IDENTIFIKASI BAKTERI MENGGUNAKAN 16S rDNA

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER

OLEH:
RIZFI FARIZ PARI
P051140031/BTK

BIOTEKNOLOGI
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014

1.
1.1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang tergolong sebagai biomolekul utama penyusun setiap

organisme, termasuk bakteri. Organisme memiliki DNA kromosomal dan ekstrakromosomal.

DNA kromosomal adalah DNA yang terletak didalam inti sel atau nucleus, berbentuk linier
dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon.. DNA ekstrakromosomal adalah DNA yang
terletak di mitokondria dan kloroplas, berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein
histon. DNA pada organisme prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,
sedangkan DNA pada organisme eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon.
(Lewin, 2004)
Isolasi DNA bakteri dari daging yang busuk diawali dengan perusakan dinding sel yang
bisa dilakukan dengan cara mekanis, kimia, atau enzimatis. DNA pada bakteri terletak di
nucleus, mitokondria dan kloroplas, sehingga proses dilanjutkan dengan melisis sel. Bahanbahan sel yang relative lunak dapat dilisis dengan menggunakan enzim didalam medium
buffer nonosomatik, sedangkan bahan sel yang lebih kasar dilisis dengan detergen yang kuat
seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Sel yang telah dilisis
dibersihkan dari hasil lisisnya dengan sentrifugasi. Hasil sentrifugasi belum diyakini bersih
dari pengotor protein dan RNA. Oleh karena itu, protein yang tersisa di presipitasi dengan
menggunakan fenol atau pelarut organic seperti kloroform dan dihancurkan secara enzimatis
dengan proteinase. RNA dibersihkan dengan menggunakan RNAse. DNA kemudian
dibersihkan dari sisa-sisa pengotor dengan menggunakan ammonium asetat dan alcohol atau
dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl. (Albert, et al., 2002)
DNA yang sudah diisolasi diidentifikasi dengan metode polymerase chain reaction
(PCR). PCR adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida
diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. PCR melibatkan banyak siklus yang
masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA
templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan
(extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase. Setelah
amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel agarose dengan
buffer tris-asetat-EDTA (TAE) dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan
dengan bromida etidium. (Meltzer, 2006)
Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan
(templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan
1

molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang
primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan
dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target,
sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3.
Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses
pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan
urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester
antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses
penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah
5 ke 3 dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan
dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat. (Meltzer,
2006)
1.2

Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mempelajari proses isolasi DNA genom bakteri

dan identifikasi DNA bakteri dari daging ayam busuk dan daging kambing busuk.
2.

2.1

METODOLOGI

Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar Universitas Institut

Pertanian Bogor
2.2

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum identifikasi bakteri adalah mortar, spatula,

pisau, tabung sentrifuge, sentrifuge kecepatan tinggi berpendingin, tabung mikro, neraca
analitik, pipet mikro, penangas air, spektrofotometer UV-VIS, cetakan gel, sisir, erlenmeyer,
sudip, gelas piala, gelas ukur, tube PCR, microwave, parafilm, power supply, perangkat
elektroforesis, UV Transilluminator dan kamera, mesin thermocycler /PCR, dan mesin DNA
speed vac.

Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi bakteri dalam praktikum ini adalah daging
ayam busuk, daging kambing busuk, nitrogen cair, buffer lisis yang mengandung proteinase
K, es, NaCl 5N, RNAse, isopropanol, EtOH 70%, ddH 2O, agarose 1%, buffer TAE, loading
dye, marker , ethidium bromide (EtBr), ddH2O, Taq DNA polymerase, buffer taq 10X,
dNTPs, primer 16S dengan 63 F dan 1387 R
2.3
2.3.1

