hasil persilangan Hordeum x
Secale dan Triticum x Secale.
7.Perbanyakan vegetatif. Pada tanaman-tanaman seperti
Gramineae dan Coniferae, embrio kerapkali digunakan sebagai
bahan awal untuk perbanyakan vegetatif. Embrio-embrio
tersebut sangat responsif karena masih juvenil.
Organogenesis Gramineae berlangsung relatif mudah dari
jaringan kalus juvenil. Kloning Coniferae melalui kalus muda
yang berasal dari embrio muda serta pembentukan tunas
aksilar juga dapat berlangsung dengan mudah.
Kultur Embrio Kelapa
 Tanaman kelapa (Cocos nucifera) merupakan salah satu
tanaman penting di negara-negara tropik. Karena kelapa
tidak menghasilkan anakan, maka satu-satunya bahan
perbanyakan adalah bijinya (buahnya).
 Tanaman kelapa sangat heterozigot, berumur panjang,
dan fase juvenilnya panjang. Sehingga pemuliaan kelapa
amatlah sukar dan memerlukan proses yang lama.
 Perbanyakan secara vegetatif melalui teknik kultur
jaringan sekaligus peningkatan kualitas klon dapat
dilakukan dengan cepat.
 Salah satu strategi pemuliaan kelapa adalah
menghasilkan hibrid yang berproduksi tinggi atau
mengklonkan plasmanutfah elit seperti kelapa Kopyor.
Kultur Jaringan Tanaman

METABOLIT
SEKUNDER

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Produk/Metabolit Sekunder
 Banyak tanaman yang memiliki kandungan
senyawa kimia yang secara tidak langsung
berhubungan dengan proses-proses metabolisme
utama (primer).
 Senyawa-senyawa kimia itu biasanya disebut
metabolit sekunder atau produk sekunder.
 Metabolit sekunder biasanya dihasilkan oleh famili
atau genus tanaman tertentu.
 Fungsi metabolit sekunder dalam tanaman itu
sendiri tidak begitu jelas.
Fungsi Metabolit Sekunder
Beberapa fungsi metabolit sekunder bagi tanaman
adalah:
1. Mempunyai peran dalam pengaturan
pertumbuhan dan perkembangan tanaman
2. Memberi perlindungan terhadap tanaman untuk
melawan jamur dan bakteri
3. Membuat tanaman tidak enak untuk dimakan
hewan
4. Bertindak sebagai repelan insek atau insektisida
Produk/Metabolit Sekunder
 Kultur mikroorganisme (misalnya Penicillin) telah lama
menjadi industri yang digunakan untuk mendapatkan
senyawa tertentu, seperti penicillin dan streptomycin
yang penting untuk bahan baku obat-obatan (antibiotika).
 Tanaman tingkat tinggi juga merupakan sumber penting
berbagai jenis senyawa kimia.
 Secara konvensional tanaman dibudidayakan dan
kemudian senyawa aktifnya diekstrak.
 Banyak metabolit sekunder yang memiliki nilai ekonomis
tinggi.
 Metabolit sekunder yang diekstrak dari tanaman dapat
dipergunakan untuk berbagai keperluan, antara lain:
aditif dan aroma makanan, vitamin, obat-obatan,
insektisida, dan parfum
Produk/Metabolit Sekunder
Produksi bahan tanaman secara konvensional
memiliki banyak kendala. Untuk itu diperlukan cara
lain untuk memperoleh senyawa tersebut. Kendala
yang dihadapi dalam budidaya konvensional dalam
hal ini adalah:
1. Budidaya in vivo bergantung musim, iklim, hama,
dan penyakit
2. Sumber-sumber alam menjadi amat berkurang
3. Kendala teknik dan ekonomi
4. Kendala tenaga kerja yang mahal
5. Ketidakstabilan politik di negara produsen
Produk/Metabolit Sekunder
 Berdasarkan permasalahan tersebut di atas,
maka diperlukan cara lain untuk mendapatkan
senyawa yang kita kehendaki, antara lain melalui
kultur sel suspensi.
 Hal ini dapat dilakukan melalui akumulasi dalam
sel atau melalui pelepasan senyawa tersebut ke
dalam media nutrisi.
 Terminologi metabolit sekunder dipergunakan
untuk menyatakan senyawa yang diproduksi oleh
sel tanaman in vivo atau in vitro yang secara
langsung tidak dibutuhkan oleh tanaman itu
sendiri
Produk/Metabolit Sekunder

Ada dua pendekatan yang dapat dipergunakan


untuk memproduksi metabolit sekunder, yaitu:

1. Pertumbuhan yang cepat kultur suspensi pada


volume yang besar yang diikuti manipulasi untuk
produksi metabolit sekunder
2. Pertumbuhan yang diikuti dengan imobilisasi sel-
sel yang digunakan untuk produksi senyawa
dalam periode yang panjang.
Aplikasi Industrial
 Ada beberapa alasan mengapa kemajuan industri
kultur sel untuk memproduksi metabolit sekunder
berjalan lambat.
 Kendala tersebut antara lain adalah relatif
lambatnya laju pertumbuhan kultur dan
kandungan senyawa yang di hasilkan lebih rendah
dibandingkan dengan yang di hasilkan secara in
vivo.
 Apabila kultur sel akan di pergunakan secara
komersial, maka produksinya harus paling tidak
seimbang atau kalau bisa lebih banyak dibanding
yang di peroleh secara in vivo.
Tanaman dan Metaboli Sekunder
yang Dihasilkannya

No Jenis Tanaman Metabolit Sekunder


1 Atropa belladona Atropin (Alkaloid)
2 Cinchona ledgeriana Quinine
3 Datura spp. Hyoscyanine dan Scopolamine
4 Digitalis spp. Digoxin
5 Dioscorea spp. Diosgenin
6 Panax ginseng Ginseng, Saponin
7 Solanum spp. Polyamine dan Alkaloid (Solanidine)
8 Trigonella foenum-graecum Sapogenin steroid
Aplikasi Industrial
Tidak diragukan lagi bahwa biosintesis senyawa in vitro menjanjikan
banyak harapan, meskipun cukup banyak kendala yang perlu di
pecahkan sebelum teknik tersebut di terapkan dalam skala yang luas.

