BAB I

PENDAHULUAN

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara

vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara

mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan

bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan

zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian

tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap.

Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan

menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang

dilakukan di tempat steril.

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak

tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara

generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa

keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat

diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan

tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu

yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit

lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.

Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan

diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin,

1
dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan

lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik

jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang

dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-

botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara

memanaskannya dengan autoklaf.

Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu istilah

umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang

umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro

yang artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas.

Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni:

1. Kultur biji, kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling.

2. Kultur organ, merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan

organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga,

buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll.

3. Kultur kalus, merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel)

biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya.

4. Kultur suspensi sel adalah kultur yang menggunakan media cair dengan

pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel

atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan

berupa kalus atau jaringan meristem.

5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas

bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan

2
 pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding

selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi

somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun

interspesifik).

6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman,

yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen

(kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman

haploid.

3
 BAB II

PEMBAHASAN

1. Pengertian Kultur Organ

Teknik kultur jaringan semakin berkembang dan popular sebagai salah satu

alternatif dari propagasi tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode

propagasi aseksual dan tujuan utamanya adalah membuat tanaman lebih

unggul. Kesuksesan dari beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetic pada

tanaman tingkat tinggi tergantung pada kesuksesan dari regenerasi tanaman in

vitro.

Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur

organ. Menurut Shabde – Moses & Murhasige (1979), Hannig, pada tahun

1904 telah berhasil mendapatkan kecambah tanaman jenis crucifer dari embrio-

embrio yang diisolasi dari biji yang belum matang (immature). Pertumbuhan

organ yang tidak terbatas didalam kultur in vitro, pertama diperlihatkan oleh

White dalam kultur akar tomat sekitar tahun 1934.

Kultur organ merupakan salah satu cara perbanyakan dalam ilmu

Bioteknologi. kultur organ yang disebut juga dengan perbanyakan mikro

dimulai dengan bagian yang terorganisir dari suatu tanaman, paling sering

digunakan adalah tunas dan proses pengkulturan ini menjaga keadaan

terorganisir sambil mengarahkan pertumbuhan dan perkembangan kearah

perbanyakan dan regenerasi tanaman baru yang lengkap.

4
 Disamping kultur pucuk, pada tahun 60 an, kultur akar mendapat perhatian

lagi pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi bahan

sekunder, terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan

akar. Namun kultur akar yang pertumbuhannya tidak terbatas tersebut, dewasa

ini pada umumnya dipusatkan pada hasil transformasi dengan Agrobacterium

rhizogenes yang merupakan kultur auksin autotroph.

Secara keseluruhan kultur organ dalam ilmu fisiologi dipergunakan dalam

studi diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi

dan lingkungan, dapat dieksplorasi antara lebih tepat dalam kultur in vitro.

Organ-organ tanaman yang sering digunakan sebagai eksplan tergangtung dari

jenis tanamannya, organ tersebut antara lain adalah:

a. Jaringan meristem

b. Helaian daun

c. Tuber rhizogenum

d. Pucuk kormus

e. Tuber caulogenum

f. Buku kormus

g. Inflorescentia

h. Buku bulb

i. Mata Tunas samping

j. Buku batang tunggal

k. Hipokotil dan epikotil

l. Ruas batang muda

5
 m. Akar

2. Media Kultur Organ

Tanaman monokotil terutama tanaman Gramineae seperti padi, media MS

juga dapat digunakan. Tetapi selain MS, dikembangkan juga beberapa media

lain misalnya media N6. Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH4+ dan

NO3_ yang jauh perbedaannya. Ammonium yang diberikan dalam bentuk

(NH4)2SO4 hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO3 : 2830 mg/l. Khusus

untuk padi, ada beberapa media lain yang dikembangkan di Cina, sesuai

dengan kultivar padinya, misalnya media SK3, He5 dan LB.

Media dasar yang digunakan untuk tanaman dikotil, umumnya adalah media

MS, media White dan media Nitsch &Nitsch, dengan berbagai modifikasi

dengan penambahan sukrosa sekitar 20 – 40 gram/liter. Zat Pengatur Tumbuh

diberikan dalam konsentrasi serendah mungkin untuk menghindari

terbentuknya kalus dari jaringan-jaringan diploid yang tidak diinginkan. Untuk

mendapatkan double haploid dipergunakan larutan colchicine: 0,5% dengan

waktu perendaman 24-28 jam.

