BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang mempelajari
mikroorganisme. Objek kajiannya biasanya adalah semua makhluk (hidup) yang
perlu dilihat dengan mikroskop khususnya bakteri, fungi, alga mikroskopik,
protozoa. Pengamatan suatu spesies mikroba selalu berdasarkan atas penyelidikan
sifat biakan murni dari spesies mikroba. Untuk memelihara dan memisahkan
suatu kegiatan dan jenis mikroba yang satu dengan yang lainnya diperlukan alat
dan medium yang steril. Artinya pada bahan atau peralatan tersebut tidak
didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang akan
mengganggu atau merusak media maupun mengganggu mikroorganisme
kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan.
Media dapat berfungsi untuk membiakkan, mengisolasi dan menyimpan
mikroorganisme dalam waktu yang lama di laboratorium. Media juga berfungsi
untuk mempelajari sifat-sifat pertumbuhan koloni, sifat-sifat biokimiawi
mikroorganisme. Selain itu dalam laboratorium mikrobiologi kedokteran dapat
berfungsi untuk pembuatan antigen, toksin, dan untuk pasasi kuman dengan
tujuan perubahan virulensi dan lain-lain.
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu untuk mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkaian. Dalam makalah ini akan dibahas secara
lebih dalam mengenai persiapan media serta pewarnaan bakteri.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa definisi media mikroba?
2. Apa saja macam-macam media pertumbuhan?
3. Bagaimana cara pembuatan media?
4. Apa saja jenis-jenis dari pewarnaan bakteri?
5. Bagaimana teknik pewarnaan bakteri?

1.3 Tujuan

1. Mengetahui definisi media mikroba

2. Mengetahui macam-macam media pertumbuhan
3. Mengetahui cara pembuatan media
4. Mengetahui jenis-jenis pewarnaan bakteri
5. Bagaimana teknik pewarnaan bakteri
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Definisi Media

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient)
yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-
macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat
fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba. Dapat disimpulkan media adalah
suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (nutrient) yang dipakai untuk
menumbuhkan mikroba (Sutedjo, 1996).

Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-molekul

kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel-nya. Media pertumbuhan juga
bisa digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme mengidentifikasi dan
membuat kultur murni. Komposisi media pertumbuhan dapat dimanipulasi untuk
tujuan isolasi dan identifikasi mikroorganisme tertentu sesuai dengan tujuan
masing-masing pembuatan suatu media (Dwidjoseputro, 1994).

2.2 Komponen Penyusun Media

A. Bahan Dasar
1. Air (H2O) sebagai pelarut
Air merupakan komponen utama sel mikroba dan medium. Funsi air
adalah sebagaisumber oksigen untuk bahan organik sel pada respirasi.
Selain itu air berfungsi sebagai pelarutdan alat pengangkut dalam
2. Nutrisi atau Zat Makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk
metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P dan
unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element. Sumber
karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau
anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan
sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan
 asam organik. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau
senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber
N anorganik seperti urea.
3. Bahan Tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium
dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa)
ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik
hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat
pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan (Eny, 2014).
B. Bahan yang Sering Digunakan dalam Pembuatan Media
1. Agar
Agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan
terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai
pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther
Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak
akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan
dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat
menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.
2. Peptone
Peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti
otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.
Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya.
3. Meat extract.
Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa,
plasenta dan daging sapi.
4. Yeast extract
Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol.
Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B
complex).
 5. Karbohidrat
Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam
amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol,
dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-
1% (Eny, 2014).

2.3 Persyaratan Media

1. Tingkat keasaman (pH)

Kebanyakan mikroba tumbuh baik pada pH sekitar netral dan pH 4,6 – 7,0
merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri, sedangkan kapang
dan khamir tumbuh pada pH yang lebih rendah.
2. Suhu
Suhu merupakan salah satu factor lingkungan yang berpengaruh terhadap
pertumbuhan mikroba. Setiap mikroba mempunyai kisaran suhu dan suhu
optimum tertentu untuk pertumbuhannya. Berdasarkan kisaran suhu
pertumbuhan, mikroba dibedakan atas tiga kelompok sebagai berikut:
a. Psikrofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan
pada suhu 0-20OC.
b. Mesofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan 20-
45OC.
c. Termofil, yaitu mikroba yang suhu pertumbuhannya diatas 45OC.

