I. PENDAHULUAN
Dalam ilmu fisiologi terdaapat berbagai jenis kultur diantaranya adalah kultur
organ, kultur embrio, dan kultur anther. Kultur organ daun digunakan untuk studi
deferensiasi dan fungsi dari jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan keadaan
lingkungan dapat di eksplorasi secara lebih tepat dalam kultur In Vitro. Eksplan
yang sering digunakan untuk perbanyakan tanaman cocor bebek secara in vitro
adalah bagian daun, karena mitosis pada sel-sel yang berkesinambungan sehingga
ekstra duplikasi DNA dapat dihindari.
Kultur embrio merupakan kultur yang menggunakan embrio yang diperoleh dari
benih suatu tanaman yang diambil embrionya. Embrio tersebut di tanam pada
media kultur untuk mengintensifkan pertumbuhan embrio tersebut. Dalam laporan
praktikum ini akan di bahas mengenai kultur embrio dan cara pelaksanaan dalam
pembuatan kultur embrio.
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dari kegiatan kultur embrio yaitu memisahkan embrio yang
belum dewasa dan menumbuhkan secara kultur jaringan untuk menghasilkan
tanaman viable, sedangkan tujuan dari eknik kultur anther yaitu untuk membentuk
tanaman haploid yang beragam untuk doubling mendapatkan genotip homozigot
secara cepat.
II. TINJAUAN PUSTAKA
Berdasarkan tujuan dan jenis embrio yang dikulturkan, kultur embrio digolongkan
menjadi:
Tujuan mengkulturkan embrio muda ini adalah menanam embrio yang terdapat
pada buah muda sebelum buah tersebut gugur (mencegah kerusakan embrio akibat
buah gugur) sehingga teknik ini disebut sebagai Embryo Rescue (Penyelamatan
Embrio). Kondisi seperti ini biasanya sering dijumpai pada buah hasil persilangan,
dimana absisi buah kerap kali dijumpai setelah penyerbukan dan pembuahan.
Kultur anther merupakan salah satu teknik dasar penerapan bioteknologi untuk
pemuliaan tanaman. Dari kultur anther akan didapatkan tanaman haploid.
Pembentukan tanaman haploid melalui pembentukan kalus atau androgenesis
langsung. Manfaat tanaman haploid dalam pemuliaan tanaman adalah apabila
digandakan kromosomnya dengan kolkhisin atau melalui fusi protoplas akan
diperoleh tanaman 100% homozigot (http://www.rudyct.com,2013).
Anther diperoleh dari tunas bunga dan dapat dikulturkan pada medium padat
atau cair sehingga terjadi embryogenesis. Selain itu pollen juga dapat diambil
secara aseptic dan dikulturkan pada medium cair. Proses perbanyakan tanaman
haploid dengan menggunakan gametofity jantan semacam ini disebut sebagai
androgenesis (Yuwono, 2008).
Menurut Wijayani (1994) Kultur anther dan serbuk sari digunakan untuk
menghasilkan tanaman monoploid atau haploid. Meskipun mutasi mudah terjadi
dalam sel biakan namun banyak mutasi tersebut bersifat resesif. Oleh karena itu
tidak terdektesi karena sel selnya dalam keadaan diploid atau poliploid.
1. Genotif
Genotif dari sumber bahan anther memegang peranan penting dalam menentukan
berhasil atau tidaknya kultur anther. Tidak terlalu banyak jenis tanaman yang
mempunyai kemampuan untuk memproduksi tanaman haploid melalui kultur
anther.
Faktor kritis yang mempengaruhi produksi tanaman haploid dari kultur anther
adalah tahap perkembangan mikrospora. Pada sebagian besar jenis tanaman,
anther hanya responsive selama fase un-inukleat dari perkembangan polen
5. Pra perlakuan
Ada dua penggolongan media tumbuh : media padat dan media cair. Media
padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar, dimana nutrisi
dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair
dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung
kebutuhan. Komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan dapat berbeda
komposisinya. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan
pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secarain vitro. Media
Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsur hara
makro, mikro dan vitamin untuk pertumbuhan tanaman. ( Wikipedia, 2013 )
1 KNO3
2. NH4NO3
3. CaCl2.H2o
4. MgSo4.7H2O
5. KH2PO4
Salah satu unsur Fe berasal dari komponen nutrisi mikro anorganik. Unsur Fe
dikatagorikan dalam larutan stok C karena nutrisi ini tidak dapat larut dengan unsur
lain. Oleh karena itu, Fe harus dipisahkan dari unsur lain.
