Senin, 17 Mei 2021

LAPORAN BIOTEKNOLOGI

ACARA 6

ELEKTROFORESIS DAN EKSTRAKSI DNA

RIZKI PAMBUDI WANA

1804020042

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN DAN PERIKANAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

2021
 I. TUJUAN
1. Untuk mengetahui definisi elektroforesis.
2. Untuk mengetahui definisi ekstraksi DNA.
3. Untuk mengetahui prinsip kerja dalam proses elektroforesis dan
ekstraksi DNA.
4. Untuk mengetahui kendala dalam melakukan elektroforesis dan
ekstraksi DNA.
5. Untuk mengetahui proses-proses yang terjadi dalam elektroforesis dan
ekstraksi DNA.

II. DASAR TEORI

Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau
pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA,
dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis berguna untuk
memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik
dilewatkan mealui medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan cara memanfaatkan
muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang
bermuatan negative. Jika molekul yang bermuatan negative dilewatkan
dalam suatu medium, maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan
negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut
tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya
(Yuwono,2008).
Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan suatu makromolekul
dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati
medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik.
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul-
molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Bowen, 2000). 
Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif
(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings,
1994).
Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut
fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring"
objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa
objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada
fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda
positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat
elektroforesis gel. ( Campbell ,2000)
Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom-kolom (disebut
well atau "sumur") pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik
diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari
elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini
berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi
gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar
akan lebih lambat berpindah. (Wibowo, 2010)
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai
ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.
Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai
metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen
dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen,
1999). Aplikasi elektroforesis dapat digunakan dalam uji paternitas dan
identifikasi pelaku kejahatan (DNA fingerprinting). Elektroforesis juga
berperan dalam human genome project.
Metode elektroforesis gel ini juga dapat digunakan dalam
penelitian transglutaminase (enzim yang mengkatalisa pembentukan
ikatan silang antar molekul protein). Terbentuknya polimer protein ini
ditunjukkan oleh adanya pita berberat molekul tinggi pada gel
elektroforesis.
 Kelebihan elektroforesis adalah merupakan teknik separasi
yang relatif murah dan mudah untuk menganalisa dan memurnikan
macam-macam biomolekul, khususnya protein dan asam nucleat. Metode
ini sulit dilakukan dengan media larutan, oleh sebab itu digunakan gel.
(Endang dan Setiasih, 2009).
Ekstraksi DNA adalah suatu proses pemisahan DNA dari
komponen-komponen sel lainnya. Ekstraksi DNA pada organisme eukariot
dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls),
penghilangan protein dan RNA(cell digestion), dan pengendapan DNA
( precipitation). DNA larut dalam air, tapitidak larut dalam air asin.
Perbedaan dalam tingkat kelarutan DNA inilah yangakhirnya menjadi
dasar dalam proses ekstraksi DNA (Jamilah, 2005). 
Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis
molekuler.Masalah-masalah dalam ekstraksi DNA masih merupakan hal
penting yang perludiatasi. Jumlah dan kualitas DNA hasil ekstraksi
bervariasi tergantung dari spesies tanaman sehingga mempengaruhi
analisis lebih lanjut seperti hibridisasi DNA, pemotongan DNA dengan
enzim restriksi maupun analisis dengan  polymerasechainreaction(PCR)
(Pharmawati, 2009).
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah merupakan senyawa
kimia yang paling penting dalam makhluk hidup karena molekul berperan
sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein
dan proses metabolisme lain . DNA genom meliputi gen dan
intergen. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk
nukleotida. DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi serta
diisolasi untuk dipelajari (Suryo, 2004).
Proses pengeluaran DNA dari nucleus, mitokondria maupun
organel laindengan cara diekstraksi atau dilisiskan biasanya dilakukan
dengan homogenasidengan penambahan dufer ekstraksi atau buffer lisis
untuk mencegan DNA rusak.Pada kondisi sampel tertentu, untuk
 membantu lisis dari membransel/nucleus/organel atau juga dinding sel,
maka sampel daun dimasukkan dudu kenitrogen cair dan langsung digerus
sebelum ditambahkan buffer ekstraksi.Senyawa yang biasa digunakan
untuk memaksimalkan hasil isolate DNA yangmurni ditambahkan yaitu
fenol, kloroform, dan isoamil alkohol (Fatchiyah dkk,2011).