Kebanyakan mikroba perusak pangan merupakan mikroba mesofil, yaitu

tumbuh baik pada suhu ruangan atau suhu kamar. Bakteri pathogen umumnya
mempunyai suhu optimum pertumbuhan sekitar 37OC, yang juga adalah suhu
tubuh manusia. Oleh karena itu suhu tubuh manusia merupakan suhu yang
baik untuk pertumbuhan beberapa bakteri pathogen. Mikroba perusak dan
pathogen umumnya dapat tumbuh pada kisaran suhu 4–66OC.
3. Nutrient
Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi
sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut
adalah: karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan
sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber
nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya
dapat menyebabkan kematian.Kondisi tidak bersih dan higinis pada
lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi
pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di
lingkungan seperti ini. Oleh karena itu, prinsip daripada menciptakan
lingkungan bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan meminimalisir
sumber nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali.
4. Oksigen
Mikroba mempunyai kebutuhan oksigen yang berbeda-beda untuk
pertumbuhannya. Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, mikroba
dibedakan atas 4 kelompok sebagai berikut:
a. Aerob, yaitu mikroba yang membutuhkan oksigen untuk
pertumbuhannya.
b. Anaerob, yaitu mikroba yang tumbuh tanpa membutuhkan oksigen.
c. Anaerob fakultatif, yaitu mikroba yang dapat tumbuh dengan atau tanpa
adanya oksigen.
d. Mikroaerofil, yaitu mikroba yang membutuhkan oksigen pada
konsentrasi yang lebih rendah daripada konsentrasi oksigen yang normal
di udara. Mikroba perusak pangan sebagian besar tergolong aerob, yaitu
membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya, kecuali bakteri yang
dapat tumbuh pada saluran pencernaan manusia yang tergolong anaerob
fakultatif.
5. Tekanan osmosis
 Suatu tekanan osmose akan sangat mempengaruhi bakteri jika tekanan
osmose lingkungan lebih besar (hipertonis) sel akan mengalami plasmolisis.
Sebaliknya tekanan osmose lingkungan yang hipotonis akan menyebabkan sel
membengkak dan juga dapat mengakibatkan rusaknya sel. Olah karena itu
dalam mempertahankan hidupnya, sel bakteri harus berada pada tingkat
tekanan osmose yang sesuai, walaupun sel bakteri memiliki daya adaptasi,
perbedaan tekanan osmose dengan lingkugannya tidak boleh terlalu besar.
6. Sterilitas
Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami bakteri yang
dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain (Eny, 2014).

2.4 Jenis-Jenis Media Mikroba

A. Berdasarkan Bentuknya
Bentuk media ada tiga macam yang dapat dibedakan dari ada atau
tidaknya bahan tambahan berupa bahan pemadat seperti agar-agar atau
gelatin. Bentuk media tersebut yaitu:
1. Media Padat
Media padat merupakan media yang mengandung banyak agar atau zat
pemadat kurang lebih 15% agar sehingga media menjadi padat. Media ini
dapat dibedakan menjadi tiga jenis menurut bentuk dan wadahnya yaitu,
media tegak, media miring, dan media lempeng. Media tegak
menggunakan tabung reaksi yang ditegakkan sebagai wadahnya, media
miring menggunakan tabung reaksi yang dimiringkan, sedangkan media
lempeng menggunakan petridish (plate) sebagai wadahnya. Media ini
umumnya digunakan untuk pertumbuhan koloni bakteri atau kapang.
2. Media semi padat
Media semi padat atau semi cair merupakan media yang mengandung
agar kurang dari yang seharusnya kurang lebih 0,3% - 0,4% sehingga
media menjadi kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair. Umumnya
 digunakan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan air dan
hidup anerobik dan untuk melihat pergerakan mikroba.