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah media MS sebagai
media tanam, bunga rosella(embrionya)
sebagai bahan pada praktikum kultur embrio, bunga (anther) pada jantung pisang
sebagai bahan dalam praktikum kultur anther, alcohol untuk mensterilkan eksplan
dan ruang penabur (LAF), aquadest steril digunakan untuk membersihkan sisa
larutan pensteril, bayclin yang mengandung Chlorine sebagai bahan sterilisasi
eksplan, alumunium foil sebagai penutup botol kultur; spiritus sebagai bahan bakar
bunsen dan untuk sterilisasi eksplan dan alat (pinset dan scalpel), label untuk
pemberian label pada botol kultur, dan korek api untuk menyalakan api bunsen.
Sedangkan alat yang digunakan adalah Adapun alat yang digunakan pada
percobaan ini adalah botol kultur sebagai tempat penanaman eksplan, autoklaf
untuk mensterilkan alat-alat, petridish untuk tempat meletakkan eksplan, LAF
(Laminar Air Flow) untuk menabur atau tempat menanam, erlenmeyer sebagai
wadah larutan, gelas ukur untuk menakar larutan yang digunakan, timbangan
analitik untuk menimbang media dan bahan yang digunakan, scalpel untuk
memotong eksplan, pinset untuk menjepit eksplan pada waktu menanam,
handsprayer untuk menyemprotkan alkohol, lampu bunsen untuk membakar
eksplan dan mensterilkan scalpel dan pinset, gunting untuk membuang bagian
tanaman yang tidak terpakai, baju lab untuk dipakai ketika bekerja sehingga
mengurangi kontaminasi, masker sebagai penutup mulut, sarung tangan untuk
menutupi tangan, rak kultur sebagai tempat meletakkan botol kultur, sikat / brush
untuk menyikat dan membersihkan eksplan dari kotoran, tutup kepala untuk
menutup rambut, talam untuk membawa botol kultur dalam ruang inkubasi, serbet
untuk membersihkan meja LAF, pulpen sebagai alat tulis.
Untuk sterilisasi panas kering (dalam oven), peralatan seperti scalpel, gunting
dan forsep, petri dish, beaker dll, dapat dibungkus dengan kertas atau aluminium
foil terlebih dahulu sebelum diautoklaf. Kertas yang diautoklaf kemudian
dikeringkan dengan cara meletakkan pada oven dengan suhu 60 700 C atau di
dalam laminar air flow cabinet sebelum digunakan.
Sedangkan untuk sterilisasi pada bahan tanaman data diakukan dengan 2 cara,
yaitu :
a. Metode fisik
Metode fisik untuk ditujukan untuk mengatasi kontaminasi mikroba dimaksudkan
untuk mengurangi ukuran populasi mikroba.
2. Pada saat memulai kultur jaringan, tanaman dicuci bersih, dan bagian yang
tidak akan dikulturkan segera dibuang. Pembersihan meliputi pencucian,
penggosokan yang merata untuk membuang semua partikel tanah dan daun mati.
Termasuk juga membuang sebagian besar daun, karena kebanyakan daun tidak
digunakan dalam kultur.
3. Bahan tanaman kemudian dicuci dibawah air mengalir selama 20 menit, sampai
beberapa jam, tergantung sumber bahan tanaman. Ini sama artinya dengan
membuang jutaan mikroba ke drainase.
b. Metode Kimia
Cara ini dapat dilakukan dengan larutan sodium hypochlorite (NaOCl). Kebanyakan
lab menggunakan bleach (pemutih) seperti Bayclin, yang mengandung 4% chlorine
tersedia. 25 mL Bayclin yang dibuat menjadi 100 mL dengan penambahan air
destilata akan memberi konsentrasi 1% chlorine tersedia. Karena kemurniannya,
hypochlorite memiliki aktivitas yang kecil pada pH melebihi 8.0 dan akan lebih
efektif jika pH diatur menjadi sekitar 6.0 dengan penambahan HCl.