III. ALAT DAN BAHAN

Alat dan bahan yang akan digunakan antara lain :
Ekstraksi DNA
a) Alat :
1. Timbangan
2. Waterbath
3. Tabung eppendorft 20 ml
4. Mortar dan Pastel
5. Spatula
6. Sentrifuge
7. Micropipet
8. Blue tip dan Yellow tip
9. Kamera HandPhone (Dokumentasi)
10. Alat Tulis
b) Bahan :
1. CTAB buffer
2. Nitrogen cair
3. CIAA (chloroform isoamyl alkohol 24:1)
4. Ethanol absolute
5. 7,5 Ammonium actate
6. Ethanol 75%
7. TE buffer
 Elektroforesis
a) Alat
1. timbangan
2. Microwafe
3. Erlenmeyer volume 100ml
4. Electrophoresis chamber
5. Power supply
6. Comb
7. Tray
8. Micropipet
9. White tip and yellow tip
10. PCR tube
11. Kamera HandPhone (Dokumentasi)
12. Alat Tulis
b) Bahan :
1. TBE buffer
2. Agarose
3. Loading buffer
4. DNA kelapa
5. Ethidium bromida
IV. CARA KERJA

Setelah melaksanakan praktikum di dapat beberapa tahapan atau

proses cara kerja sebagai berikut :
A. Ekstraksi DNA
1. Menyiapkan alat dan bahan
2. Menyiapkan CTAB buffer sebanyak 2x volume/berat
sampel (1 ml) dan memasukkannya ke dalam incubator
atau waterbath yang sudah disetting suhunya di 65℃
3. Mengambil daun kelapa dan menimbangnya sebanyak 0,
5 gr
 4. Memasukkan daun kedalam mortar, kemudian
menambahkan nitrogen cair dandigerus sampai halus
5. Memsukkan serbuk dauntersebut menggunakan spatula
kedala tabung eppendorf yang berisi CTAB buffer diatas
6. Memvortex sebentar agar homogeny
7. Menginkubasi sampel di saterbath/incubator selama 1
jam, setiap 15 menit di vortex
8. Mensetrifuge sample dengan kecepatan 11.000 rpm
selama 20 menit
9. Mengambil supernatant dan memindahkan dala tabung
eppendorf baru
10. Menambahkan CIAA sebanyak ½ dari volume
supernatant lalu diflicking sampai tercampur
11. Mensetrifuge sampel lagi dengan kecepatan 11. 000 rpm
selama 20 menit
12. Mengambil supernatant supernatant dan memasukkan
kedalam tube baru, lalu menambahkan 1 ml ethanol
absolut dan 0,1 ml 7,5M ammonium acetat
13. Mendokumentasi segala kegiatan praktikum
B. Elektroforesis
1. Menyiapkan alat dan bahan terlebih dahulu.
2. Selanjutnya menimbang agarose sebanyak 0.4 gram.
3. Kemudian mencampurkan agarose dengan TBE buffer
sebanyak 40 ml (agarose 1%) didalam Erlenmeyer,
timbang dan catat beratnya. Lalu masak agarose
menggunakan microwave setelah matang timbang lagi
beratnya, jika berkurang tambahkan TBE buffer sampai
tercapai berat semula dan biarkan selama 3 menit.
4. Setelah itu masukkan ethidium bromide sebanyak 1
mikroliter kedalam Erlenmeyer, homogenkan dengan cara
digoyang-goyang.
5. Selanjutnya masukkan agarose 1% tadi dalam cetakan /
tray yang sudah dipasang comb dan tunggu sampai benar-
benar padat.
6. Kemudian apabila benar-benar padat, comb diambil
sehingga terbentuk sumuran.
7. Setelah itu masukkan agarose beserta traynya kedalam
elektroforesis chamber ( jangan terbalik posisinya ujung
agarose yang ada sumurannya harus berada didepan kutub
negative), lalu tambahkan TBE buffer sampai batas yang
sudah di tentukan.
8. Selanjutnya keluarkan sampel dari kulkas lalu di vortex
sebentar.
9. Kemudian mengambil loading buffer sebanyak 5
mikroliter lalu campur dengan 20 mikroliter sampel
DNA.
10. Setelah itu ambil sebanyak 20 mikroliter campuran
sampel diatas kemudian masukkan kedalam salah satu
sumuran (1 kelompok mengisi 1 sumuran).
11. Selanjutnya mengambil DNA ladder sebanyak 6
mikroliter lalu masukkan kedalam salah satu sumuran.
12. Kemudian menyalakan power supply dan setting pada
voltase 70-75 volt.
13. Setelah itu hubungkan elektroforesis chamber dengan
power supply tunggu kurang lebih 1 jam atau sampai
bercak hampir berbeda di ujung agarose.
14. Selanjutnya apabila sudah 1 jam , matikan power supply
dan ambil tray yang berisi agarose.
15. Kemudian yang terakhir amati menggunakan UV
transluminator.
V. HASIL PENGAMATAN

VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum acara kedua tentang pembuatan yoghurt ini
dilakukan pada Gedung F Lantai 3, praktikum dilaksanan langsung sampai
dengan acara ketiga. Praktikum dilaksanakan pada pukul 07:00 WIB
sampai dengan selesai.
Setelah melakukan praktikum elektroforesis dan ekstraksi dna
diperoleh sebagai berikut
Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan suatu makromolekul
dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati
medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik.
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul-
molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Bowen, 2000). 
Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif
(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings,
1994).
 Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. 
Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi
pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang
yang sama (Campbell dkk., 2002).  Ada tiga jenis gel yang dapat
digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan
penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan
sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada
ukuran standar.(Davis dkk., 1994).
Kemudian dalam ekstraksi DNA diperoleh sebagi berikut :

langkah pertama yang praktikan lakukan adalah membersihkan

daun kelapa dengan lakohol 70% daun kemudian di potong-potong dan
ditimbang hingga beratnya 0,1 gram. Daun dipilih karena DNA pada
tanaman paling bai terdapat pada kloroplas. Dan kloroplas paling
banyak terdapat di daun tanaman sehingga daun dipilih sebagai bahan
pengisolasian DNA. Selanjutnya masukan padi kedalam mortar dingin
lalu ditambahkan 600 mikroliter larutan CTAB, pendinginan mortar
dipilih agar proses penghalusan lebih mudah dilakukan. penggerusan
dilakukan untuk memecahh dinding sel. Larutan CTAB digunakan
untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan .
penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan
kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali
kontaminasi polisakarida.
Langkah selanjutnya adalah masukan daun yang telah digerus
kedalam tube 1,5-2 ml, bilas mortar dengan 600 mikroliter larutan
CTAB, tutup tube kemodian bolak balik tube hingga tercampur rata.
Selanjutnya tube dipanaskan didalam waterbath dengan suhu 65o
hingga 30 menit, setiap 30 menit sekali tube di bolak balik agar
tercampur rata. Pemanasan dalam waterbath ini adalah bertujuan untuk
mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada
suhu 15°C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida,
CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang
mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman
dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan
Rhizobium. Setelah 30 menit tambahkan larutan CISAM kedalam tube
sebanyak 600 mikroliter kemudian bolak balik kembali agar
tercamputr dengan baik. setelah itu disentrifuse sebesar 12.000 rpm
selama 10 menit. stelah larutan terpisah, kemudian diambil supernatan
menggunakan mikropipet. Pada proses ini praktiakn harus berhati-hati
karena apabila unsur lain selain supernatan yang terambil maka akan
terjadi kontaminasi yang menyebabkan kurang baiknya kualitas DNA
murni.
Langkah berikutnya yaitu cacat berapa jumlah supernatan yang
diambil, lalu ditambahkan larutan isopropanol dingin sebayang 2/3
volume supernatan dan Na-asetat sebanyak 1/10 dari volume
supernatan. Jumlah supernatan yang diambil pada kelompok saya
sebanyak 600 mikroliter sheingga larutan isopropanol yang
ditambahkan adalah sebanyak 400 mikroliter dan Na-asetat sebanyak
60 mikroliter. Lalu bolak-balik kembali agar tercamput dengan baik.
selanjutnya masukan tube kedalam freezer bersuhu 4 o C selama 1
malam. Setelah itu keluarkan dari freezer dan dilakukan sentrifuse
kembali sebesar 12.000 rpm selama 10 menit. akan terjadi perubahan
berupa terpisahnya supernatan dan pelet, buang supernatan hingga
hanya pelet yang tersisa. Setelah supernatan dibuang tambahkan
etanol 70% sebanyak 500 mikroliter lewat dinding tube hal ini