3. Faktor Penentu Kultur Jaringan

1) Genotipe Tanaman

Salah satu faktor yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan

morfogenesis eksplan dalam kultur invitro adalah genotip tanaman asal

eksplan diisolasi. Hasil-hasil penelitian menunjukkan bahwa respon masing-

6
 masing eksplan tanaman sangat bervariasi tergantung dari spesies, bahkan

varietas, atau tanaman asal eksplan tersebut. Pengaruh genotip ini umumnya

berhubungan erat dengan faktor-faktor lain yang mempengaruhi

pertumbuhan eksplan, seperti kebutuhan nutrisi, zat pengatur tumbuh, dan

lingkungan kultur. Oleh karena itu, komposisi media, zat pengatur tumbuh

dan lingkungan pertumbuhan yang dibutuhkan oleh masing-masing varietas

tanaman bervariasi meskipun teknik kultur jaringan yang digunakan sama.

2) Media Kultur

Perbedaan komposisi media, komposisi zat pengatur tumbuh dan jenis

media yang digunakan akan sangat mempengaruhi pertumbuhan dan

regenerasi eksplan yang dikulturkan.

a. Komposisi Media

Perbedaan komposisi media, seperti jenis dan komposisi garam-garam

anorganik, senyawa organik, zat pengatur tumbuh sangat mempengaruhi

respon eksplan saat dikulturkan. Perbedaan komposisi media biasanya

sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan.

Meskipun demikian, media yang telah diformulasikan tidak hanya

berlaku untuk satu jenis eksplan dan tanaman saja. Beberapa jenis

formulasi media bahkan digunakan secara umum untuk berbagai jenis

eksplan dan varietas tanaman, seperti media MS. Namun ada juga

beberapa jenis media yang diformulasikan untuk tanaman-tanaman

tertentu misalnya WPM, VW dll. Media-media tersebut dapat digunakan

untuk berbagai tujuan seperti perkecambahan biji, kultur pucuk, kultur

7
 kalus, regenerasi kalus melalui organogenesis dan embriogenesis. Media

yang dibutuhkan untuk perkecambahan biji, perangsangan tunas-tunas

aksilar umumnya lebih sederhana dibandingkan dengan media untuk

regenerasi kalus baik melalui organogenesis maupun embryogenesis.

b. Komposisi Hormon Pertumbuhan

Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan

dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi

eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon

pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung

dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan pengkulturannya.

Konsentrasi hormon pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam

media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan serta kandungan

hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada eksplan tersebut.

Komposisi yang sesuai ini dapat diperkirakan melalui percobaan-

percobaan yang telah dilakukan sebelumnya disertai percobaan untuk

mengetahui komposisi hormon pertumbuhan yang sesuai dengan

kebutuhan dan arah pertumbuhan eksplan yang diinginkan. Hormon

pertumbuhan yang digunakan untuk perbanyakan secara invitro adalah

golongan auksin, sitokinin, giberelin, dan growth retardant

c. Keadaan fisik media

Media yang umum digunakan dalam mikropropagasi adalah media

semi-solid (semi padat) dengan cara menambahkan agar. Media semi

padat ini digunakan karena beberapa alasan antara lain: eksplan yang

8
 kecil mudah terlihat dalam media padat, selama kultur eksplan tetap

berada pada orientasi yang sama, eksplan berada di atas permukaan

media sehingga tidak diperlukan teknik aerasi tambahan pada kultur,

orientasi pertumbuhan tunas dan akar tetap, dan kalus tidak pecah seperti

jika ditempatkan pada media cair. Namun penambahan agar dalam

beberapa kasus dapat menghambat pertumbuhan karena: agar mungkin

mengandung senyawa penghambat yang dapat menghambat

morfogenesis beberapa kultur atau memperlambat pertumbuhan kultur,

eksudasi fenolik dari eksplan terserap oleh media yang menempel dengan

eksplan sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan eksplan, agar harus

dicuci bersih dari akar sebelum diaklimatisasi, dan perlu waktu yang

lebih banyak untuk mencuci gelas kultur misalnya botol-botol harus di

autoclave untuk melarutkan agar sebelum dicuci.