3. Media cair
Media cair merupakan media yang tidak ditambahi bahan pemadat,
umumnya digunakan untuk pertumbuhan mikroalga serta mikroba lain,
terutama bakteri dan ragi (Sulastri, 2017).
B. Berdasarkan Komposisi/Susunannya
Berdasarkan komposisinya media di bagi atas :
1. Media alami/non sintetis merupakan media yang disusun dari bahan-bahan
alami dimana komposisinya yang tidak dapat diketahui secara pasti dan
biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya seperti: kentang, tepung,
daging, telur, ikan sayur, dsb. Contohnya: Tomato juice agar.
2. Media semi sintesis merupakan media yang disusun dari bahan-bahan
alami dan bahan-bahan sintesis. Contohnya: Kaldu nutrisi disusun dari
:Pepton 10,0 g, Ekstrak daging 10,0 g, NaCl 5,0 g, dan Aquadest 1000
ml.
3. Media sintesis, yaitu media yang disusun dari senyawa kimia yang jenis
dan takarannya diketahui secara pasti. Contohnya : Mac Conkey Agar
(Sulastri, 2017).
C. Berdasarkan Fungsinya
Berdasarkan fungsinya, media dapat dibedakan menjadi beberapa
yaitu:
1. Media Basal (media dasar) adalah media yang digunakan sebagai bahan
dasar untuk membuat media lain yang lebih kompleks. Media ini dapat
mendukung pertumbuhan hampir semua jenis mikrobia, contohnya adalah
nutrient broth, kaldu pepton, dsb.
2. Media diferensial adalah media yang bila ditumbuhi oleh mikroba yang
berbeda, mikroba tersebut akan tumbuh dengan ciri khusus sehingga dapat
 dibedakan dengan jenis lainnya.. Contohnya: Media Triple Sugar Iron
Agar (TSIA), Media Sulfit Indol Motility (SIM), dsb.
3. Media selektif adalah media yang memungkinkan suatu jenis mikroba
tumbuh dengan pesat, sementara jenis mikroba yang lain terhambat.
Contohnya: Media Salmonella Shigella Agar (SSA), Thiosulphate Citrate
Bile Salt (TCBS), dsb.
4. Media diperkaya (enrichment) adalah media yang dirancang untuk
mendukung pertumbuhan mikroorganisme. Media tersebut memiliki
konstituen nutrisi yang mendorong pertumbuhan mikroba tertentu.
Contohnya: kaldu selenit, atau kaldu tetrationat untuk memisahkan bakteri
Salmonella thyposa dari tinja.
5. Media pengkayaan adalah media ini umumnya mengandung bahan-bahan
tertentu yang di satu pihak dapat menghambat pertumbuhan bakteri
tertentu, tetapi di lain pihak sebaliknya dapat menunjang pertumbuhan
bakteri tertentu lainnya. Misalnya media muller-kauffman mengandung
natrium tetrationat yang menunjang pertumbuhan salmonella tetapi
menghambat pertumbuhan Escherichia.
6. Media uji (identifikasi) adalah media yang digunakan untuk identifikasi
mikroba, medium litmus milk. Umumnya ditambah dengan substansi
tertentu yang menjadi indicator.
7. Medium umum, media yang ditambahkan bahan-bahan yang bertujuan
menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum. Contoh Nutrien Agar
(NA) untuk menstimulasi pertumbuhan bakteri, Potato Dextose Agar
(PDA) untuk menstimulir pertumbuhan fungi.
8. Medium khusus(spesifik), merupakan medium untuk menentukan tipe
pertumbuhan mikroba dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan-
perubahan kimia tertentu misalnya, medium tetes tebu
untuk Saccharomyces cerevisiae.
9. Medium penguji (Assay medium), yaitu medium dengan susunan tertentu
yang digunakan untuk pengujian senyawa-senyawa tertentu dengan
 bantuan bakteri misalnya medium untuk menguji vitamin-vitamin,
antibiotika dan lain-lain.
10. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang
digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan,
misalnya medium untuk menghitung jumlah bakteri E. coli air sumur
(Sulastri, 2017).
2.5 Macam-Macam Media Mikroba
1. Lactose Broth
11. Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran
koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya
(pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari
fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef
menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa
menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk
organisme koliform (Sulastri, 2017).

Gambar: 2.1 Lactose broth

a. Prosedur pembuatan media
Siapkan alat dan bahan. Timbang pepton powder sebanyak 1.53 gr
menggunakan neraca analitik, setelah ditimbang diletakan dalam
Erlenmeyer. Larutkan pepton powder dengan aquadest sebanyak 60 ml,
homogenkan. Panaskan diatas hot plate dengan suhu 150°c jangan
sampai mendidih karena dapat merusak mikroorganisme. Timbang
sebanyak 0.2 gr laktosa powder. Masukkan laktosa powder pada
erlenmeyer yang telah di labeli. Masukkan pepton water pada erlenmeyer
sebanyak 20 ml, Homogenkan. Masukkan larutan yang telah
 dihomogenkan ke dalam tabung reaksi yang sebelumnya telah diisi
dengan tabung durham secara terbalik. Sterilkan menggunakan api
Bunsen, kemudian tutup menggunakan kapas. Bungkus media
menggunakan kertas sebelum di sterilisasi. Sterilkan menggunakan
autoclave dengan suhu 121°c selama 15 menit. Masukkan media kedalam
lemari pendingin

2. EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)

Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung
laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan
laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang
memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap
dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya
tidak berwarna (Bahrudin, 2016).

Gambar: 2.2 Media EMBA

a. Prosedur pembuatan media
Timbang EMB Agar sebanyak 4,44 gr, kemudian masukkan ke dalam
gelas kimia. Ukur 60 mL aquadest dalam gelas ukur, kemudian masukkan
ke dalam gelas kimia. Homogenkan. Pindahkan larutan yang telah
homogenkan ke gelas Erlenmeyer. Tutup mulut erlenmeyer. Selanjutnya
panaskan di atas hot plate Bungkus erlenmeyer menggunakan kertas
hingga menutupi seluruh permukaan erlenmeyer. Sterilisasi menggunakan
autoclave selama 15 menit dengan suhu 1210C. Sterilkan erlenmeyer dan
cawan petri dengan cara didekatkan pada api (bunsen yang sudah
 disiapkan/dinyalakan). Tuang larutan media pada cawan petri Tunggu
hingga padat, diberi label dan bungkus kembali dengan kertas, kemudian
pindahkan ke dalam lemari pendingin.
3. Mac Conkey Agar (MCA)
Mac Conkey Agar adalah salah satu jenis media yang digunakan untuk
identifikas mikroorganisme. MCA termasuk kedalam media selektif dan
deferensial bagi mikroba. Jenis mikroba tertentu akan membentuk koloni
dengan ciri tertentu yang khas apabila ditanam pada media tersebut. Bakteri
yang tumbuh pada MCA adalah bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa
dan biasanya bersifat patogen. Golongan bakteri ini contohnya Salmonella
dan Shigella, Eschencia Coli, dan Enterobacter (Gunariah, 2013).

