LAPORAN PRAKTIKUM

IDENTIFIKASI GRAM BAKTERI DENGAN METODE

PENGECATAN

Nama : Utari Permadani

NIM: 1903020004

LABORATORIUM BIOPROSES
PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2021
 LEMBAR PERTANYAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Utari Permadani

NIM : 1903020004

Menyatakan bahwa laporan ini merupakan Karya Original (tidak mengandur unsur plagiat)
yang dibuat untuk memenuhi tugas Mata Kuliah Praktikum Industri Bioproses. Bilamana di
kemudian hari ditemukan ketidaksesuaian dengan pernyataan yang saya buat, maka saya
bersedia menerima konsenkuensi yaitu mendapat nilai D dan mengulang di semester
berikutnya.

Purwokerto, Mei 2021

Utari Permadani

i
 DAFTAR ISI
Judul ..................................................................................................................................

Lembar pernyataan ......................................................................................................... i

Daftar Isi ............................................................................................................................ ii

I. Tujuan Percobaan ................................................................................................. 1

II. Landasan Teori ..................................................................................................... 1

III. Metode Percobaan ................................................................................................ 3

III.1. Alat dan Bahan .............................................................................................. 3

III.2. Cara Kerja ...................................................................................................... 3

IV. Data Pengamatan .................................................................................................. 4

IV.1. Data Pengamatan .......................................................................................... 4

V. Pembahasan .......................................................................................................... 5

VI. Kesimpulan ........................................................................................................... 8

VII. Daftar Pustaka ...................................................................................................... 8

ii
 IDENTIFIKASI GRAM BAKTERI
I. Tujuan
1. Mahasiswa menguasai teknik pemindahan bakteri secara aseptis
2. Mahasiswa dapat mengidentifikasi jenis gram pada bakteri
3. Memperkenalkan prinsip-prinsip mikroskop, bagian-bagian mikroskop serta cara
menanganinya.

II. Tinjauan Pustaka

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada
bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan
pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus,
sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spirul hanya
dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat
dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat
menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan
ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Jawetz, 2005).
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri). Meliputi: dinding sel,
membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu). Meliputi kapsul, flagelum,
pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora.
Staphylococcus adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada
yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach
menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu Staphylococcus Aureus yang
berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa
karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah
agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15-45° dan
lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15% dan menghasilkan enzim
coagulase. Selain itu, biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan
furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat

1
darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan
keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga
menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Lubis, 2007).
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay,1994)
Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan
sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis
yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari
pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri.
Menurut Hadioetomo (1991), dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
- Zat warna utama (violet kristal)
- Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama.
- Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
- Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-
sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan
struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai
dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding
sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori
dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap
menahan warna biru (Fitria, 2009).

2
Tabel 1. Perbedaan Relatif Sifat Bakteri Gram Positive dan Gram Negative
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negative (-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi
4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik
Manurung (2010)

III. Metode Percobaan

III.1. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah rak tabung, tabung reaksi
tersumbat, lub inokulasi, termometer, pH meter, mikroskop, pipet tetes, ose, lampu spirtus,
beaker glass, kaca objek, kaca tutup.
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah kaldu nutrien, agar iring,
NaOH 0,1 N, HCl 0,1 N, biakkan murni mikroba, larutan cat safranin atau cristal violet,
larutan cristal violet (gram A), larutan lugol (gram B), larutan alkohol/aceton (gram C),
larutan cat safranin (gram D).
III.2. Cara kerja