Cara Kerja
Isolasi Genom Bakteri dari Ayam busuk dan Kambing busuk
Sampel bakteri yang diambil dari daging ayam busuk dan daging kambing busuk

sebanyak 0,05 gram digerus dalam nitrogen cair dengan menggunakan mortar sampai
berbentuk serbuk berwarna putih. Sampel dimasukkan kedalam tube yang berisi buffer lisis
yang mengandung proteinase K sebanyak 350 l. Sampel kemudian diinkubasi selama 15
menit pada suhu 550C dan dibolak-balik (invert) setiap 5 menit. Setelah itu, sampel
didinginkan di dalam es selama 10 menit, kemudian ditambahkan NaCl sebanyak 150 l dan
dibolak-balik. Sampel dimasukkan kembali ke dalam es selama 5 menit. Sampel kemudian
dimasukkan kedalam unit sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan putaran 10.000
rpm. Supernatant dari hasil sentrifugasi diambil dan ditambahkan 4 l RNAse. Sampel
diinkubasi selama 15 menit pada suhu 370C. Sampel kemudian ditambahkam dengan
isopropanol sebanyak 350 l dan dibolak-balik sebanyak 6 sampai 8 kali. Sampel
dimasukkan kedalam sentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.
Supernatant hasil sentrifugasi dibuang, kemudian dimasukkan 500 l EtOH 70% kedalam
tube. Sampel dimasukkan kedalam unit sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 10.000
rpm. Supernatant hasil sentrifugasi dibuang, sedangkan tube yang berisi endapan dikeringkan
dengan unit vacuum drying selama 15 sampai 20 menit. Tube kemudian ditambahkan dengan
20 l ddH2O. Hasil isolasi didapatkan, kemudian diuji kondisi sampelnya dengan
elektroforesis.
2.3.2

Elekroforesis
Elektroforesis menggunakan agar yang dibuat dari campuran agarose dan 1% buffer

TAE dengan perbandingan 1:100, kemudian dipanaskan dengan microwave sampai

beningselama 2-3 menit. Gel agarose dimasukkan kedalam cetakan bersisir dan didinginkan.
Setelah gel agarose mengeras, gel dikeluarkan dari cetakan dan sisir. Sisir pada cetakan akan
3

membentuk sumur, tempat diinjeksikannya sampel. Gel yang sudah beku kemudian
dimasukkan dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 0.5x. Proses
elektroforesis gel agarose diawali dengan disiapkan seperangkat bak elektroforesis yang telah
berisi larutan TAE 0.5x. Selanjutnya gel agarosa yang telah memadat dimasukkan ke dalam
bak hingga gel terendam penuh.
Sampel yang akan di elektroforesis dicampur dengan loading buffer dengan
perbandingan 1:5 pada parafilm. Sampel sebanyak 5 l dicampurkan dengan loading dye
sebanyak 1,5 l. Setelah diresuspensi, sampel dimasukkan kedalam sumur elektroforesis.
Marker yang digunakan adalah 1 kb plus DNA ladder sebanyak 5 L. Setelah semua sampel
selesai diinjeksi maka alat elektroforesis dihubungkan pada power supply dan voltase diatur
pada 100 volt. Elektroforesis dihubungkan dengan sumber daya dan dinyalakan pada
tegangan 90 volt selama 30 menit. Setelah proses running selesai, gel dikeluarkan dari alat
elektroforesis kemudian direndam dalam larutan EtBr selama 20 menit, setelah itu dibilas
dengan akuades. Kemudian direndam lagi dengan larutan EtBr delama 5 menit dan dibilas
dengan menggunakan akuades. Selanjutnya gel di masukkan kedalam transluminator dan
DNA dilihat dengan bantuan sinar Ultra Violet (UV).
2.3.3

Spektrofotomoter
Sampel DNA sebanyak 5 l diencerkan dengan ddH2O sebanyak 695 l, sehingga

total larutannya menjadi 700 l. Blanko untuk pengukuran spektrofotometer menggunakan

ddH2O. Larutan sampel hasil pengenceran dan blanko dimasukkan kedalam kuvet, kemudian
diukur dalam spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
2.3.4

PCR

Sampel ditambahkan dengan larutan untuk PCR yang berisi taq DNA polymerase, buffer taq
polymerase, dNTP 0,2 mM, primer 16 S dengan 63 F dan 1387 R, dan ddH 2O. Amplifikasi
DNA dilakukan dengan menggunakan Perkin Thermocycler ABI-Biosystem. Program PCR
terdiri dari 1 siklus pada 94C selama 5 menit (PreDenaturasi); 40 siklus pada: 94C selama 1
menit (Denaturasi), 32C selama 3 menit (Annealing), 72C selama 2 menit (Ekstension); 1
siklus pada 72C selama 7 menit (Postekstension); diakhiri dengan inkubasi pada 25C.
Produk PCR kemudian dielektoforesis dengan agarose 1% (Promega) dan divisualisasikan di
atas UV transilumimator kemudian didokumetasikan dengan alat Geldoc.