Gambar: 2.3 Media MCA

a. Prosedur pembuatan media
Timbang MCA Agar sebanyak 7,2 gr kemudian masukkan ke dalam
gelas kimia. Ukur 60 mL aquadest dalam gelas ukur, kemudian masukkan
ke dalam gelas kimia. Homogenkan. Pindahkan larutan yang telah
homogenkan ke gelas Erlenmeyer. Tutup mulut erlenmeyer. Selanjutnya
panaskan di atas hot plate. Bungkus erlenmeyer menggunakan kertas
hingga menutupi seluruh permukaan erlenmeyer. Sterilisasi menggunakan
autoclave selama 15 menit dengan suhu 1210C. Sterilkan erlenmeyer dan
cawan petri dengan cara didekatkan pada api (bunsen yang sudah
disiapkan/dinyalakan). Tuang larutan media pada cawan petri. Tunggu
hingga padat, diberi label dan bungkus kembali dengan kertas, kemudian
pindahkan ke dalam lemari pendingin.
4. Simon Citrat Agar
 Media ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Media
Simmon’s Citrate Agar merupakan medium sintetik dengan trinatrium sitrat
sebagai satu-satunya sumber karbon, amonium (NH4+) sebagai sumber
nitrogen dan brom timol biru sebagai indikator pH. Bila mikroorganisme
mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium
biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna
medium dari hijau menjadi biru. Contoh bakteri pada uji citrate adalah
Lactobacillus dextranicum.
Komposisi: Ammonium dihydrogen phosphate (1), di-Potassium
hydrogen phosphate (1), Sodium chloride (5), Sodium citrate (2), Magnesium
sulfate (0,2), Bromothymol blue (0,08), Agar-agar ( 13) (Triana, 2018).

Gambar: 2.4 Media SCA

a. Prosedur pembuatan media
Timbang SCA Agar sebanyak 7,8 gr kemudian masukkan ke dalam
gelas kimia. Ukur 60 mL aquadest dalam gelas ukur, kemudian masukkan
ke dalam gelas kimia. Homogenkan. Pindahkan larutan yang telah
homogenkan ke gelas Erlenmeyer. Tutup mulut erlenmeyer. Selanjutnya
panaskan di atas hot plate. Bungkus erlenmeyer menggunakan kertas
hingga menutupi seluruh permukaan erlenmeyer. Sterilisasi menggunakan
autoclave selama 15 menit dengan suhu 1210C. Sterilkan erlenmeyer dan
cawan petri dengan cara didekatkan pada api (bunsen yang sudah
disiapkan/dinyalakan). Tuang larutan media pada cawan petri. Tunggu
 hingga padat, diberi label dan bungkus kembali dengan kertas, kemudian
pindahkan ke dalam lemari pendingin.
5. Gula-gula (Karbohidrat)
Media gula-gula digunakan untuk mengetahui apakah kuman
memfermentasi masing-masing gula diatas membentuk asam. Media gula-
gula ini terpisah dalam 5 tabung yang berbeda dan media yang digunakan
adalah masing-masing gula dengan konsentrasi 1% dalam pepton. Didalam
media gula-gula ditambahkan indikator phenol red.
Komposisi dari media gula-gula Air pepton 6 gr, NaCl 3 gram, Aquadest
600 ml, Gula glukosa 1 gram (Triana, 2018).

Gambar: 2.5 Media Gula-Gula

a. Prosedur pembuatan media
Siapkan alat dan bahan. Timbang pepton powder sebanyak 1.53 gr
menggunakan neraca analitik, setelah ditimbang diletakan dalam
Erlenmeyer. Larutkan pepton powder dengan aquadest sebanyak 60 ml,
homogenkan. Panaskan diatas hot plate dengan suhu 150°c jangan sampai
mendidih karena dapat merusak mikroorganisme. Timbang glukosa
powder, laktosa powder, dan maltosa powder masing-masing sebanyak 0.2
gr. Masukkan setiap powder pada erlenmeyer yang telah di labeli sesuai
jenis gula. Masukkan pepton water pada setiap erlenmeyer sebanyak 20 ml,
Homogenkan. Masukkan larutan yang telah dihomogenkan ke dalam
tabung reaksi yang sebelumnya telah diisi dengan tabung durham secara
terbalik Sterilkan menggunakan api Bunsen, kemudian tutup menggunakan
kapas. Bungkus media menggunakan kertas sebelum di sterilisasi. Sterilkan
 menggunakan autoclave dengan suhu 121°c selama 15 menit. Masukkan
media kedalam lemari pendingin
6. Media SIM (Sulfide Indole Motility)
Media SIM adalah media differensial. Media ini digunakan untuk tes
kemampuan organisme untuk melakukan beberapa hal yaitu mengurangi
sulfur, menghasilkan indole dan berjalan melalui agar-agar. SIM umumnya
digunakan untuk membedakan anggota Enterobacteriaceae. Sulfur dapat
direduksi menjadi H2S (Hidrogen Sulfida) baik oleh katabolisme asam amino
sistem oleh desulfurase sistem enzim atau dengan pengurangan thiosulphate
dalam respirasi anaerobik. Jika hidrogen sulfida diproduksi maka warna hitam
akan terbentuk dimedia (Rachel Watson, 2012).