Kendala tersebut meliputi


1. Sel-sel tanaman memiliki waktu pengandaan yang amat lama (20 jam)
bila di bandingkan mikroorganisme (1 jam). Ini berarti sel-sel tanaman
memproduksi biomasa dan metabolit yang relatif sedikit
2. Bila produksi metabolit sekunder berlangsung di organ-organ
tertentu.
3. Laju produksi umumnya sangat rendah dibandingkan tanaman in vivo.
4. Kultur sel suspensi secara genetik tidak stabil, dengan adanya
mutasi produksi senyawa sering kali sangat rendah dibandingkan
pada awal kultur.
5. Untuk mecegah pembentukan kelompok sel di perlukan pengadukan
yang kuat, hal ini seringkali merusak sel.
6. Pengunaan gula dengan konsentrasi yang tinggi pada media nutrisi
akan meningkatkan biaya produksi.
7. Masih di perlukan penelitian untuk merancang bioreaktor yang baru .
Aplikasi Industrial

 Masih cukup banyak kendala yang di hadapi


dalam upaya memproduksi metabolit sekunder.
Hal ini dapat di lihat dari masih sedikitnya
perusahaan yang bergerak di bidang tersebut.
 Salah satunya adalah Mitsui Petrochemical
Industries yang telah memproduksi secara
komersial Shikonin (senyawa pewarna dan
antibiotika) yang bernilai $ US 4000 per kg dari
sel tanaman Lithospermum erythorhizon dalam
fermentor berukuran 750 liter.
Kultur Jaringan Tanaman

KONSERVASI
IN VITRO

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Plasmanutfah
 Plasmanutfah tumbuhan mempunyai fungsi
dan peran yang penting bagi kehidupan
manusia.
 Karena berbagai faktor, seperti perusakan
lingkungan hidup dan serangan penyakit,
secara berangsur keanekaragaman
plasmanutfah semakin berkurang.
 Kehilangan sumber suatu plamanutfah akan
sangat merugikan terutama bagi para pemulia
tanaman yang ingin merakit varietas baru
untuk peningkatan kualitas tanaman di
kemudian hari.
Plasmanutfah
 Dalam upaya untuk menyelamatkan dan
mempertahankan keanekaragaman plasmanutfah
tumbuhan tersebut perlu dilakukan upaya konservasi.
 Secara konvensional, upaya konservasi plasmanutfah
dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu: 1) in situ (di
habitat aslinya) dan 2) ex situ (di luar habitat aslinya,
seperti kebun raya dan kebun koleksi).
 Plasmanutfah tanaman dapat juga disimpan dalam
bentuk benih/biji.
 Hanya saja, ada beberapa species tanaman, seperti
kakao, mangga, kelapa, dan karet, yang tidak dapat
disimpan dengan cara tersebut karena bijinya bersifat
rekalsitran.
 Demikian pula, beberapa tanaman yang diperbanyak
secara vegetatif, seperti kentang dan ubi kayu
Metode Konservasi In Vitro
 Sistem koleksi dan konservasi plasmanutfah secara
konvensional memiliki kendala yang cukup besar, seperti
memakan banyak waktu, tenaga, biaya, dan tempat.
 Untuk itu diperlukan upaya konservasi plasmanutfah
melalui metode selain metode konvensional.
 Metode koleksi dan konservasi plasmanutfah dapat
dilakukan melalui metode in vitro.
 Imelda dan Soetisno (1992) membagi konservasi in vitro
berdasarkan jenis tanaman, yaitu: 1) kelompok yang
diperbanyak dengan biji (berbiji rekalsitran), seperti
kelapa, kakao, rambutan, mangga, dan alpukat dan 2)
kelompok yang diperbanyak secara vegetatif, meliputi
tanaman yang tidak berbiji (steril), hanya berbiji pada saat
tertentu, biji heterozigot, dan tanaman umbi-umbian,
seperti ubi kayu, talas, pisang, dan kentang.
Metode Konservasi In Vitro
 Beberapa keunggulan metode in vitro terutama
untuk tanaman tahunan adalah:

