LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI

Isolasi DNA, PCR, dan Elektroforesis

KELOMPOK 4B
Merita Yumna Nisrina (030001900079)
Mutiara Sri Rahayu (030001900091)
Natasha Louise Euphora (030001900096)
Neysa Nurwafa Zahrah (030001900101)
Nurul Izzah (030001900106)
Putri Aliyah Denizar (030001900108)
Putri Laura (030001900109)
Radhiya Putri Dhifanjani (030001900111)

UNIVERSITAS TRISAKTI
FAKULTAS KEDOKTERAN
JAKARTA
2019
 Laporan Praktikum

Tujuan :
1. Mengetahui dan memahami tahapan isolasi DNA dari sel darah
2. Dapat mengetahui elektroforesis DNA
3. Dapat mengetahui cara penggunaan PCR pada sample darah manusia

Pendahuluan :
Materi genetic harus mempunyai kemampuan untuk mengkode suatu informasi secara
spesifik dan menggandakan suatu informasi secara tepat, contoh dari materi genetic yaitu
DNA. DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit dianalisis karena strukturnya yang
panjang dan secara kimiawi monoton. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti
pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetic bersifat herediter
pada seluruh sistem kehidupan. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat mempelajari
DNA dengan menggunakan prinsip sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunya
berat molekul besar yang berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung. Hasil setrifugasi akan menunjukan dua macam fraksi yang terpisah,
yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Elektroforesis adalah suatu
cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul protein bermuatan didalam
medan listrik. Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu teknik dalam biologi molekuler
untuk amplifikasi DNA tunggal atau potongan beberapa DNA selektif menjadi ribuan bahkan
jutaan Salinan urutan DNA tertentu. Prinsip dari PCR adalah adanya reaksi berantai.

Alat dan Bahan :

-isolasi dna
Alat Bahan
1. Tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml 1. Zymo Quick DNA Miniprep Plus
2. Mikropipet + tip Kit D4068
3. Spuit disposable 5 ml + tabung 2. Darah vena
EDTA
4. Sentrifugator
5. Vortex
6. Incubator
 -POLYMERASE CHAIN REACTION
Alat Bahan
1.Tabung mikro (1,5ml dan 0,2ml) 1. Mastermix 12,5 L
2.Pipet Eppendorf + tip 2. Primer F 0,5 L
3.Alat sentrifugasi mikro 3. Primer R 0,5 L
4.Vortex 4. ddH2O 0,9 L
5.Rak tabung mikro 5. DNA template 2,5 L
6.Mesin PCR 6. Etidium Bromide (EtBr) 0,5 L
7.Peralatan untuk elektroforesis gel agarose 7. Bubuk agarose 0,5 gr
8.UV box 8. Buffer TAE 1x, 50 mL
9. Ladder 100 bp

-ELEKTROFORESIS
Alat Bahan
Satu set alat elektroforesis DNA berikut Larutan hasil isolasi DNA darah vena
power supply, yang terdiri dari : Larutan hasil PCR (Produk PCR), FSHR
 Chamber elektroforesis dan mikrodelesi
 Tray elektroforesis Larutan TAE (Tris Acetic acid EDTA)
 Sisir Sample Buffer (loading buffer)
 Power supply Etidium bromide
Metode
- Isolasi DNA.
1. Lihat di protocol katalog dari zymo quick DNA miniprep plus kit D4068
 Menambahkan 200 l sampel kedalam microcentrifuge tube dan
menambahkan 200 l BioFluid dan Cell Buffer (merah) dan 20 l proteinase
K
 Mencampurkan secara secara merata dan menginkubasi tube pada suhu 55C
dalam waktu 10 menit
  Menambahkan 420 L Genomic Binding Buffer pada sampel yang telah
didapatkan
 Memindahkan sampel ke zymo-Spin IIc-XLR kolom dalam tabung koleksi
centrifuge (212.000 x g) selama 1 menit. Buang tabung koleksinya dan terus
mengalir.
 Menambahkan 400 l DNA Pre-Wash Buffer ke dalam tabung Collection
Tube baru dan sentrifugasi selama 1 menit mengosongkan tabung koleksinya.
 Menambahkan 700 l g-DNA Wash Buffer dan sentrifugasi selama 1 menit
mengosongkan Collection Tube
 Menambahkan 200 l g-DNA Wash Buffer dan sentrifugasi selama 1 menit.
Membuang cairan beserta Colllection Tube.
 Untuk elute DNA,memindahkan Microcetrifuge tube yang baru .
menambahkan kurang lebih 20 l DNA Elution Buffer, inkubasi selama 5
menit dan sentrifugasi selama 1 menit.
- Amplifikasi PCR