Gambar: 2.6 Media SIM

a. Prosedur pembuatan media
Timbang SIM Agar powder sebanyak 2.4 gr menggunakan neraca
analitik, setelah ditimbang diletakan dalam Erlenmeyer. Larutkan SIM
Agar powder dengan aquadest sebanyak 80 ml, homogenkan. Tutup
larutan menggunakan kapas dan berikan label. Panaskan larutan diatas hot
plate dengan suhu 300°c jangan sampai mendidih karena dapat merusak
mikroorganisme. Bungkus menggunakan kertas hingga menutupi seluruh
bagian erlenmeyer. Sterililasikan didalam autoclave dengan suhu 121°c
selama 15 Menit. Pindahkan media dalam tabung reaksi. Pada saat
menuang nyalakan bunsen agar tidak terkontaminasi bakteri lain. Masukan
kedalam lemari pendingin.
7. Media Urease
 Media urea digunakan untuk difrensiasi mikroorganisme yang dapat
menurunkan/bereaksi urea. Prinsipnya urea dihidrolisis menjadi karbon
diokside dan ammoniak oleh enzim urase. Ammonia yang dibentuk kemudian
membuat media menjadi alkali, reaksi ini dideteksi menggunakan indicator
phenol red yang mengubah warna kuning media menjadi ungu/merah.
Kandungan media urea Pepton dari danging, glukosa, NaCl, Pottasium
dihydrogen phosphate, phenol red, agar-agar (Anindya. 2013).

Gambar: 2.7 Media Urea

a. Prosedur pembuatan media
Timbang urea Agar powder sebanyak 5 gr menggunakan neraca
analitik, setelah ditimbang diletakan dalam Erlenmeyer. Larutkan urea
Agar powder dengan aquadest sebanyak 100 ml, homogenkan. Tutup
larutan menggunakan kapas dan berikan label. Panaskan larutan diatas hot
plate dengan suhu 300°c jangan sampai mendidih karena dapat merusak
mikroorganisme. Bungkus menggunakan kertas hingga menutupi seluruh
bagian erlenmeyer. Sterililasikan didalam autoclave dengan suhu 121°c
selama 15 Menit. Pindahkan media dalam tabung reaksi. Pada saat
menuang nyalakan bunsen agar tidak terkontaminasi bakteri lain. Masukan
kedalam lemari pendingin.
8. Media Blood Agar Plate (BAP)
Merupakan media pertumbuhan bakteri yang dapat membedakan
bakteri pathogen berdasarkan efek exotoksin hemolitik bakteri pada sel darah
merah. Pada media ini biasa diinokulasikan sampel swab tenggorokan untuk
 mendeteksi keberadaan grup A. Streptococcus Hemolitik beta dan jenis yang
patogen itu Streptococcus phyogenes.
Komposisi Blood Agar Plate (BAP) yaitu mengandung trypton 15
Gram, Soy Peptone 5 Gram, Sodium Khlorida 10 gram, magnesium sulphate
3,8 gram, dan agar 15 Gram (Bahrudin, 2016).