Dibersihkan gelas objek

dengan alkohol kemudian
dioleskan diatas lampu spirtus

Diambil 1 ose biakan dengan

alkohol secara aseptis pada
permukaan gelas sekitar 1 cm

Dikeringkan sebentar,
kemudian difiksasi diatas
lampu spirtus

3
 Ditetesi dengan kristal violet
2-3 tetes lalu didiamkan
selama 1 menit

Dicuci dengan air mengalir

lalu dikeringkan

Ditetesi larutan lugol iodine,

dibiarkan 1 menit lalu cuci
dengan air mengalir

Dicuci dengan alkohol selama

30 detik, lalu dibilas dengan
air mengalir

Ditetesi larutan safranin

selama 2 menit lalu dicuci
dengan air mengalir dan
dikeringkan

Diamati dengan mikroskop

IV. Data Pengamatan

IV.1 Data pengamatan
Pengamatan Hasil pengamatan
Diambil bakteri 1 ose ke permukaan
kaca preparat yang sudah disterilkan
dan dikeringkan.
Diteteskan kristal violet sampai
menutupi bakteri pada permukaan
preparat, didiamkan selam 1 menit lalu
dicuci menggunakan air mengalir.

4
 Lalu ditetesi dengan lugol iodine,
didiamkan selama 1 menit dan dicuci
dengan air mengalir.
Diteteskan dengan alkohol, didiamkan
selama 30 detik lalu dicuci dengan air
mengalir.
Lalu ditetesi safranin sampai mentupi
bakteri dan didiamkan selama 2 menit
lalu dicuci dengan air mengalir.
Diamati dengan mikroskop
pembesaran kuat dengan minyak
emersi, bakteri gram positif berwarna
ungu (violet), sedangkan bakteri gram
negatif berwarna merah.

V. Pembahasan
Pewarnaan Gram (metode Gram) adalah suatu cara untuk mewarnai sel bakteri
menggunakan zat warna berupa Gram, untuk lebih mudah diamati dibawah mikroskop
untuk mengetahui sifat fisiologisnya. Empat bahan reaksi yang digunakan untuk
pewarnaan Gram yaitu:
1. Carbol gentian violet, pewarna pertama (warna ungu).
2. Iodium, pewarna untuk mempertajam pewarna pewarna pertama (suatu
kompleks dengan crystal violet).
3. Alkohol, penghilang warna.
4. Safranin, suatu counterstain.
Setelah melakukan berbagai proses pengecatan diatas maka bakteri dapat dibagi
menjadi dua kategori utama yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

5
Bakteri Gram positif adalah bakteri yang tahan terhadap alkohol sehingga tetap
mengikat warna cat pertama dan tidak mengikat zat kontras sehingga bakteri akan
berwarna ungu. Sedangkan bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak tahan
terhadap alkohol sehingga warna cat pertama dilunturkan dan bakteri mengikat
warna kontras sehingga tampak merah.
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, dimana
sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan
menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan
teliti. Pewarnaan akan menyebabkan bakteri-bakteri tersebut kontras berwarna dengan
sekelilingnya, sehingga akan terlihat jelas.
Pada pewarnaan gram, sampel yang digunakan adalah bakteri Bascillus sp.
Untuk pewarnaan bakteri secara langsung, digunakan empat larutan pewarna yaitu
Carbol gentian violet, Iodium, Alkohol, safranin. Hasil yang didapatkan setelah diamati
dengan mikroskop dengan perbesran 40x-100x didapatkan dari bakteri Bascillus sp.
adalah bakteri gram positif. Hal ini ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada
pewarnaan tahap akhir menggunakan Safranin pada bakteri bascillus sp. dan berbentuk
batang/basil. Bascillus sp. merupakan salah satu bakteri berbentuk batang (basil) yang
termasuk Gram positif karena Bascillus sp. dapat menahan zat pewarna ungu (crystal
violet) ketika dicuci dengan zat penghilang warna. Sehingga warna tetap ungu ketika
ditetesi pewarna safranin. Pada bakteri gram postif akan terbentuk persenyawaan
kompleks Kristal yodium-violet ribonukleat yang tidak larut dalam larutan pemucat
alkohol karena sebagian besar dinding sel bakteri gram positif terdiri dari
peptidoglikan. Penambahan zat pewarna safranin tidak menyebabkan perubahan warna
pada bakteri Gram positif karena persenyawaan Kristal violet–yodium tetap terikat
pada dinding sel.
Akan tetapi pada pengamatan Bascillus sp. terlihat juga bakteri dengan bentuk
berbeda yang merupakan kontaminan. Adanya kontaminan ini kemungkinan
disebabkan pada saat pemindahan isolat ke kaca objek terjadi kontaminasi karena
kurangnya pemanasan jarum ose pada saat pengambilan biakan sehingga masih ada
bakteri lain dari udara yang ikut dalam apusan atau telah terkontaminasinya isolat
bakteri yang digunakan.
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
6
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua
yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baketri gram negatif mempunyai dinding sel
tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Praktikum yang dilakukan kali ini adalah pewarnaan gram. Bakteri biakan
murni yang digunakan adalah bakteri yang telah diinokulasi pada praktikum
sebelumnya. Pada pewarnaan bakteri digunakan berbagai macam reagen atau pewarna
seperti kristal violet,lugol dan safranin. Langkah pertama yang dilakukan pada
praktikum ini adalah dibersihkan terlebh dahulu kaca objek dengan alkohol kemudian
dipijar diatas lampu spirtus. Kemudian diambil biakan mikroba dengan menggunakan
ose secara aseptis, diratakan diatas kaca objek kira-kira 1 cm. Setelah itu dikeringkan
preparat tersebut lalu difiksasi. Setelah dingin, preparat ditetesi dengan kristal violet
sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringkan. Penambahan kristal violet diteteskan pada objek dan didiamkan selama 1
menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel
bakteri. Lalu ditetesi dengan larutan luugol iodine 2-3 tetes dan didiamkan selama 1
menit, penambahan lugol bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi
semakin lebih kuat.
Selanjutnya, diteteskan alkohol kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah
itu, kaca objek dibilas dengan aquades mengalir hingga warnanya hilang. Alkohol
berfungsi untuk membilas kelebihan zat warna pada sel bakteri. Kemudian, diteteskan
safranin kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah dikeringkan, preparat tersebut
diletakkan pada meja mikroskop untuk selanjutnya diamati morfologi dari bakteri
tersebut.