3) Lingkungan tumbuh

a. Suhu

Tanaman umumnya tumbuh pada lingkungan dengan suhu yang tidak

sama setiap saat, misalnya pada siang dan malam hari tanaman

mengalami kondisi dengan perbedaan suhu yang cukup besar. Keadaan

demikian bisa dilakukan dalam kultur invitro dengan mengatur suhu

siang dan malam di ruang kultur, namun laboratorium kultur jaringan

selama ini mengatur suhu ruang kultur yang konstant baik pada siang

maupun malam hari. Umumnya temperatur yang digunakan dalam kultur

in vitro lebih tinggi dari kondisi suhu invivo. Tujuannya adalah untuk

9
 mempercepat pertumbuhan dan morfogenesis eksplan. Pada sebagian

besar laboratorium, suhu yang digunakan adalah konstan, yaitu 25°C

(kisaran suhu 17-32°C)

b. Kelembaban Relatif

Kelembaban relatif dalam botol kultur dengan mulut botol yang

ditutup umumnya cukup tinggi, yaitu berkisar antara 80-99%. Jika mulut

botol ditutup agak longgar maka kelembaban relatif dalam botol kultur

dapat lebih rendah dari 80%. Sedangkan kelembaban relatif di ruang

kultur umumnya adalah sekitar 70%. Jika kelembaban relatif ruang kultur

berada dibawah 70% maka akan mengakibatkan media dalam botol

kultur (yang tidak tertutup rapat) akan cepat menguap dan kering

sehingga eksplan dan plantlet yang dikulturkan akan cepat kehabisan

media. Namun kelembaban udara dalam botol kultur yang terlalu tinggi

menyebabkan tanaman tumbuh abnormal yaitu daun lemah, mudah

patah, tanaman kecil-kecil namun terlampau sukulen. Kondisi tanaman

demikian disebut vitrifikasi atau hiperhidrocity. Sub-kultur ke media lain

atau menempatkan planlet kecil ini dalam botol dengan tutup yang agak

longgar, tutup dengan filter, atau menempatkan silica gel dalam botol

kultur dapat membantu mengatasi masalah ini.

c. Cahaya

Seperti halnya pertumbuhan tanaman dalam kondisi invivo, kuantitas

dan kualitas cahaya, yaitu intensitas, lama penyinaran dan panjang

gelombang cahaya mempengaruhi pertumbuhan eksplan dalam kultur

10
 invitro. Pertumbuhan organ atau jaringan tanaman dalam kultur invitro

umumnya tidak dihambat oleh cahaya, namun pertumbuhan kalus

umumnya dihambat oleh cahaya.Pada perbanyakan tanaman secara

invitro, kultur umumnya diinkubasikan pada ruang penyimpanan dengan

penyinaran.Tunas-tunas umumnya dirangsang pertumbuhannya dengan

penyinaran, kecuali pada teknik perbanyakan yang diawali dengan

pertumbuhan kalus.

4) Kondisi Eksplan

Pertumbuhan dan morfogenesis dalam mikropropagasi sangat

dipengaruhi oleh keadaan jaringan tanaman yang digunakan sebagai

eksplan. Selain faktor genetis eksplan yang telah disebutkan di atas, kondisi

eksplan yang mempengaruhi keberhasilan teknik mikropropagasi adalah

jenis eksplan, ukuran, umur dan fase fisiologis jaringan yang digunakan

sebagai eksplan.

4. Macam-Macam Kultur Organ

a) Kultur Organ, sumber eksplan dapat berupa bagian organ tanaman seperti

tunas, akar, batang, biji, umbi, daun, tangkai daun.

b) Kultur Meristem : Meristem dari tunas pucuk atau tunas aksiler, ruas

batang.

c) Kultur Sel yang mempunyai tipe khusus : serbuk sari (sel haploid),

endosperm (triploid).

d) Kultur Antera/Polen Anter atau Kepala sari mengandung polen.