1. keberadaannya tidak bergantung musim,


sewaktu-waktu dapat diperbanyak dengan
cepat,
2. bahan tanaman bebas penyakit, sehingga
memudahkan pertukaran plasmanutfah antar
negara,
3. kebutuhan ruang tumbuh relatif kecil.
Metode Konservasi In Vitro
 Tujuan utama konservasi in vitro adalah
mereduksi laju pertumbuhan yang dilakukan
dengan berbagai manipulasi.
 Metode yang dikembangkan untuk tujuan
tersebut adalah penyimpanan pada suhu
rendah diikuti dengan pengurangan
pencahayaan.
 Metode ini merupakan metode yang paling
praktis untuk kebanyakan tanaman.
 Untuk meningkatkan interval waktu subkultur,
perlakuan suhu rendah kerapkali
dikombinasikan dengan zat penghambat
tumbuh, seperti asam absisik.
Metode Konservasi In Vitro
 Metode lain seperti penggunaan minyak
mineral, menambah bahan osmotika,
menurunkan tekanan atmosfir, dan dehidrasi
jaringan partial juga telah dikembangkan.
 Metode-metode tersebut di atas tidak dapat
dilakukan untuk konsevasi jangka panjang.
 Untuk tujuan jangka panjang metode yang
dapat digunakan adalah kriopreservasi.
Metode Konservasi In Vitro
 Seringkali orang cemas akan punahnya plasmanutfah
yang berharga atau suatu tanaman langka.
 Tidak ada istilah langka bagi orang yang bekerja dalam
bidang bioteknologi, karena sekali teknik perbanyakan
in vitro sudah diperolehi, maka tanaman tersebut dapat
diperbanyak dalam jumlah yang besar.
 Ada baiknya Indonesia mencontoh negara tetangga.
Untuk mencegah hilangnya tanaman langka, mereka
memperbanyak tanaman tersebut dan dijual di dalam
dan luar negeri. Malaysia memperbanyak jenis
Phalaenopsis dan Paphioluiopedium yang jarang
terdapat dan diekspor ke Jepang, Jerman, dan Belanda.
Stabilitas In Vitro
Ada beberapa faktor yang perlu diperhatikan
apabila ingin melakukan konservasi in vitro,
yaitu:
1) selama waktu konservasi bahan tanaman
tidak kehilangan viabilitasnya,
2) tidak ada deteriorasi/ kerusakan kualitas, dan
3) tidak mengalami perubahan genetik.
Stabilitas In Vitro
 Metode yang dapat digunakan untuk menguji
kualitas bahan tanam yang telah disimpan
bergantung pada macam bahan tanam yang
disimpan.
 Bahan tanam berupa tunas, evaluasi dapat
dilakukan dengan melihat respon bahan
tanam pada media normal.
 Materi berupa sel dapat menggunakan
staining dengan fluorescein diacetate (FDA)
atau dengan menggunakan metode triphenyl
tetrazolium (TTC).
Propagul Konservasi In Vitro
 Berbagai bahan tanaman dapat digunakan untuk tujuan
koleksi dan konservasi in vitro.
 Hal ini bergantung pada sifat yang dimiliki oleh tanaman
yang akan dibiakkan.
 Bahan tanam yang dapat digunakan antara lain:
embrio, kalus, biji, mata tunas, tunas pucuk, dan
meristem.
 Dari segi kepraktisan, kultur tunas merupakan bahan
tanaman yang ideal, baik untuk tujuan konservasi
maupun untuk tujuan pertukaran plasmanutfah.
 Bahan tanam tersebut secara genetik lebih stabil, dapat
dengan mudah untuk tumbuh, dan merupakan bahan
perbanyakan vegetatif secara cepat
Faktor Lingkungan
Suhu (Temperatur)
 Keadaan lingkungan fisik pada tempat penyimpanan
plasmanutfah dengan cara in vitro akan mempengaruhi
keberhasilan konservasi in vitro.
 Khususnya pengaturan suhu baik untuk penyimpanan
jangka pendek maupun jangka panjang harus diatur
sesuai dengan jenis dan bagian/organ tanamannya.
 Untuk penyimpanan jangka pendek tanaman tropik
menghendaki suhu sekitar 15° - 20°C. Sedangkan
untuk tanaman subtropik menghendaki suhu sekitar 0°
- 6°C.
 Untuk penyimpanan jangka panjang dikenal dengan
istilah kriopreservasi yang mencerminkan penggunaan
suhu sangat rendah sekali, yaitu - 196°C pada nitrogen
cair.
Kriopreservasi
 Kriopreservasi atau preservasi beku merupakan satu-satunya
metode untuk konservasi plasmanutfah jangka panjang
sekaligus meminimalkan kemungkinan terjadinya perubahan
genetik.
 Kriopreservasi dilakukan pada suhu yang sangat rendah (-
196°C) dalam nitrogen cair.
 Pada suhu yang sangat rendah sebagian besar reaksi-reaksi
kimia tidak akan berlangsung karena tingkat energi yang
tersedia tidak cukup untuk menggerakkan molekul-molekul
untuk menyelesaikan tahapan reaksinya.
 Akan tetapi, beberapa reaksi kimia, seperti pembentukan
radikal bebas dan kerusakan makromolekul yang disebabkan
ionisasi radiasi masih tetap berlangsung.
 Apabila kerusakan-kerusakan itu terjadi, maka sifatnya
kumulatif karena enzim-enzim yang dibutuhkan untuk
memperbaiki kerusakan tersebut tidak dapat berfungsi pada
suhu rendah.
Kriopreservasi
 Teknik kriopreservasi telah sangat baik diterapkan
pada bidang peternakan, seperti penyimpanan
sperma ternak dalam nitrogen cair untuk keperluan
inseminasi buatan.
 Pada awal tahun 1970 baru dilaporkan adanya
penyimpanan tanaman dalam nitrogen cair.
 Sakai dan Sugawara (1972) menggambarkan
regenerasi Populus euramericana dari kultur yang
disimpan pada nitrogen cair.
 Mulai saat itu berbagai species tanaman telah
berhasil disimpan melalui kriopreservasi
Kriopreservasi
Agar regenerasi tanaman berhasil dilakukan, maka
sangat penting untuk mengembangkan kondisi
khusus dalam rangka mempersiapkan proses
pembekuan, selama pembekuan, dan proses
pencairan serta selama periode penyembuhan/
perbaikan.

Langhah-langkah yang perlu dilakukan adalah:


1. Isolasi aseptik material kultur yang akan disimpan
secara in vitro, contohnya adalah meristem lateral
2. Pengkondisian dingin terhadap meristem. Tahap
ini merupakan tahap optional
3. Kultur meristem pada media kultur jaringan yang
ditambahkan krioprotektan selama periode
tertentu
Kriopreservasi
4. Penambahan senyawa krioprotektif sesaat sebelum
pembekuan. Senyawa kimia tersebut mencegah
kerusakan meristem dari kristal es
5. Pengontrolan pendinginan dan pembekuan meristem.
Tahap ini merupakan tahap yang paling penting.
Pendinginan dapat dilakukan dengan lambat atau cepat
6. Penyimpanan meristem dalam nitrogen cair
7. Pencairan cepat meristem untuk mencegah kerusakan
karena kristal es
8. Penghilangan senyawa krioprotektif
9. Penyembuhan-penyegaran sel-sel yang telah dicairkan
agar kembali ke pertumbuhan normal. Meristem siap
direkulturkan untuk diregenerasikan menjadi tanaman.
Kriopreservasi
Prapertumbuhan

 Status fisiologi jaringan yang dibekukan suhu sangat rendah


mempengaruhi tahapan penyembuhan.
 Faktor-faktor yang perlu diperhatikan meliputi tahap siklus
pertumbuhan kultur pada saat pembekuan dilakukan, ukuran
komponen sel, dan kondisi kultur.
 Tahap siklus kultur pada saat pertumbuhan pesat adalah yang
paling dikehendaki. Pada tahap ini, sel-sel memiliki vakuola
yang relatif kecil, sehingga memiliki kandungan air yang
rendah. Kondisi tersebut meminimalkan kerusakan karena
pembentukan kristal es.
 Pertumbuhan kultur atau tanaman induk dapat dilakukan pada
suhu yang direndahkan/diturunkan. Hal ini merupakan salah
satu bentuk perlakuan penguatan terhadap kondisi dingin.
 Perlakuan penguatan dingin diikuti penurunan suhu hingga -
40°C secara nyata meningkatkan daya hidup seluruh species
yang diuji.
Kriopreservasi
Krioprotektan

 Sangat sedikit bahan-bahan yang dapat dibekukan hingga di bawah


suhu nol tanpa mengakibatkan kerusakan sel-selnya. Akan tetapi,
penambahan krioprotektan ke dalam kultur sesaat sebelum pembekuan
memfasilitasi keberhasilan pembekuan dan pencairan.
 Krioprotektan menurunkan laju difusi air dari sel dan dengan demikian
menurunkan ukuran dan pertumbuhan kristal es. Krioprotektan juga
menurunkan titik beku kandungan intraseluler, sehingga sel-sel yang
ditempatkan pada suhu ultra dingin tidak akan rusak membran selnya
atau kandungan intraselulernya.
 Cukup banyak senyawa kimia yang memiliki ciri krioprotektif. Dimethyl
sulphoxide (DSMO) merupakan krioprotektan yang paling umum
digunakan karena penetrasinya cepat sehingga menurunkan laju
pertumbuhan kristal es.
 Namun karena DMSO seringkali bersifat toksik, maka gliserol atau prolin
juga dapat digunakan. Gliserol dan prolin tidak masuk kedalam sel,
akan tetapi meningkatkan viskositas larutan ekstraseluler, sehingga
mereduksi laju pendinginan.
Kriopreservasi
Pembekuan

 Pendinginan/pembekuan dapat dilakukan secara cepat atau lambat.