Gambar V.1 bakteri pembesaran 40x Gambar V.2 bakteri pembesaran 100x
Dari hasil yang diperoleh, maka bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan pewarna metil violet dalam metode pewarnaan gram. Setelah alkohol,
bakteri gram positif mempertahankan warna ungu tua, sedangkan bakteri gram negatif

7
 tidak. Bakteri gram positif akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negatif akan tampak merah muda

VI. Kesimpulan
1. Pada pewarnaan bakteri ada bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram
postif merupakan bakteri yang mampu menahan kompleks pewarna primer carbol
gentian violet sampai akhir pewarnaan, sehinga bakteri tetap berwarna ungu/biru,
karena bakteri garam postif memilki dinding sel berupa petidoglikan yang tebal.
Sedangkan bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak tahan terhadap alkohol
sehingga warna cat pertama dilunturkan dan bakteri mengikat warna kontras
sehingga tampak merah.
2. Morfologi bakteri antara lain memiliki kapsul, dinding sel, membrane sel, pili,
flagella, kromosom, plasmid, ribosom.
3. Berdasarkan berntuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar,yaitu:
a. Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan
mempunyai beberapa variasi sebagai berikut: Monococcus, Diplococcus,
Tetracoccus, Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus.
b. Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder,
dan mempunyai variasi sebagai berikut: Diplobacillus,Streptobacillus.
c. Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai
variasi sebagai berikut: Vibrio, Spiral.

VII. Daftar Pustaka

Andri T, dkk. 2017. Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar Pewarnaan Gram.
Fakultas Teknologi Pertanian. Universitas Jambi. http://andri-
madani.blogspot.com/2017/05/laporan-praktikum-pewarnaan-gram.html
(diakses pada 20 Mei 2021).
Daris, dkk. 2011. Laporan Praktikum Mikrobologi Pewarnaan Gram dan Pengamatan
Morfologi Bakteri. Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Surakarta. https://docplayer.info/54831047-Laporan-praktikum-mikrobiologi-
pewarnaan-gram-dan-pengamatan-morfologi-bakteri.html (Diakses pada 20
Mei 2021).
8
Rudi, L. 2010. Penuntun Dasar-dasar Pemisahan Analitik. Kendari: Universitas
Haluoleo.