2.3.5

Analisis

Polimorfisme dari pola pita yang terbentuk diukur kemiripan genetiknya berdasarkan ada
tidaknya pita. Rumus kemiripan genetik yang digunakan adalah kemiripan genetik Dice.
Klasterisasi dilakukan dengan Unweighted Pair Group With Arithmatic Mean (UPGMA)
yang dihitung melalui SHAN pada program NTSYSpc version 2.0.

3.
3.1

HASIL
Hasil Spektrofotometer

Sampel Bakteri
Kelompok no. 1
Kelompok no. 2
Kelompok no. 3
Kelompok no. 4
Kelompok no. 5
Kelompok no. 8

3.2

260
0,045
0,035
0,026
0,024
0,031
0,019

280
0,035
0,030
0,023
0,021
0,025
0,016

Hasil Elektroforesis Genom

Gambar 3.1. Hasil elektroforesis genom bakteri. Sampel kelompok 1, 2, dan 3 adalah bakteri
dari kambing. Sampel kelompok 4, 5, dan 8 adalah bakteri dari ayam.

3.3

Hasil PCR

10.000
6.000
3.000
1.000

Gambar 3.2. Hasil elektroforesis kiri ke kanan kelompok 1 kambing, 2 kambing, 3 kambing,
4 ayam, 5 ayam, 8 ayam

4.
4.1

PEMBAHASAN
Analisis Kemurnian
Kemurnian sampel DNA dapat diukur dengan spektrofotometer dan dapat

divisualisasikan dengan elektrofotometer. Pengukuran spektrofotometer menghasilkan nilai

absorbansi pada panjang gelombang tertentu. Hasil pengukuran pada panjang gelombang 260
nm menghasilkan absorbansi keberadaan materi genetik, sedangkan panjang gelombang 280
nm menghasilkan absorbansi keberadaan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang
260 nm berbanding dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 280 nm menghasilkan
nilai tingkat kemurnian DNA pada sampel. Berikut rumusannya:
Kemurnian DNA =

Absorbansi pada 260

Absorbansi pada 280

Berdasarkan kemurniannya, hasil spetrofotometer dengan sampel yang angka

kemurnian antara 1,8 2,0 merupakan sampel yang bisa dikategorikan baik. (Linacero,
Rueda, & Vazquez, 1998). Tabel 4.1 menunjukkan hasil perhitungan kemurnian pada sampel
yang diteliti. Hasil kemurnian menunjukkan tidak ada sampel yang masuk kategori baik
7

kemurniannya. Kurang murninya sampel dapat disebabkan oleh kurang teliti dan kurang
bersihnya proses isolasi genom. Tingkat kemurnian ini dapat divisualisasikan lebih lanjut
dengan elektroforesis genom.
Tabel 4.1. Nilai kemurnian sampel
Sampel Bakteri

Kemurnia

Kelompok no. 1
Kelompok no. 2
Kelompok no. 3
Kelompok no. 4
Kelompok no. 5
Kelompok no. 8

n
1,286
1,167
1,130
1,143
1,240
1,188

Prinsip dari teknik elektroforesis adalah migrasi pratikel yang bermuatan dengan
pengaruh medan elektronik dalam kondisi yang konstan. DNA bermuatan negatif, sehingga
pada elektroforesis, DNA diinjeksikan pada sumur gel dan diletakkan pada kutub negatif.
DNA akan bergerak ke kutub positif pada elektroforesis. Semakin besar berat molekul DNA,
maka semakin lambat geraknya. Sebaliknya, semakin kecil berat molekul DNA maka akan
semakin cepat perpindahannya ke kutub positif dari elektroforesis. Oleh karena itu, pada hasil
elektroforesis, pita yang paling dekat dengan sumur menggambarkan DNA yang berat
molekulnya besar. Semakin jauh pita, maka semakin kecil berat molekul DNA.
Pada penelitian ini, dilakukan elektroforesis gel dengan gel agarosa. Elektroforesis gel
agarosa dapat digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga 20.000 pasang basa (bp).
Hasil elektroforesis genom (Gambar 3.1) menunjukkan smear pada setiap sampel.
Smear terjadi karena DNA yang terdegradasi, masih ada RNA pada sampel, dan kesalahan
pada elektroforesis. DNA yang terdegradasi dan keberadaan RNA pada sampel dapat terjadi
karena proses isolasi DNA yang kurang baik. Kesalahan pada elektroforesis juga dapat
menimbulkan smear, seperti jika melakukan kesalahan pada saat pembuatan gel agarose, dan
terlalu banyak sampel yang dimasukkan kedalam sumur. (Kurien & Scofield, 2012)
Bila hasil elektroforesis genom ini disejajarkan dengan kemurnian dari hasil
spektrofotometer, maka dapat disimpulkan sampel terkontaminasi dengan protein sehingga
menimbulkan smear. Selain itu juga terjadi kesalahan elektroforesis, karena smear terjadi
tidak hanya pada sampel tetapi juga terjadi pada marker.
8