Pembekuan secara cepat mengakibatkan velositas pembekuan
menjadi sangat cepat, sehingga tidak cukup waktu untuk
mengeluarkan air dari intraseluler dalam jumlah banyak.
Konsekuensinya, kristal es akan terbentuk di dalam sel.
 Pada kebanyakan materi, teknik pembekuan cepat tidak
memberikan hasil yang baik, untuk itu metode pembekuan lambat
dapat digunakan.
 Pada pembekuan lambat tersedia waktu yang cukup agar air
berdifusi ke luar sel. Melalui dehidrasi sel, es intraseluler tidak
dapat terbentuk bila ditransfer ke nitrogen cair.
 Akan tetapi, jika pembekuan dilakukan terlalu lambat, maka sel akan
mengalami dehidrasi yang berlebihan dan mengakibatkan sel mati.
Berdasarkan Withers (1984) keberhasilan kriopreservasi dapat
dilakukan dengan cara pembekuan lambat, yaitu 0.5 - 2°C per menit.
Kriopreservasi
Pencairan

 Kultur yang telah dibekukan secara lambat


dapat dicairkan secra lambat juga tanpa
kehilangan viabilitasnya.
 Hal ini dapat dilakukan dengan menempatkan
kultur pada suhu ruang.
 Akan tetapi, pada banyak materi pencairan
dengan cepat dengan cara meletakkan kultur
pada wadah air dapat mencegah kerusakan
akibat rekristalisasi es.
Kriopreservasi
Penghilangan Krioprotektan/Penyembuhan

 Penghilangan krioprotektan bergantung pada


jenis krioprotektan yang digunakan.
 DMSO dan gliserol merupakan inhibitor
pertumbuhan tanaman kultur jaringan, sehingga
krioprotektan tersebut harus dihilangkan.
 Umumnya waktu penyembuhan dilakukan pada
media semicair dengan komposisi media standar.
 Kadang-kadang diperlukan penambahan arang
aktif untuk mengadsorpsi toksin yang dilepaskan
oleh sel-sel yang rusak.
Kriopreservasi
Uji Viabilitas

 Viabilitas dapat diperkirakan melalui kemampuan


jaringan yang telah dicairkan untuk tumbuh atau
dapat diduga dengan teknik staining (pewarnaan).
 Staining dengan Fluorescein diacetate dan Evan’s
Blue merupakan dua teknik yang dapat dilakukan
dengan cepat, sedangkan staining dengan
triphenyl-terazolium chloride (TTC) membutuhkan
inkubasi semalam.
 Viabilitas juga dapat diperkirakan dengan penduga
variabel biomassa, seperti volume sel atau bobot
kering.
Kultur Jaringan Tanaman

HIBRIDISASI SOMATIK
(FUSI PROTOPLAS)

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Fusi Protoplas

 Protoplas adalah sel tanpa dinding sel


 Protoplas dapat saling bergabung (fusi),
membentuk hibrida somatik bahkan pada tanaman
yang inkompatibel
 Hibrida protoplas kemudian diregenerasikan
melalui kultur jaringan menjadi tanaman lengkap
 Boccoflower adalah hibrida antara broccoli dan
cauliflower.
Fusi Protoplas

PROTOPLAS = sel tanpa dinding sel, sel telanjang,


FUSI = persatuan se-sel telanjang:

Protoplas + protoplas

Protoplas + subprotoplas

Subprotoplas + subprotoplas

Protoplas + mikroprotoplas
4 Jenis Subprotoplas

Sitoplasma (tanpa inti)

Karioplas (tanpa sitoplasma)

Mitokondria

Kloroplas
Fusi Protoplas
Mengatasi keterbatasan hibridisasi seksual
(penyilangan) karena dapat mengadakan
hibridisasi pada:

Tanaman yang tidak berbunga

Tanaman steril jantan

Tanaman yang inkompatibilitas

Introgresi gen sitoplasma (mt-DNA, Cp-DNA)


Fusi Protoplas

 Fusi protoplas dilakukan untuk


menggabungkan spesies yang ingin
“disilangkan”
 Proses fusi dapat dilakukan dengan cara
 Osmotikum, aliran listrik, virus
 Meregenerasikan hibrida hasil fusi
 Mengandung genom kedua organisme
Development of hybrid plants through
the fusion of somatic protoplasts of two
different plant species/varieties is called
somatic hybridization
Somatic hybridization technique

1. isolation of protoplast

2. Fusion of the protoplasts of desired species/varieties

3. Identification and Selection of somatic hybrid cells

4. Culture of the hybrid cells

5. Regeneration of hybrid plants


Isolation of Protoplast
(Separartion of protoplasts from plant tissue)

1. Mechanical Method 2. Enzymatic Method


1. Mechanical Method
Cells Plasmolysis
Plant Tissue

Microscope Observation of cells

Release of protoplasm
Cutting cell wall with knife

Collection of protoplasm
1. Mechanical Method

 Used for vacuolated cells like onion bulb


scale, radish and beet root tissues
 Low yield of protoplast
 Laborious and tedious process
 Low protoplast viability
Enzymatic Method
Leaf sterlization, removal of
epidermis

Plasmolysed Plasmolysed
cells cells

Pectinase +cellulase Pectinase

Release of Protoplasm
Protoplasm released released
isolated cells
cellulase

Isolated
Protoplasm
Enzymatic Method

 Used for variety of tissues and organs


including leaves, petioles, fruits, roots,
coleoptiles, hypocotyls, stem, shoot apices,
embryo microspores
 Mesophyll tissue - most suitable source
 High yield of protoplast
 Easy to perform
 More protoplast viability
Protoplast Fusion
(Fusion of protoplasts of two different genomes)