Gambar: 2.8 Media BAP

a. Prosedur pembuatan media
Bubuk media Blood Agar Base ditimbang sebanyak 40 gram
kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca. Larutkan dengan 1000 ml
aquades pH ± 7 (netral) kemudian dihomogenkan menggunakan stirrer
magnetic. Botol kaca yang berisi media ditutup dengan tutup botol yang
dilapisi aluminum foil dan diikat dengan benang. Media disterilisasi
dengan autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit. Media yang telah
steril didinginkan hingga mencapai suhu 45-500C. Ditambahkan 5-7%
darah kambing/manusia. Media dituang ke dalam plate dan ditunggu
hingga padat. Setelah beku media siap digunakan
9. Media Brain Heart Infusion Broth (BHIB)
Adalah media cair untuk berbagai mikroorganisme baik yang Aerob
atau Anaerob. BHIB merupakan modifikasi dari media yang dikembangkan
oleh ilmuan Rosenow dan Hayden. Kandungan Buffer kalsium karbonat
cocok untuk kultur Streptococcus, Pneumococcus, dan Meningcoccus, media
ini sangat fleksibel dan mendukung pertumbuhan mikrooganisme menjadi
optimal (Sulastri, 2017).
 Gambar: 2.9 Media BHIB
a. Prosedur pembuatan media
Timbang BHIB powder sebanyak 5 gr menggunakan neraca analitik,
setelah ditimbang diletakan dalam Erlenmeyer. Larutkan urea Agar powder
dengan aquadest sebanyak 100 ml, homogenkan. Tutup larutan
menggunakan kapas dan berikan label. Panaskan larutan diatas hot plate
dengan suhu 300°c jangan sampai mendidih karena dapat merusak
mikroorganisme. Bungkus menggunakan kertas hingga menutupi seluruh
bagian erlenmeyer. Sterililasikan didalam autoclave dengan suhu 121°c
selama 15 Menit. Pindahkan media dalam tabung reaksi. Pada saat
menuang nyalakan bunsen agar tidak terkontaminasi bakteri lain. Masukan
kedalam lemari pendingin.
10. Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
TSIA digunakan untuk pengujian biokimia untuk membedakan
beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae yang
bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa kemudian membentuk
asam, sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif lain. Perbedaan
ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung
reaksi. Media ini memiliki 3 gula dalam kandungannya, yaitu glukosa,
laktosa, dan sukrosa, dengan konsentrasi 1% sukrosa, 1% laktosa, dan 0,1%
glukosa. Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat
dan keadaan asam yang terbentuk. Indikator pH, yaitu Phenol Red,
ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi
karbohidrat (Bahrudin, 2016).
 Gambar: 2.10 Media TSIA

a. Prosedur pembuatan media

Timbang TSIA powder sebanyak 5 gr menggunakan neraca analitik,
setelah ditimbang diletakan dalam Erlenmeyer. Larutkan urea Agar powder
dengan aquadest sebanyak 100 ml, homogenkan. Tutup larutan
menggunakan kapas dan berikan label. Panaskan larutan diatas hot plate
dengan suhu 300°c jangan sampai mendidih karena dapat merusak
mikroorganisme. Bungkus menggunakan kertas hingga menutupi seluruh
bagian erlenmeyer. Sterililasikan didalam autoclave dengan suhu 121°c
selama 15 Menit. Pindahkan media dalam tabung reaksi. Pada saat
menuang nyalakan bunsen agar tidak terkontaminasi bakteri lain. Masukan
kedalam lemari pendingin.

11. Media Nutrien Agar (NA)

Natrient Agar adalah medium yang diklasifisikan sebagai medium
sintetik Medium Natrient agar merupakan medium umum yang dapat
digunakan untuk mengkultivasi berbagai jenis bakteri. Dalam medium NA
terkandung pepton, yeast dan beef extract yang berfungsi sebagai sumber
nitrogen dan sumber karbon, sumber vitamin dan beberapa senyawa lain
untuk menyongkong pertumbuhan bakteri. Pada medium ini terkadang juga
ditambah dengan garam (NaCl) untuk menyeimbangkan tekanan osmotik sel
bakteri dan medium, agar bakteri yang akan ditumbuhkan tidak mati
(Nursalam, 2011).
 Gambar: 2.11 Media NA

