PRAKTIKUM V
ELEKTROFORESIS
Oleh :
Kelompok 5
Golongan 2
Luh Gd. Karisma Widiantari (1808551019)
Kadek Dinda Suryadewi (1808551020)
Kadek Sutri Ariyanthini (1808551021)
Ida Ayu Putu Sintya Dewi (1808551022)
Ni Made Winda Dwiyani (1808551023)
ELEKTROFORESIS
I. PENDAHULUAN
1.1 Dasar Teori dan Prinsip Analisis
1.1.1 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan
molekul-molekul protein yang bermuatan di dalam medan listrik (titik isoeletrik).
Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar
muatan dan sifat kimia dari molekul. Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan
ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul
tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi
protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi
(Pratiwi, 2001). Arah gerak partikel bermuatan tergantung dari sifat muatan listrik;
partikel bermuatan akan menuju kearah elektrode yang bermuatan berlawanan. Laju
migrasi tergantung pada empat faktor utama, yaitu mobilitas partikel bermuatan,
penguapan dan kekuatan medan listrik. Oleh karena itu analisa elektroforesis harus
dilakukan pada kondisi pengujian yang benar – benar tertentu dan jika mungkin
menggunakan zat pembanding (Depkes RI, 1979). Pada praktikum ini digunakan
elektroforesis gel yang menggunakan gel sebagai media pemisah. Ada beberapa jenis
elektroforesis berdasarkan medianya yaitu:
A. Elektroforesis Kapiler
Jenis elektroforesis ini digunakan untuk memisahkan protein, lipid, asam amino,
karbohidrat, dan nukleotida yang dilakukan pada pipa kapiler yang telah terdapat
buffer. Tegangan listrik yang tinggi digunakan dalam metode ini yang
mengakibatkan komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda (Watson,
2007).
B. Elektroforesis Kertas
Fase diam pada elektroforesis ini menggunakan kertas dan fase gerak berupa
partikel bermuatan utamanya ion – ion kompleks. Metode pemisahan ini
1
diakibatkan oleh adanya gradien konsentrasi sepanjang sistem pemisahan
(Sulaiman dan Kundari, 2007).
C. Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel adalah metode yang banyak digunakan dalam penentuan
protein maupun asam amino. Matriks yang digunakan berupa gel untuk
meminimalisir konveksi, dan sebagai tempat bergeraknya molekul serta
penyaring ukuran molekul (Yahya dkk., 2016).
1.1.2 Komponen Elektroforesis
Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen utama dalam penggunannya.
Yang pertama adalah larutan elektrolit yang berfungsi sebagai pembawa komponen.
Umumnya berupa larutan buffer dengan pH tertentu sesuai dengan karakteristik
senyawa yang akan dipisahkan. Berikutnya media pemisah merupakan tempat proses
pemisahan terjadi. Media pemisah ini berupa kertas (selulosa asetat, selulosanitrat),
gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan atau agar – agar. Selanjutnya yang paling
penting adalah elektroda yang berfungsi sebagai penghubung arus listrik dengan
media pemisah dan baterai atau arus listrik dengan media pemisah dan baterai atau
arus listrik sebagai sumber energi (source) pada rangkaian alat (Harahap, 2018).
1.1.3 Prinsip Elektroforesis
Prinsip eletroforesis menurut George Stokes besarnya gaya gesek pada fluida
disebabkan viskositas fluida. Semakin besar viskositas (kekentalan) fluida maka akan
semakin sulit suatu fluida untuk mengalir dan juga menunjukkan semakin sulit suatu
benda bergerak dalam fluida tersebut. Di dalam zat cair viskositas dihasilkan oleh
gaya kohesi antara molekul zat cair. Gaya ini disebut gaya Stoke. Suatu molekul
bermuatan Q dalam medan listrik berkekuatan x akan bergerak dengan kecepatan v
karena mengalami gaya sebesar qx. Jika f merupakan koefisien gesekan (friksi), maka
molekul tersebut akan mengalami gaya hambat sebesar vf, sehingga qx = vf.
Pada elektroforesis media pemisahnya berupa gel agarosa atau lainnya yang
memiliki tingkat viskositas tinggi. Dengan demikian dapat dihitung laju molekulnya
adalah laju dalam elektroforesis sangat bergantung pada kekentalan medium (n),
ukuran atau bentuk (r), dan muatan molekul (q). Kekuatan asam pada medium juga
mempengaruhi besar muatan pada saat ionisasi berlangsung sehingga diperlukan
2
larutan buffer untuk mengatasi masalah ini. Dan juga perlu dilakukan analisis
terhadap kemampuan media untuk memisahkan molekul- molekul agar lebih efektif
dan maksimal.
1.1.4 Kegunaan Metode Elektroforesis
Metode elektroforesis diguanakn untuk penagamatan taksonomi, sistematik
dan genetika serta untuk mengidentifikasi spesies hewan maupun tumbuhan (Bio-
sistematik). Dapat pula digunakan untuk melihat phylogenetic reconstruction
(rekonstruksi ssecara Filogenetik) dari suatu jenis hewan atau tumbuha. Pola protein
tertentu dari satu spesies hewan berbeda , secara eletroforesis akan memperlihatkan
ola protein yang berbeda juga pada hewan yang lain. faktor tersubutlah yang
menyebabkan pola protein dapat digunakan untuk membedakan populasi secara tepat
kadangkala tidak dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan
morfologis (Pratiwi, 2001).