11
e) Kultur Embrio

f) Memisahkan embrio yang belum dewasa dan menumbuhkan secara in-

vitro. Tujuan Kultur Embrio: Memperpendek waktu berkecambah,

menguji kecepatan viabilitas biji, memperbanyak tanaman langka seperti

Kelapa kopyor (mempunyai embrio yang lunak).Memperoleh hibrid yang

langka seperti Embrio pada keadaan normal sering mati pada awal tingkat

perkembangannya.

g) Kultur Protoplas

h) Protoplas adalah sel hidup yang telah dihilangkan dinding sel nya (sel

telanjang).

Tujuan Kultur Protoplas:

1) Mempelajari komponen penyusun sel (organela).

2) Untuk dapat melakukan fusi protoplas.

3) Mendapatkan tanaman hibrid dan cybrid somatic.

4) Digunakan dalam trasplantasi dan transformasi genetic.

i) Kultur Biji

Tujuan Kuktur Biji:

1) Mempercepat waktu kecambah.

2) Mengatasi masalah tanaman langka.

3) Mempelajari kecepatan pertumbuhan.

4) Mendapatkan biji steril untuk mengatasi kontaminasi

5) pada eksplan yang dibudidayakan.

12
5. Langkah Kerja Kultur Organ

Cara Pembuatan Media

1. Melarutkan semua larutan yang dibutuhkan dari media MS untuk setiap

larutan stok.

2. Ketika semua unsur sudah larut, tambahkan 30 gr sukrosa dan tambahkan

volume dengan akuades sampai 900 ml kemudian aduk menggunakan

stirrer.

3. Mengecek pH menggunakan pH meter.

4. Jika pH kurang dari 5,8 tambahkan NaOH sampai pH mencapai 5,8.

5. Jika pH lebih dari 5,8 tambahkan HCl sampai pH mencapai 5,8.

6. Masak media yang telah siap dengan ditambahkan 8 gr agar bubuk sampai

mendidih.

7. Memasukkan media yang telah mendidih ke dalam botol kultur dan

ditutup menggunakan plastik.

8. Media di autoklaf pada 121oC-126oC selama 15 menit.

9. Media yang sudah di autoklaf disimpan dalam rak inkubasi.

6. Sterilisasi Awal

Ambil eksplan dari tanaman hidup

Gojok dengan detergent 2,5 % selama 5 menit

Bilas dengan air mengalir

13
 ↓

Rendam fungisida 0,3 % selama 5 menit

Cuci dengan clorok 30 %/ 50 ml H2O

Aduk dengan spatula

Rendam aquades steril selama 5 menit

7. Penanaman di LAFC

Potong bagian eksplan

Tanam pada media MS

Panaskan pinggir botol dan tutupnya dengan Bunsen

Tutup botol ikat dengan karet

Pengamatan 3 hari sekali selama 2 minggu

Dokumentasi

14
8. Cara Kerja Kultur Organ

Digojok dengan detergent 2,5 % selama 5 menit untuk mensterilkan kultur

tunas dari bahan-bahan yang dapat mengganggu pertumbuhan. Dibilas dengan

air mengalir agar tidak ada sisa detergent yang menempel pada tunas. Setelah

itu direndam dengan fungisida 0,3 % selama 5 menit juga untuk mensterilkan

bahan juga. Kemudian dicuci dengan clorok 30 % 150 ml H2O agar bahan

lebih steril untuk penanaman yang terakir yaitu direndam dengan aqudes agar

semua pensterilan sebelumnya tidak menempel pada bahan kultur. Dilakukan

dimasukan diaquades dan pembakaran spatula, pisau, pinset bertujuan untuk

pensterilan alat. Pemanasan pinggir botol dan tutupnya dengan Bunsen agar

botol kultur benar-benar steril.

15
 BAB III

PENUTUP

1. Kesimpulan

Kultur organ merupakan salah satu cara perbanyakan dalam ilmu

Bioteknologi. kultur organ yang disebut juga dengan perbanyakan mikro

dimulai dengan bagian yang terorganisir dari suatu tanaman, paling sering

digunakan adalah tunas dan proses pengkulturan ini menjaga keadaan

terorganisir sambil mengarahkan pertumbuhan dan perkembangan kearah

perbanyakan dan regenerasi tanaman baru yang lengkap.

16