1. Spontaneous Fusion 2. Induced Fusion

Chemofusion Mechanical
Intraspecific Intergeneric Electrofusion
Fusion
Spontaneous Fusion
 Protoplast fuse spontaneously during
isolation process mainly due to physical
contact
Induced Fusion
 Chemofusion- fusion induced by chemicals

• Types of fusogens
• PEG
• NaNo3
• Ca 2+ ions
• Polyvinyl alcohol
Induced Fusion
 Mechanical Fusion- Physical fusion of
protoplasts under microscope by using
micromanipulator and perfusion micropipette
 Electrofusion- Fusion induced by electrical
stimulation
• Pearl chain of protoplasts is formed by low strength
electric field (10kv m-1)
• Fusion of protoplasts of pearl chain is induced by the
application of high strength electric field (100kv m-1) for
few microseco
Identification and Selection of somatic
hybrid cells
 Hybrid identification- Based on difference
between the parental cells and hybrid cell
with respect to
• Pigmentation
• Cytoplasmic markers
• Fluorochromes like FITC (fluoroscein isothiocyanate) and
RITC (Rhodamine isothiocyanate) are used for labelling of
hybrid cells
• Presence of chloroplast
• Nuclear staining
• Heterokaryon is stained by carbol-fuschin, aceto-carmine
or aceto-orcein stain
Hybrid Selection
(Several markers are used )

• Genetic complementation
• Phytotoxins
• Specific amino acid
• Auxin autotrophy
• Antibiotics
• Auxotrophic and metabolic mutants
• Chromosomal analysis
• Herbicides
Culture of the hybrid cells

Hybrid cells are cultured on


suitable medium provided with
the appropriate culture
conditions.
Regeneration of hybrid plants

 Plants are induced to regenerate from


hybrid calli
 These hybrid plants must be at least
partially fertile, in addition to having
some useful property, to be of any use
in breeding schemes.
Advantages of somatic
hybridization
 Production of novel interspecific and
intergenic hybrid
 Pomato (Hybrid of potato and tomato)
 Production of fertile diploids and polypoids
from sexually sterile haploids, triploids and
aneuploids
 Transfer gene for disease resistance, abiotic
stress resistance, herbicide resistance and
many other quality characters
Advantages of somatic
hybridization
 Production of heterozygous lines in the
single species which cannot be
propagated by vegetative means
 Studies on the fate of plasma genes
 Production of unique hybrids of nucleus
and cytoplasm
Limitations of Somatic
hybridization
 Poor regeneration of hybrid plants
 Non-viability of fused products
 Not successful in all plants.
 Production of unfavorable hybrids
 Lack of an efficient method for
selection of hybrids
 No confirmation of expression of
particular trait in somatic hybrids
Tahapan Fusi Protoplas
SWEET ORANGE SUSPENSION CULTURE PROTOPLASTS
LEAF-DERIVED CITRUS PROTOPLASTS
TYPICAL SUSPENSION PROTOPLAST + LEAF
PROTOPLAST PEG-INDUCED FUSION
Protoplast Isolation and Culture
 Applications
 protoplast fusion to create somatic hybrids
 "wide crosses" where even embryo culture won't
work
 Citopsis gilletiana (wild) x Citrus sinensis
 citrus sexually incompatible spp.

 wild relative has disease/nematode resistance

 somatic hybrid used as a rootstock


Protoplast Isolation and Culture
 Applications
 protoplast fusion to create somatic hybrids
 Solanum somatic hybrids
 S tuberosum dihaploids fused with wild diploid (S.
chacoense)
 resulting somatic hybrid (4n) is backcrossed to S.
tuberosum cultivars (also 4n)
 overcomes sterility due to ploidy differences between
somatic and sexual hybrids
Protoplast Isolation and Culture
 Procedure for isolating protoplasts from tobacco leaves
 disinfest leaves and rinse in sterile water
 allow leaves to wilt slightly, remove lower epidermis
by peeling with sterile forceps
 transfer leaf pieces to the surface of a solution of salts
and 13% mannitol, let stand 25-30 min. (plasmolysis)
 pipet off plasmolyzing solution from beneath leaf
pieces and replace with 20 ml enzyme solution
(cellulase and macerase)
Protoplast Isolation and Culture
 Procedure for isolating protoplasts from tobacco leaves
 incubate 2-20 h (predetermine time by pretesting)
 place a solution of salts in 25% sucrose into a
centrifuge tube (about 1/3 full)
 pipet enzyme/protoplast mix onto the top of the 25%
sucrose (solutions will form 2 separate layers)
 spin at 800g
 pipet off the band of protoplasts at the interface of
enzyme and 25% sucrose into another tube
Protoplast Isolation and Culture
 Procedure for isolating protoplasts from tobacco leaves
 fill the tube about 2/3 full with 13% mannitol
 spin at 500g; protoplasts should pellet at the bottom
 wash sev. times, then resuspend the last time in a
small volume of liquid MS medium with 9% mannitol
 carefully resuspend protoplasts and determine the
concentration (protoplasts/ml) by counting in a
counting chamber or hemocytometer
Protoplast Isolation and Culture
 Procedure for isolating protoplasts from
tobacco leaves
 dilute to 1 x 105 protoplasts per ml
 plate protoplasts (various techniques)

 After plating
 cell wall formation
 wall starts to form immediately, takes 2-7 days to
form a complete new wall
 loss of spherical shape is a visual indicator
Protoplast Isolation and Culture
 After plating
 cell wall formation
 only cells forming walls will divide
 cell division and callus formation
 plating efficiency is extremely variable
 PE = no. of dividing colonies per field divided by
no. of live protoplasts at plating
 after 2 wks, multicellular colonies form