a. Prosedur pembuatan media

Timbang NA Agar sebanyak 7,8 gr kemudian masukkan ke dalam
gelas kimia. Ukur 60 mL aquadest dalam gelas ukur, kemudian masukkan
ke dalam gelas kimia. Homogenkan. Pindahkan larutan yang telah
homogenkan ke gelas Erlenmeyer. Tutup mulut erlenmeyer. Selanjutnya
panaskan di atas hot plate. Bungkus erlenmeyer menggunakan kertas
hingga menutupi seluruh permukaan erlenmeyer. Sterilisasi menggunakan
autoclave selama 15 menit dengan suhu 1210C. Sterilkan erlenmeyer dan
cawan petri dengan cara didekatkan pada api (bunsen yang sudah
disiapkan/dinyalakan). Tuang larutan media pada cawan petri. Tunggu
hingga padat, diberi label dan bungkus kembali dengan kertas, kemudian
pindahkan ke dalam lemari pendingin.
2.6 Definisi Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan bakteri pada umumnya bertujuan untuk mempermudah dalam
pengamatan morfologi bakteri dengan bantuan mikroskop. Bakteri umumnya
tidak berwarna dan hamper tidak terlihat karena kurang kontras dengan air
dimana mereka mungkin berada. Pewarnaan sangat dibutuhkan untuk melihat
bakteri dengan sangat jelas baik untuk pengamatan intraseluler maupun morfologi
keseluruhan (Agus, 2011).
2.7 Tujuan Pewarnaan
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik
dan kimia dapat diketahui (Agus, 2011).
2.8 Jenis-Jenis Pewarnaan
A. Pewarnaan Sederhana
Pada pewarnaan sederhana apusan bakteri diwarnaai dengan suatu
pereaksi
Tunggal yang menghasilkan warna yang sangat kotras antar organisme
dengan latar belakangnya. Tujuan pewarnaan sederhana yaitu untuk
mengelusidasi morfologi dan susunan sel-sel bakteri. Pewarna-pewarna basa
yang paling sering digunakan yaitu metilen blue, Kristal violet, dan karbol
fuksin (Muldyadi. 2018).
Prosedur pewarnaan: siapkan apusan bakteri. Tempatkan kaca objek pada
baki pewarnaan dan genangi apusan dengan salah satu dari pewarna yang
diperintahkan dengan menggunakan waktu pajanan yang sesuai bagi masing-
masing pewarana: karbol fuksin 15-30 detik, Kristal violet 20-60 detik,
metilen blue 1-2 menit. Bilas apusan perlahan dengin air keran yang mengalir.
(Muldyadi. 2018).
B. Pewarnaan Differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti
pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Pereaksi yang digunakan terbagi
menjadi pewarna primer, senyawa pemucat, dan pewarna tanding.
1. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan bakteri gram positif
dan bakteri gram negatif berdasarkan sifat fisik dan kimia dinding sel
bakteri. Pewarnaan gram menggunakan pewarna utama Kristal Violet dan
pewarna tandingan Safranin. Keberhasilan metode ini sangat bergantung
pada dinding sel. Pewarnaan ini dapat membagi bakteri menjadi gram
 positif dan gram negatif berdasarkan kemampuannya untuk menahan
pewarna primer (kristal ungu) atau kehilangan warna primer dan
menerima warna tandingan (safranin) (Agus, 2011).
Prosedur kerja: buatlah apusan, selanjutnya keringkan dan lakukan
fiksasi dengan api Bunsen. Genangi apusan dengan Kristal violet selama
1 menit, bilas dengn air keran. Genangi dengan peluntur iodin selama 1
menit, bilas dengan air keran. Pucatkan dengan etil alcohol 95%, genangi
dengan safranin selama 45 detik, bilas dengan air keran. Keringkan
(Mulyadi, 2018).
Interpretasi hasil: Bakteri gram positif menunjukkan warna biru atau
ungu, sedangkan bakteri gram negatif menunjukkan warna merah
(Mulyadi, 2018).

Gambar: 2.12 Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif

2. Pewarnaan Tahan Asam
Pada pewarnaan bakteri asam menggunakan metode Ziehl-Neelsen
(juga disebut Hot Stain), bakteri tahan asam akan berwarna merah karena
menyerap pewarna karbol fuchsin yang dipanaskan, karena pada saat
pemanasan dinding sel bakteri yang memiliki banyak lemak membuka
sehingga pewarna dapat terserap. Namun tidak dapat dilunturkan dengan
asam alkohol karena pada saat suhu normal lemak pada dinding sel
bakteri kembali menutup, sehingga ketika diwarnai dengan pewarna
tandingan, yaitu Methylene Blue, warnanya tetap merah. Berbeda dengan
bakteri tidak tahan asam, ia akan menyerap pewarna tandingan yaitu
methylene blue sehingga berwarna biru.
 Pada metode Kinyoun-Gabbet, tidak perlu dilakukan pemanasan, maka
dari itu metode Kinyoun-Gabbet juga disebut Cold Stain. Metode
Kinyoun-Gabbet tidak perlu dilakukan dengan pemanasan karena pada
pewarna Kinyoun terdapat alkali fuchsin dengan konsentrasi yang tinggi,
sehingga walau tanpa pemanasan dapat menghilangkan lapisan lilin pada
dinding sel bakteri tahan asam. Komposisi Kinyoun antara lain: alkali
fuchsin, fenol, alkohol 95%, dan aquades. Sebagai pewarna tandingan
adalah Gabbet, yang memiliki komposisi antara lain : methylene blue,
asam sulfat 96%, alkohol murni, dan aquades. Sama seperti pada metode
Ziehl-Neelsen, bakteri tahan asam akan berwarna merah, sedangkan
bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Andiesta, 2017).
a. Prosedur Kerja
1. Ziehl Neelsen
Buat apusan dan biarkan hingga mengering. Fiksasi dengan api
bunsen. Genangi apusan dengan karbol fuksin diatas beker berisi
air pada lengpeng panas hangat, biarkan preparat diuapi selama 5
menit. Bilas dengan air keran, kemudian pucatkan dengan asam
alcohol. Genangi dengan metilen biru selama 2 menit, bilas dengan
air keran. Keringkan apusan (Mulyadi, 2018).
2. Kinyoun Gabbet
Buat apusan dan biarkan mengering. Fiksasi diatas api Bunsen.
Genangi dengan larutan kinyoun selama 3 menit, cuci dengan air
keran. Genangi apusan dengan larutan gabet selama 1 menit, cuci
dengan air keran. Keringkan apusan (Mulyadi, 2018).
b. Interpretasi Hasil
Merah : Bakteri tahan asam
Biru : Bakteri tidak tahan asam
 Gambar: 2.13 Interpretasi Hasil BTA
C. Pewarnaan Struktural
Pewarnaan struktural ditujukan untuk melihat bagian tertentu bakteri. Yang
termasuk dalam pewarnaan struktural ialah :
1. Pewarnaan Spora
Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus
Bacillus dan genus Clostridium. Secara sederhana, dapat dikatakan
bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan
dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan
tambahan. Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini,
bakteri tersebut dapat bertahan pada kondisi yang ekstrim.Menurut
Pelczar (1986) bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup
dan mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi,
dan spora terbentuk melalui sintesis protoplasma baru di dalam
sitoplasma sel vegetatifnya.
Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri
diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora.
Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan tersebut adalah dengan
penggunaan larutan Hijau Malakit 5%, dan untuk memperjelas
pengamatan, sel vegetatif juga diwarnai dengan larutan Safranin 0,5%
sehingga sel vegetatif ini berwarna merah, sedangkan spora berwarna
hijau.
Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan
posisi spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat diidentifikasi. Namun
ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses
 pewarnaannya melibatkan proses pemanasan, yaitu; spora dipanaskan
bersamaan dengan zat warna tersebut sehingga memudahkan zat warna
tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri
(Andiesta, 2017).
a. Prosedur kerja
Buat apusan dan biarkan hingga mengering. Genangi apusan
dengan malakit hijau dan tempatkan diatas beker berisi air yang
ditempatkan di atas lepeng panas selama 2-3 menit. Dinginkan dan
bilas dengan air keran. Genangi dengan safranin selama 30 detik,
bilas dengan air keran. Dinginkan apusan
b. Interpetasi hasil
Pewarnaan Spora menggunakan metode Schaeffer-Fulton. Pada
pewarnaan ini, spora berwarna hijau dan vegetatif berwarna merah