Berikan sedikit tekanan pada perlakuan chlorine. Ini dapat dilakukan dengan
desikator vakum yang disambungkan ke air atau pompa tipe lain.
Semua teknik tersebut akan meningkatkan kontak tanaman dengan larutan klorine.
Lama perlakuan dengan larutan klorin yang diperlukan akan berbeda beda,
tergantung tipe dan sensitivitas bahan tanaman.
- Pembuatan Media MS
Adapun cara pembuatan media ini yaitu pertama kali mengisi gelas ukur dengan
500 ml aqades, lalu masukkan larutan stock. Tambahkan aquades lagi hingga
ukuran mencapai 900 ml, lalu mengukur pH nya dengan kisaran 5,6-5,8. Jika pH nya
rendah ambahkan KOH atau NaOH, sedangkan jika pH nya tinggi tambahkan HCl.
Jika pH telah sesuai kemudian tambahkan aquades hingga mencapai 1 Liter.
Kemudian tambahkan agar swallow sebanyak 7 gram dan tambahkan sukrosa
sebanyak 20 gr.
Hasil praktikum kultur embrio ini gagal. Penyebab kegagalan dapat disebabkan
kesalahan praktikan saat meletakkan eksplan ke dalam media yang terlalu dalam
dan menyebabkan embrio menjadi rusak atau dapat disebabkan oleh kontaminasi
yang disebabkan oleh mikroorganisme seperti jamur, bakteri maupun virus yang
tidak tersterilisasi secara sempurna.
Tipe lain kontaminasi adalah eksudasi dair eksplan, bukan dari organisme lain.
Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau perlakuan bahan
kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel sekitar luka. Salah satu
prosesnya adalah produksi bahan biokimia apakah sebagai produk pecahan atau
sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari jaringan akan
terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi pengaruh mematikan
pada pertumbuhan kultur.
Hasil praktikum kultur anther ini gagal karena pada eksplan menunjukkan adanya
kontaminasi eksplan yang berasal mikrooganisme seperti jamur, bakteri, atau virus.
Organisme organisme tersebut secara universal terdapat pada jaringan tanaman
yang mungkin terbawa saat anther dijadikan sebagai eksplan. Mikroorganisme
tersebut banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan
bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering dan adanya
organisme competitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol. Tapi, kondisi
in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara dalam
konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai
mikroorganisme yang seringkali tumbuh dan berkembang sangat cepat, sehingga
mengalahkan eksplan.
Kultur embrio bertujuan untuk memisahkan embrio yang belum dewasa dan
menumbuhkan secara kultur jaringan untuk menghasilkan tanaman viable,
sedangkan tujuan dari eknik kultur anther yaitu untuk membentuk tanaman haploid
yang beragam untuk doubling mendapatkan genotip homozigot secara cepat.
Namun, kedua teknik yang telah dilakukan tersebut gagal dikarenakan terjadinya
kontaminasi pada eksplan. Eksplan awal merupakan sumber utama kontaminasi,
tapi kontaminasi kembali dapat terjadi selama proses kultur, sehingga media dan
semua wadah dan alat harus disterilisasi terlebih dahulu. Kontaminasi mungkin
terjadi pada permukan tanaman, antar sel atau dalam sel tanaman. Perlakuan awal
atau manajemen bahan tanaman dapat mengurangi jumlah kontaminasi dan
dengan mengurangi perlakuan dekontaminasi yang diperlukan tentu saja dapat
mengurangi resiko kerusakan jaringan eksplan.
5.2 Saran
Semua kegiatan harus dilakukan pada kondisi higienis, meskipun tidak selalu
perlu pada laboratorium yang steril. Udara merupakan sumber utama spora dan
agen kontaminasi lainnya, termasuk badan dan pakaian si pelaksana praktikum.
DAFTAR PUSTAKA