 at 4-5 wks, macroscopic colonies can be


transferred to solid medium
Protoplast Isolation and Culture
 After plating
 plant regeneration
 mini callus colonies are grown on a callus-
induction medium
 callus is transferred to a regeneration medium,
which will vary depending on whether regeneration
is by organogenesis or somatic embryogenesis
 Media and plating techniques
Protoplast Isolation and Culture
 Media and plating techniques
 liquid medium
 sitting or hanging drops work well for small
populations
 semi-solid medium (aka immobilization)
 mix with 2x agarose (at 40 C with 2x protoplasts in
liquid medium)
 low-melting point agarose melts at 30-35 C, is
better, less stressful on protoplasts
Protoplast Isolation and Culture
 Media and plating techniques
 semi-solid medium (aka immobilization)
 pipet out into a petri dish before agarose solidifies
 as agarose solidifies, protoplasts are imbedded at
low density, allowing essentially "single-cell"
selection
 entrapment in alginate beads
 protoplasts in Na-alginate are dropped into Ca
solution, Ca-alginate gel forms around protoplast
Protoplast Isolation and Culture
 Media and plating techniques
 entrapment in alginate beads
 when cell walls are formed, gel can be dissolved
using a citrates solution
 the advantage is less heat stress on the
protoplasts
 nurse cultures
Protoplast Isolation and Culture
 Media and plating techniques
 nurse cultures
 nurse cells are irradiated and embedded in a
feeder layer; protoplasts placed on top
 alternatively, live nurse cells placed on medium,
nylon membrane on top of nurse cells, protoplasts
on the membrane
 conditioned medium
Protoplast Isolation and Culture
 Media and plating techniques
 conditioned medium
 fast-growing cells removed, the remaining
"conditioned medium" is used for growing
protoplasts
 Protoplast fusion and somatic hybrids
 the fusion process
Protoplast Isolation and Culture
 Protoplast fusion and somatic hybrids
 the fusion process
 electrofusion – protoplasts are aligned in a special
chamber, electric current is applied, opening
channels in cell membrane
 PEG fusion – protoplasts are coated with PEG,
then incubated together; where cell membranes
fuse, channels begin to form
 after fusion, "fusion products" begin to "round up"
Protoplast Isolation and Culture
 Protoplast fusion and somatic hybrids
 the fusion process
 eventually, cell membrane between is dissolved
and nuclei fuse into 1 nucleus
 in this type of fusion, cytoplasm is mixed

 types of fusion products


 parental types – unfused protoplasts that develop
 homokaryons – fusion product of 2 (or more) "like"
protoplasts
 heterokaryons – fusion of "unlike" protoplasts
Protoplast Isolation and Culture
 Protoplast fusion and somatic hybrids
 heterokaryons are the nascent somatic
hybrids
 selection of heterokaryons – strategies
 cell sorting (Cell Facility should be able to do this)
 parental protoplasts are differentially labelled with
fluorescent dyes, one green, one red
 heterokaryons are stained yellow and can be sorted
based on that trait
 selection after plant regeneration
Protoplast Isolation and Culture
 Protoplast fusion and somatic hybrids
 selection of heterokaryons – strategies
 selection after plant regeneration
 e.g., fusion of Solanum tuberosum and S. chacoense
 somatic hybrids selected as calli at 6 wks – they are
more vigorous (initial selection)
 selection based on regeneration – S. chacoense doesn't
regenerate, the somatic hybrid contains an anthocyanin
pigment
Kultur Jaringan Tanaman