Gambar: 2.14 Interpretasi Hasil Pewarnaan Spora

2. Pewarnaan Kapsul
Beberapa jenis bakteri mengeluarkan bahan-bahan yang amat berlendir
dan lengket pada permukaan selnya, dan melengkungi dinding selKapsul
dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel, tapi dapat berfungsi
sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis (baik
dalam tubuh inang maupun dialam bebas) atau perlindungan terhadap
dehidrasi. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis,
tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat
ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan. Pada beberapa jenis bakteri
adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua kapsul bakteri
tampaknya dapat larut dalam air.
Pewarnaan kapsul tidak dapat dilakukan sebagaimana melakukan
pewarnaan sederhana, pewarnaan kapsul dilakukan dengan
menggabungkan prosedur dari pewarnaan sederhana dan pewarnaan
negatif. Masalahnya adalah ketika kita memanaskan prepat dengan suhu
yang sangat tinggi kapsul akan hancur, sedangakan apabila kita tidak
melakukan pemanasan pada preparat, bakteri akan tidak dapat menempel
dengan erat dan dapat hilang ketika kita mencuci preparat. Pewarnaan
kapsul menggunakan pewarna Kristal Violet dan sebagai pelunturnya
adalah Copper Sulfate. Kristal violet memberikan warna ungu gelap
terhadap sel bakteri dan kapsul. Namun kapsul bersifat nonionic,
sehingga pewarna utama tidak dapat meresap dengan kuat pada kapsul
bakteri. Copper sulfate bertindak sebagai peluntur sekaligus counterstain,
sehingga mengubah warna yang sebelumnya ungu gelap menjadi biru
muda atau pink. Maka dari itu pada pewarnaan kapsul, kapsul akan
transparan sedangakan sel bakteri dan latar belakangnya akan berwarna
biru muda atau pink (Andiesta, 2017).
a. Prosedur kerja
Siapkan objek gelas kemudian berikan beberapa tetes Kristal
violet. Dengan menggunakan teknik steril tambahkan tiga ose penuh
biakan dan homogenkan dengan ose inakulasi. Buat apusan yang tipis
dan biarkan selama 5-7 menit. Bilas apusan dengan tembaga sulfat
20%, kemudian keringkan (Mulyadi, 2018).
b. Interpretasi hasil
Kapsul akan transparan sedangakan sel bakteri dan latar
belakangnya akan berwarna biru muda atau pink
Gambar: 2.14 Interpretasi Hasil Pewarnaan Spora
 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Media adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (nutrient) yang
dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Media ini dapat dikelompokan menjadi
beberapa yaitu media berdasarkan bentuk, fungsi, dan komposisinya. Pewarnaan
bakteri pada umumnya bertujuan untuk mempermudah dalam pengamatan
morfologi bakteri dengan bantuan mikroskop. Bakteri umumnya tidak berwarna
dan hamper tidak terlihat karena kurang kontras dengan air dimana mereka
mungkin berada. Pewarnaan bakteri terbagi menjadi pewarnaan sederhana,
differensial, dan structural.