1.1.5 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Eletroforesis
Proses pemisahan dengan eletroforesis sangat dipengaruhi oleh teknik
pengerjaan dalam pengoperasian alat tersebut. Disamping medium pemisah yang
sudah dijelaskan diatas, ada beberapa faktor penentu lainnya yang dapat
mempengaruhi proses pemisahan yaitu :
a. Sampel
Sampel yang akan dipisahkan sangat memungkinan member pengaruh laju
perpindahan ditinjau dari muatan, ukuran, dan bentuk molekul. Jumlah
muatan total akan berbanding lurus dengan laju perpindahan, konsentrasi
muatan yang bermigrasi tergantung pada pH. Untuk ukuran molekul apabila
yang diperoleh lebih besar menyebabkan perpindahan molekul menurun dan
membutuhkan energi perpinddahan yang cukup besar dibandingkan dengan
bentuk molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama (Harahap, 2018).
b. Larutan Buffer
Larutan buffer berfungsi untuk memertahankan pH di dalam medium
pemisah, dan berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada proses
pergerakan aliran listrik. Larutan penyangga haruus dipilih dengan cermat,
3
keterkaitan ion buffer dalam berinteraksi dengan senyawa yang teliti, pH
dipilih berdasarkan jenis campuran yang akan dipisahkan (Harahap, 2018).
c. Medan Listrik
Sumber suatu listrik yang stabil angat diperlukan untuk menghasilkan aliran
listrik dengan tegangan yang konstan. kekuatan ionic medan listrik pada
kisaran 2-8 V/cm sesuai pada suhu ruang. Kekuatan medan magnet yang
dihasilkan jika besae 10 V/cm, maka dapat memberikan efek pemanasan yang
dapat menyebabkan pada media penyangga terjadi kehilangan air yang
diakibatkan proses penguapan. Hal ini dapat menyebabkan pergeseran hasil
fragmen-fragmen.(Harahap, 2018)
1.2 Tujuan Praktikum
1.2.1 Mahasiswa memahami prinsip pemisahan dengan metode elektroforesis.
1.2.2 Mahasiswa dapat melaksanakan pemisahan dengan metode elektroforesis.
Agarosa dipanaskan pada suhu tinggi sampai larut dengan sempurna, kemudian
suhu diturunkan setara suhu kamar
Gel agarosa dicetak pada gel tray atau cetakan gel yang dilengkapi sisir dan
ditunggu 15 menit sampai gel mengeras
Gel agarose yang telah dicetak diletakan pada chamber yang telah berisi sedikit
buffer TAE
Dipipet 5 µL sampel DNA marker yang telah ditambah dengan 1µL loading buffer
dengan pipet mikro skala 10 µL dimasukkan pada sumur 1
Sampel DNA hasil PCR sebanyak 5µL dimasukkan kedalam sumur 2-8 dan
sampel campuran isolate DNA dengan bromfenolbiru (6µL : 1µL) yang dipipet
sebanyak 5µL dimasukan ke dalam sumur 9-13.
Diatur penempatan sampel DNA dan DNA marker pada sumur (well) dan
dilakukan pelan-pelan untuk mencegah robeknya agarosa.
hasil elektroforesis dilihat dengan sinar UV dan didokumentasikan dengan gel doc
7
No. Bahan Jumlah Warna
4.3 Perhitungan
Gel Agarosa = 1% x 35 mL
= 0,35 gram
V. PEMBAHASAN
9
Konsentrasi agarosa yang semakin tingggi menyebabkan molekul – molekul
DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA
berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsetrasi gel rendah mempermudah
molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.
3. Bentuk molekul
Molekul yang berbentuk lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati gel.
4. Densitas muatan
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan
molekul densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit
volume molekul.
5. Voltase
Voltase tinggi akan meyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal
tersebut dikarenakan olehh tingginya muatan postif yang ditimbulkan.
6. Larutan buffer
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikan konduktansi listrik sehingga
migrasi DNA akan lebih cepat
Untuk membantu interpretasi sampel isolate dan PCR yang digunakan perlu
adanya DNA Marker. DNA Marker berfungsi sebagai penanda posisi molekul DNA
yang bermigrasi, untuk menentukan perkiraan ukuran basa – basanya. DNA marker
yang laju migrasinya paling cepat atau paling jauh dari sumuran adalah fragmen
marker yang memiliki berat molekul atau ukuran fragmen kecil (Utami, dkk, 2013).
Baki gel atau tray agarosa berfungsi sebagai untuk mencetak gel agarosa sebagai
tempat DNA sampel akan ditempatkan dalam sumuran – sumuran (Utami, dkk,
2013). Sisir sumur digunakan untuk membuat sumuran (well). Sisir eletroforesis
dipasang di salah satu ujung baki gel atau tray agarosa dengan posisi hampir
menyentuh dasar baki atau tray agarosa (Utami, dkk, 2013). Chamber digunakan
sebagai tempat gel agarosa. Fase gerak yang digunakan yaitu sumber listrik berfungsi
untuk memberikan arus listrik saat proses elektroforesis. Gel doc adalah alat yang
digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. Komponen
10
gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi
menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil
elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat
bantuan software (Davis dkk, 1994).
VI. KESIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.
Depkes RI. 1979. Farmakope Indonesia. Edisi III. Departemen Kesehatan Republik
Indonesia.
Harahap, M. R. 2018. Elektroforesis: Analisis Elektronika Terhadap Biokimia
Genetika. Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro. 2(1).
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment
analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine. 27(2): 351-
354
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech
Publisher : Rijeka, Croatia
Martin, Robin. 1996. Gel electrophoresis: Nucleic acids. England: Oxford, BIOS
Scientific
12
LAMPIRAN
1. Alat dan Bahan
Gambar 2.
Gambar 15.Sisir atau comb diangkat agar Gambar 16.Gel ditempatkan pada chamber
terbentuk sumur