4.2

Analisis Konsentrasi
Konsentrasi sampel dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:
Konsentrasi DNA = Absorbansi pada 260 50

ng
l

700
5

Hasil perhitungan konsentrasi DNA yang didapat dari isolasi ini ditunjukkan pada Tabel 4.2.
Konsentrasi tertinggi diperoleh pada sampel kelompok no 1, yaitu bakteri dari daging
kambing yang telah busuk. Konsentrasi terendah diperoleh pada sampel kelompok no 8, yaitu
bakteri dari daging ayam yang telah busuk. Konsentrasi dibutuhkan untuk menentukan
pengenceran pada sampel untuk proses PCR.
Tabel 4.2. Konsentrasi Sampel Bakteri
Konsentrasi
Sampel Bakteri

Kelompok no. 1
Kelompok no. 2
Kelompok no. 3
Kelompok no. 4
Kelompok no. 5
Kelompok no. 8

4.3

( ngl )
315
245
182
168
217
133

Analisis Hasil PCR

PCR dilakukan dengan primer spesifik 63F (5 CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC

3) dan 138R (5GGG CGG WGT GTA CAA GGC 3). (Marchesi, 1998). Primer ini spesifik
untuk identifikasi organisme prokariot berdasarkan gen penyandi 16s rRNA. Penyandi ini
dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena bersifat universal dengan fungsi yang
identik pada seluruh organisme. 16s RNA memiliki daerah urutan basa yang relative
konserfatif dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Analisis dengan menggunakan
16s RNA dilakukan sebagai pendekatan untuk menunjukkan kekerabatan pada spesies
prokariot, tetapi tidak dapat menggambarkan keanekaragaman prokariot di alam. (Gomes,
2002)

Hasil elektroforesis PCR (Gambar 3.2) menunjukkan pita pada sampel kelompok 3 dan
kelompok 4. Letak pita sejajar dengan pita pada control positif. Bila disejajarkan dengan
marker, pita menunjukkan bahwa DNA pada sampel memiliki antara 1000-2000 pasang basa.
Pita yang muncul menunjukkan bahwa DNA template pada sampel sama dengan DNA
template primer, artinya terdapat kemiripin antar template DNA tersebut. Sampel yang tidak
menghasilkan pita terjadi karena kurang atau tidak miripnya DNA template pada sampel
dengan DNA template pada primer.

5.

KESIMPULAN
Isolasi bakteri dari daging kambing dan daging ayam busuk berhasil dilakukan. Hal

ini ditunjukkan pada hasil elektroforesis genom. Hasil PCR menunjukkan sampel DNA
kelompok 3 dan kelompok 4 memiliki kemiripan dengan template DNA primer yang
ditunjukkan dengan munculnya pita pada hasil elektroforesis.

6.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Molecullar
Biology of the Cell Edisi ke-4. New York: Graland Science.
Gomes, E. (2002). Polymorphism in the internal transcribed spacer (ITS) of the ribosomal
DNA of 26 isolates of ectomycorrhizal fungi. Genet Mol Biol , 25(4) : 477-483.
Kurien, B., & Scofield, R. (2012). Common artifacts and mistakes made in electrophoresis.
PubMed - indexed for MEDLINE, 869:633-40.
Lewin, B. (2004). Genes VIII. New Jersey: Pearson Education Inc.
Linacero, R., Rueda, J., & Vazquez, A. (1998). Quantification of DNA. London: Chapman
and Hall.
Marchesi, J. (1998). Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers. Appl.
Environm. Microbiol, 64: 795-799.
Meltzer, S. (2006). PCR in Bioanalysis. New York: Springer Science & Business Media.

10