AKLIMATISASI

Irfan Suliansyah
PS. Agroekoteknologi
Karakteristik Tanaman Hasil
Kultur Jaringan
 Tanaman yang dibudidayakan dengan teknik kultur jaringan
umumnya mengalami abnormalitas anatomis dan fisiologis
selama berada dalam kultur in vitro.
 Abnormalitas tersebut antara lain adalah: lapisan lilin
epitikultulas yang tipis, stomata yag terus membuka, tingkat
fotosintesis yang rendah, sel-sel palisade yang kecil dan
jarang dan rongga mesofil yang besar.
 Ketidaknormalan tersebut menjadi factor pembatas bagi
tanaman untuk dapat hidup dilingkungan tumbuhnya yang
baru yaitu di lapangan.
 Oleh karena itu, agar tidak terjadi kematian, tanaman harus
melewati masa transisi klimatis melalui proses aklimatisasi.
Karakteristik Tanaman Hasil
Kultur Jaringan
 Tanaman yang ditumbuhkan dalam tabung reaksi biasanya lapisan
kutikula atau lapisan lilinnya tidak berkembang dengan baik. Hal
tersebut disebabkan oleh kelembaban relatif dalam tabung reaksi
amatlah tinggi, berkisar 90-100%. Tipisnya lapisan kutikula
memudahkan hilangnya air melalui evaporasi apabila tanaman
ditransfer ke kondisi in vivo yang kelembabannya lebih rendah.
Daun-daun tanaman in vitro seringkali tipis, lunak, dan tidak aktif
berfotosintesis, sehingga tidak terlalu baik diadaptasikan pada iklim
in vivo. Tanaman in vitro memiliki sel-sel palisade yang kecil dan
sedikit serta ruang udara mesofil yang besar sehingga kurang efektif
dalam menggunakan cahaya. Demikian pula halnya dengan stomata
tanaman in vitro yang belum bekerja dengan baik, sehingga
memudahkan tanaman kehilangan air. Pada tanaman in vitro,
hubungan vaskular antara tunas dan akar juga kurang baik sehingga
akan mereduksi konduksi air. Pada kenyataannya perlu diingat
bahwa tanaman in vitro ditumbuhkan sebagai organisme heterotrof,
sehingga harus dirubah menjadi autotrof.
Karakteristik Tanaman Hasil
Kultur Jaringan
 Tanaman yang dibudidayakan dengan teknik kultur jaringan
umumnya mengalami abnormalitas anatomis dan fisiologis
selama berada dalam kultur in vitro. Abnormalitas tersebut
antara lain adalah: lapisan lilin epitikultulas yang tipis, stomata
yag terus membuka, tingkat fotosintesis yang rendah, sel-sel
palisade yang kecil dan jarang dan rongga mesofil yang besar.
Ketidaknormalan tersebut menjadi factor pembatas bagi
tanaman untuk dapat hidup dilingkungan tumbuhnya yang
baru yaitu di lapangan. Oleh karena itu, agar tidak terjadi
kematian, tanaman harus melewati masa transisi klimatis
melalui proses aklimatisasi.
Karakteristik Tanaman Hasil
Kultur Jaringan
 Tanaman yang ditumbuhkan dalam tabung reaksi biasanya lapisan
kutikula atau lapisan lilinnya tidak berkembang dengan baik. Hal
tersebut disebabkan oleh kelembaban relatif dalam tabung reaksi
amatlah tinggi, berkisar 90-100%. Tipisnya lapisan kutikula
memudahkan hilangnya air melalui evaporasi apabila tanaman
ditransfer ke kondisi in vivo yang kelembabannya lebih rendah.
Daun-daun tanaman in vitro seringkali tipis, lunak, dan tidak aktif
berfotosintesis, sehingga tidak terlalu baik diadaptasikan pada iklim
in vivo. Tanaman in vitro memiliki sel-sel palisade yang kecil dan
sedikit serta ruang udara mesofil yang besar sehingga kurang efektif
dalam menggunakan cahaya. Demikian pula halnya dengan stomata
tanaman in vitro yang belum bekerja dengan baik, sehingga
memudahkan tanaman kehilangan air. Pada tanaman in vitro,
hubungan vaskular antara tunas dan akar juga kurang baik sehingga
akan mereduksi konduksi air. Pada kenyataannya perlu diingat
bahwa tanaman in vitro ditumbuhkan sebagai organisme heterotrof,
sehingga harus dirubah menjadi autotrof.
Karakteristik Tanaman Hasil
Kultur Jaringan
 Dengan kondisi tersebut di atas, maka tanaman in vitro memerlukan waktu
untuk menjadi in vivo dan dibiarkan untuk beraklimatisasi dan menjadi
menguat. Pada saat aklimatisasi tanaman dibiarkan secara berangsur
beradaptasi pada kondisi kelembaban relatif yang rendah. Perkembangan
mekanisme penutupan stomata merupakan komponen aklimatisasi yang amat
penting. Aklimatisasi dapat dilakukan dengan tetap menjaga kelembaban
cukup tinggi dan menjaga iradiasi dan suhu yang rendah (Gambar 17.1).
 Metode aklimatisasi yang lain adalah dengan membiarkan tabung reaksi
terbuka untuk beberapa hari untuk menyesuaikan kondisi in vivo. Untuk
mencegah kehilangan air yang berlebihan, tanaman in vitro dapat juga
disemprot dengan antitranspiran.
 Akar tanaman in vitro amatlah rentan dan tidak berfungsi seperti halnya akar
in vivo (hanya memiliki sedikit atau bahkan tidak memiliki rambut akar). Akar
tanaman in vitro mudah sekali mati, sehingga perlu digantikan dengan akar-
akar yang baru. Perkembangan akar rambut tanaman in vitro kadang-kadang
dapat disokong dengan menumbuhkannya pada media cair.
Aklimatisasi
 Aklimatisasi adalah kegiatan perlakuan adapatasi klimatis dari suatu organisme
hidup, termasuk tanaman, yang dipindahkan dari lingkungan yang lama ke
lingkungan yang baru. Kegiatan aklimatisasi dilakukan untuk menyesuaikan secara
bertahap kesiapan bibit tanaman dalam menerima perubahan dari kondidisi
lingkungan tumbuh pada media perbanyakan in vitro kepada kondisi lingkungan
tumbuh dilapangan.
 Aklimatisasi merupakan tahapan yang sangat penting untuk dilalui dalam prose
perbanyakan invitro. adanya perbanyakan yang sangat tajam terutama kelembaban
dan intensitas cahaya antara lingkungan didalam botol dan diluar botol menyebabkan
proses aklimatisasi ini merupakaan tahapan yang kritis. Dengan demikian
keberhasilan perbanyakan invitro tanaman juga ditentukan oleh keberhasilan
tanaman dalam melalui ini.
 Secara keseluruhan perlakuan yang diberikan selama pelaksanaan aklimatisasi
meliputi perlakuan fisik langsung dan tidak langsung terhadap tanaman. Perlakuan
fisik langsung meliputi penyiraman, pemupukan serta pemberantasan hama dan
penyakit. Sedangkan perlakuan tidak langsung meliputi pengolahan dan pengelolaan
tempat tumbuh yang terdiri dari atas pengolahan media tumbuh, penyiangan atau
pemberantasan gulma serta perlakuan terhadap sarana pengkondisian lingkungan
buatan seperti bak semai, sangkup plastic dan green house atau screen house
Sarana dan Prasarana
 Green house/Sreen House
 Sreen House didefinisikan sebagai struktur lingkungan yang terutup oleh
bahan transparan (tembus cahaya) dengan memanfaatkan radiasi surya
untuk pertumbuhan tanaman (Widyastuti, 1994).
 Fungsi green house adalah untuk melindungi tanaman dari factor alam
yang tidak menguntungkan seperti terpaan air hujan langsung, tiupan
angina yang kencang dan intensitas sinar matahari yang berlebihan. Selain
itu penggunaan green house akan mengurangi intensitas serangan hama
penyakit. Penyebabnya antara lain karena pola kerja yang higenis dan
tanaman terlindung karena berada dalam ruangan tertutup. Sedangkan