bertujuan untuk membilas tntas DNA. Setelah itu pelet tersebut
disentrifuse kembali sebesar 12.000 rpm selama 5 menit dan baung
supernatan lagi dengan hati-hati. Kemudian pelet dikering anginkan
menggunakan desikator kurang lebih 1 jam. Kemudua ditambahkan
buffer TE sebanyak 100 mikroliter.
Bahasan kali ini akan diuraikan menurut proses dalam isolasi DNA
dengan ekstraksi DNA langkah per langkah. Hal tersebut dilakukan
praktikan untuk memperjelas dan menjabarkan step by step dalam
setiap langkah ini, dikarenakan setiap langkah dalam praktikum ini
sangatlah mempengaruhi hasil akhir dari keberhasilan ekstraksi DNA
secara sederhana ini.
Penghalusan dau kelapa langkah ini merupakan langkah yang
sangat penting dan harus benar-benar diperhatikan dalam ekstraksi
DNA. Semakin halus, maka DNA yang akan di ekstrak pun akan lebih
mudah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dapat terjadi karena
apabila bahan uji pisang masih dalam substrat yang belum hancur
sempurna, maka ada beberapa bagian yang nantinya tidak terjadi
ekstraksi dan hanya ada pada bagian luarnya saja. Berikut ini visual
untuk mempermudah penggambaran pelumatan halus lebih baik
daripada kasar.
Menurut Jamilah (2005:38) saat penghancuran, terjadi pelepasan
senyawa polifenol dan polisakarida. Plolivenol yang teroksidasi akan
terikat kovalen dengan DNA, sedang polisakarida mengalami
koprespitasi dengan asam nukleat dengan penambahan alkohol,
terbentuk matriks seperti lem. Hal ini menyebabkan DNA kental.
Penghalusan yang terlalu berlebihan dan terlalu lama juga dapat
mengakibatkan sel dalam dan DNA rusak. Hal tersebut ditandai
dengan warna bahan uji yang awalnya putih kekuningan menjadi
coklat.
VII. KESIMPULAN
Setelah melakukan praktikum elektroforesis dan ekstraksi dna di
dapatkan kesimpulan sebagai berikut :
1. Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan
sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA, dll) dari
campuran molekul yang serupa.
2. Ekstraksi DNA adalah suatu proses pemisahan DNA dari komponen-
komponen sel lainnya. Ekstraksi DNA pada organisme eukariot
dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell
walls), penghilangan protein dan RNA(cell digestion), dan
pengendapan DNA ( precipitation).
3. Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA,
yaitu:
Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer,Gel alkalin
agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran
besar,Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk
menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA
pada ukuran standar.
4. Prinsip kerja elektroforesis yaitu berdasarkan pergerakan partikel-
partikel bermuatan negative (anion) dalam hal tersebut DNA yang
bergerak menuju kutub positif (anoda) sedangkan partikel-partikel
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif
(anoda).
5. Dalam elektroforesis agarosa digunakan untuk mendeteksi kompleks-
kompleks antigen-antibodi, dan untuk menganalisis DNA, RNA dan
molekul protein.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Bowen, R. 2000. Principles of gel electrophoresis.London
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Terj.
Colorado State University. 2000. Principle of gel electrophoresis.
Faibanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life.
Brooks/Cole Publishing Company, New York.

Fatchiyah, dkk. 2011.Biologi Molekular . Jakarta: Erlangga. 

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan

Ekstrak Nanas(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai
Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi
Program Sarjana  Biologi. Malang.

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill
Publishing Co.Columbus, Ohio.

Pharmawati, Made. 2009.Optimalisasi Ekstraksi Dna Dan Pcr-Rapd Pada

Grevillea spp. (Proteaceae).Jurnal Biologi XIII (1) : 12 -16.

Suryo. 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Wibowo, M.S. 2010. Elektroforesis . Sekolah Farmasi Institut Teknologi

Bandung.
Yuwono, T. 2008.Biologi Molekular . Jakarta: Penerbit Erlangga
IX. LAMPIRAN