1. Melabelkan sebuah tabung PCR dengan inisial kita.

2. Mengambil tabung berisi yellow master mix dari dalam kotak es dan
pindahkan 12 L master mix dari dalam tabung PCR.
3. Menambahkan berurutan primer F 0,5 L, primer R 0,5 L,20 L template
DNA dan ddH2O sebanyak 9 L ke dasar tabung PCR. Lalu
mencampurkan dengan cara memipet keluar masuk cairan 2-3 kali. Tutup
tabung PCR secara rapat.
4. Menempatkan tabung PCR di dalam thermal cycler.Kontrol yang telah
disiapkan juga di tempatkan di dalam mesin PCR. Proses amplifikasi PCR
akan berlangsung 35 siklus selama 3 jam
- Elektroforesis

1. Pembuat Gel (sudah dilakukan)

 Untuk membuat gel dengan kosentrasi 1,6 % maka ditimbang agarose bubuk
seberat 0,8 gram yang kemudian dilarutkan dalam larutan TAE sebanyak 50
mL
 Memasak larutan agarose sampai mendidih dan larut semua
 Menunggu larutan tersebut dingin sampai kira-kira 70oC, kemudian
memasukkan 0,5 L 0,1% ethidiumbromida
 Menuang larutan agarose ke dalam tray elektroforesis yang telah disiapkan
terlebih dahulu dan dipasangi sisir
 Menunggu agarose dingin dan mengeras
 Setelah membeku melepaskan sisir, dan meletakkan agarose pada chamber
elektroforesis
 Mengisi chamber dengan TAE buffer hingga gel agarose terendam

2. Melarutkan yang akan di loading pada elektroforesis adalah – DNA ladder yang
digunakan sebagai Marker DNA- DNA hasil isolasi sebanyak 5 L yang ditambahkan
dengan loading dye sebanyak 1 L- Hasil PCR yang menggunakan Primer FSHR-
Hasil PCR yang menggunakan Primer Mikrodelesi.
3. Memasukkan larutan diatas ke dalam masing-masing lubang yang terdapat pada gel
agarose
 4. Menghubungkan alat elektroforesis tersebut dengan power supply yang telah diatur
dengan voltase 90 volt selama 48 menit
5. Mengamati pita-pita (bands) yang terbentuk dengan menggunakan UV
transluminator, dan memfoto dengan kamera langsung jadi.

Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan, bahan yang paling sering
digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut, karena kedua bahan tersebut
relatif mudah diperoleh. Untuk mengisolasi DNA dari darah maka sel darah merah yang tidak
mengandung DNA genom harus dilisiskan agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Ada 2
alasan utama dilakukan isolasi DNA yaitu membuat gene bank dan analisis dari genom.

Pada saat elektroforesis, untuk mengetahui gen target ada atau tidaknya kita harus running gel
dan bentuknya akan menjadi pita DNA lalu menggunakan agarose gel yang konsentrasinya
1% karena dengan konsentrasi tersebut diharapkan ideal bagi ukuran fragmen yang dipakai
pada praktikum ini. Pencetakan DNA menggunakan comb fungsinya untuk membuat wale
bentuknya seperti lubang sebagai tempat sampelnya, setelah dicetak lalu direndam dalam
running buffer TAE 500ml yang berfungsi sebagai penyangga dan media penghantar listrik
yang tepat,sebelum dimasukan ke dalam wale sampel akan dicampur dengan loading dye.
Loading dye ini berfungsi untuk memperberat molekul DNA karena apabila molekul DNA
tidak diperberat,sampel DNA dapat tercampur dengan larutan buffer. Setelah semua sampel
DNA telah dimasukan ke dalam wale lalu diberi muatan dengan menghubungkan ke power
supply dari arah muatan negative ke muatan positif supaya terbentuk pita DNA. DNA
memiliki muatan negatif sehingga DNA akan bergerak dari muatan negatif ke muatan positif.
1. Fungsi Proteinase K dan Buffer Lisis
o Menghancurkan atau melisiskan sel

2. Fungsi Buffer
o Menjaga struktur DNA (selama penghancuran dan purifikasi
o Menghilangkan protein dan RNA
o Mencegah aktivitas enzim pendegedrasian DNA
o Mencegah perubahan molekul DNA

3. Fungsi Buffer AL
o Melisiskan sel
o Memecah sel
o Memecah membrane nucleus

4. Fungsi Buffer AE
o Mengelusi (proses ekstraksi zat padat dari campuran zat dengan zat pelarut)
DNA dari membrane
o Melakukan pengembalian / recover DNA teresolusi
 o Melakukan stabilitas DNA teresolusi (saat disimpan di kulkas hingga lama)

5. Fungsi Reagen AW1 (Guanidium Chloride)

o Denaturasi protein

6. Fungsi AW2 (70% ErOH)

o Membuang garam dari kolom
o Memurnikan DNA

7. Fungsi Etanol
o Presipitasi DNA dari material tereksitasi

Hasil

Hasil praktikum kelompok kami menunjukkan hasil dari sampel isolasi DNA
kelompok kami memperlihatkan hasil yang tidak terlalu jelas atau hasil yang negative.
Kemungkinan hal ini bisa terjadi karena adanya kesalahan pada saat melakukan pemurnian
DNA, mungkin saja ketika dibuang etanol sampel DNA ikut juga terbuang sehingga
menyisakan sampel DNA yang sedikit hasilnya negative,