screen house adalah suatu bentuk green house yang beratapkan peranet
dan umunya tanpa penutup samping. Dalam aklimatisasi screen house dan
biasanya digunakan pada tahap penyapihan/pendewasaan
Sarana dan Prasarana
 Ruang peralatan dan bahan
 Tidak jauh dari green house hendaknya disediakan
ruangan khusus tempat penyimpanan alat-alat dan
bahan diantaranya: sprayer, pupuk , pestisida dan
sebagainya. Ruangan ini juga bisa digunakan sebagai
ruang ganti pakaian bila akan bekerja di green house.
Sarana dan Prasarana
 Peralatan dan bahan
 Alat-alat yang dibutuhkan antara lain: bak semai, polybag, alat
semprot/sparayer, gembor, plastic untuk sungkup dan lain-lain.
 Bahan-bahan yang dibutuhkan antara lain:media tumbuh, pupuk
dan pestisida.
 Media tumbuh untuk proses aklimatisasi adalah tanah topsil,
pupuk kandang dan sekam baker atau pasir yang sudah
disentralisasi.
 Untuk pupuk dapat digunakan pupuk NPK dan pupuk pelengkap
cair/pupuk daun seperti gandasil.
 Pestisida yang dibutuhkan yaitu:insektisida, fungisida, dan
bakterisida.
Tahap-Tahap Aklimatisasi
 Pembersihan agar-agar
 Tahap awal aklimatisasi adalah pembersihan agar-agar yang masih
melekat pada planlet. Bila agar-agar ini dibiarkan jamur atau
bakteri akan tumbuh pada agar-agar dan bisa menyeababkan
tanaman busuk. Planlet yang telah mengalami perakaran yang baik
dikeluarkan dari tabung kultur menggunakan pinset secara hati-hati.
Kemudian planlet dicuci dengan air bersih, tidak perlu steril.
Supaya bersih pencucian dilakukan dibawah air mengalir. Pada
tahap ini juga dilakukan pengurangan daun-daun tua dan
pengelompokan planlet berdasarkan ukurannya supaya tampak
beragam
Tahap-Tahap Aklimatisasi
 Sterilisasi
 Sebelum planlet ditanam pada bak persemaian terlebih
dahulu dilakukan sterilisasi. Tujuannya adalah untuk
membunuh cendawan dan bakrei yang melekat pada
planlet. Sterilisasi dilakukan dengan merendam dalam
larutan fungisida Benlate ( 1 gr/liter) atau Dithane M-45(2
gr/liter) dan Agrept 20WP (1 gr/liter). Lama peredaman
hanya dua menit, setelah itu planlet ditiriskan. Setelah
selesai tahap ini planlet siap ditanami di media
persemaian.
Tahap-Tahap Aklimatisasi
 Penyemaian Pertama
 Pada tahap ini plantlet di tanam pada baki peneymaian dengan media pupuk
kandang : pasir yang telah steril tau sekam kasr dengan perbandingan 1:1.
Sterilisasi media dilakukan dengan sistem penguapan pada temperatur konstan 80-
100°C selama satu jam. Jarak tanaman 5 x 5 cm. Lubang tanaman dibuat sedalam
2 cm dengan cara menekan media dengan ujung jari. Planlet tidak dapat beradaptasi
langsung dengan kelembaban diluar persemaian dan cahaya matahari langsung.
Karena bak semai diletakan dalam green house dengan inensitas cahaya ± 40%.
Kelembaban udara dijaga sekitar 90% untuk itu bak semai ditutup dengan sungkup
plastic bening. Pembukaan sungkup plastic dilakukan secara bertahap, yaitu ½
bagian, ¾ bagian dan kemudian dibuka penuh. Pada saat ini bibit sangat rentan
terhadap kekeringan atu kelebihan air sehingga perlu perhatian khusus dengan
penyiraman yang tepat.
 Setelah sungkup dibuka penuh tanaman sudah siap menerima pupuk daun. Untuk
pupuk daun dapat digunakan Gandasil D dengan dosis 2-3 gr/l, dengan cara
disemprotkan pada permukaan bawah daun. Pada akhir tahap ini (sekitar 3-4
minggu setelah tanam) bibit sudah memperlihatkan vigor tanaman yang baik dan siap
dipindahkan ke tahap penyemaian kedua
Tahap-Tahap Aklimatisasi
 Penyemaian kedua
 Untuk penyemaian kedua terlebih dahulu disiapkan media tanam berupa campuran tanah: pupuk
kandang, pasir/sekam baker (1:1:1). Media dimasukkan kedalam polybagdengan ukuran sesuai
dengan kebutuhan. Juga dapat ditambahkan pupuk dasar NPK 25:7:7 2 gr per polybag (Anonim,
1997). Setelah media siap berulah tanaman dipindahkan. Pemindahan plamlet hanya dapat
dilakukan terhadap planlet yang pertumbuhannya sehat dan tidak ada tanda-tanda terserang
hama/penyakit. Sebelum dipindahkan bak semai harus disiram terlebih dahulu. Hal ini
dimaksudkan agar pada saat planlet dicabut akarnya tidak banyak yang putus, disamping agar
planlet tidak mudah layu.Planlet yang sudah dicabut akarnya sebaiknya segera ditanam pada
polybag. Sebelum ditanami, media polybag harus disiram agar kapasitas lapang dengan gembur
dan halus. Penyemaian masi dalam green house selanjutnya tanaman yang telah dipindahkan
harus dirawat secara teratur. Penyiraman dilakukan sesuai dengan kebutuhan. Pada saat cuaca
cerah penyiraman dilakukan dua kali sehari pada pagi dan sore hari. Pada cuaca mendung
penyiraman tanaman cukup sekali saja pada pagi hari. Untuk memacu pertumbuhan bibit
dilakukan pemupukan daun tanah dan daun. Pemupukan lewat tanah dilakukan dengan cara
membenamkan 1 gram pupuk NPK 25:7:7 untuk setiap polybag. Pemupuka lewat daun
dilakukan dengan menggunakan pupuk Gandasil D sebanyak 2 gram /l air yang disemprotkan ke
daun. Pemupukan lewat daun dilakuakn anatara pemupkan lewat tanah dan pemupukan lewat
daun setiap seminggu sekali. Untuk pencegahan terhadap serangan cendawan seminggu sekali
bibit disemprot dengan fungisida Dithane M-45 atau Antracol sesuai dengan dosis anjuran.
Perawatan lainnya yaitu pembuangan daun-daun tua, penyiangan dan perambahan meia bila
terjadi penyusutan akibat penyiraman. Jangan sampai lupa menjaga kebersihan lingkungan
green house. Waktu yang diutuhkan untuk tahap ini ± 1 bulan
Tahap-Tahap Aklimatisasi
 Penyapihan/Pendewasaan
 Dalam tahap ini bibit dipindahl\kan keluar dari green house dan ditempatkan
dalan screen house atau dibawah naungan pohon. Pada tahapan ini
perlindungan tanaman semakin berkurang sehingga ,mencapai minimum,
tetapi perlindungan tetap diberikan untuk menghadapi kondisi lingkungan
yang ekstrim. Penyiraman dilakukan 2 kali sehari. Pemupukan pada tahap
penyemaian kedua tahap ini. Pengendalian hama dan penyakit dilakuakn
apbila terlihat gejala-gejala serangandengan penyemprotan insektisida dan
fungisida. Lama proses penyapihan tergantung pada kesiapan tanaman
untuk dipindahkan ke lapang. Bibit yang akan ditanam ke lapang dipilih
ukurannya
Hubungan Simbiotik
 Beberapa tanaman pada kondisi normal bersimbiosis dengan jamur
(mikoriza) atau bakteri (Rhizobium) selama fase hidupnya. Pada
keadaan in vitro proses simbiosis tersebut tidak berlangsung,
karena organisme simbiotiknya tidak ada. Sehingga tanaman-
tanaman tersebut perlu diinokulasi dengan fungi atau bakteri untuk
menstimulir pertumbuhan dan perkembangannya.
Kondisi Lingkungan
 Untuk mencegah kerusakan akar sebaiknya tanah yang
digunakan adalah tanah hasil ayakan. Kadang-kadang
diperlukan perlakuan dingin pada saat in vitro atau
segera setelah transfer ke kondisi in vivo untuk
mematahkan dormansi tunas. Apabila tanaman in vitro
ditransfer ke glasshouse, maka kelembaban relatif dan
iradiasi perlu diturunkan.