LAPORAN SEMENTARA

PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

“ELEKTROFORESIS”

Disusun Oleh :
Nama : Muhammad Bagus Firdaus
NPM : 18025010179
Golongan : A3

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JAWA TIMUR
SURABAYA
2021
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan
dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat
berdasarkan perbedaan berat molekul. Elektroforesis gel adalah teknik yang
paling sering digunakan di laboratorium untuk analisis protein dan DNA.
Teknik ini menggunakan prinsip elektroforesis zona dimana molekul protein
bermigrasi pada medium gel yang direndam dengan larutan penyangga di bawah
pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik
bersih dan massa molekul protein.
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul
tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan
muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif
(anoda) akan bergerak menuju kutub positif (katoda), sedangkan molekul-
molekul yang bermuatan positif (katoda) akan bergerak menuju kutub negatif
(anoda). Elektroforesis gel memisahkan molekul DNA menjadi pita-pita yang
masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.
Ada beberapa gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis. Diantaranya
gel agarosa yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar dari
200 bp dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil kurang dari 200 bp.
Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel.
Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih
jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak
menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel memberikan resolusi
yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih
besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel
yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang
yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen
DNA kecil.
 Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu
pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini
dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah
sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel
muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang
terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan.

1.2 Tujuan
Tujuan praktikum materi ini adalah praktikan mampu memahami prinsip
teknik elektroforesis dan mampu secara mandiri melakukan praktek teknik
elektroforesis.
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan

memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan
perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai
saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara
rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada
berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang
menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein
bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga
di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik
isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010).
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan
listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut
akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan
negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan
molekulmolekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran,
konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala
besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat
digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap
individu (Fairbanks & Andersen, 1999). Elektroforesis gel memisahkan
makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah
pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul
DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan
panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Davis dkk. 1994).
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen
kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran
dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan
DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi
agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan
buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi
melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum,
molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari
molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju
elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi
yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih
besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel
yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen
panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada
fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat
daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan.
Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga
ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi
melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi
dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat
menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan
itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan
menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.
(Birren and Lai, 1993).
 II. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Biologi Molekuler materi III “Elektroforesis” ini dilaksanakan
pada hari Sabtu, 15 Oktober 2021 pukul 09.20-11.00 WIB yang dilaksanakan secara
daring di rumah masing-masing praktikan.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat yang digunakan pada paktikum Elektroforesis yaitu alat laptop
atau smartphone dan alat tulis.
3.2.2 Bahan
Bahan yang diperlukan dalam praktikum Elektroforesis yaitu mdoul
praktikum Biologi Molekuler, dan video ajar materi Elektroforesis.

3.3 Langkah Kerja

a. Mempersiapkan alat dan bahan
b. Membaca dan memahami materi praktikum Elektroforesis pada
modul/buku ajar biologi molekuler.
c. Melihat dan memahami video ajar yang telah diberikan.
d. Mencari referensi artikel, jurnal ataupun web dari materi yang telah
dipahami melalui laptop atau smartphone.
e. Membuat laporan dari hasil praktikum yang telah dilakukan.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil Pengamatan Proses Elektroforesis
Gambar Keterangan
Menimbang bubuk agarose sebanyak 1 gram
dan mengukur TAE (Tris Acetate EDTA)
sebanyak 100 ml.

Gambar 4.1 Penimbangan

Bubuk Agarose
Mencampurkan Agarose dan TAE, diaduk
sampai homogen dan dimasukkan ke dalam
botol scoot yang ditutup dengan plastic wrap
yang dilubangi.
Gambar 4.2 Pengadukan
Agarose dan TAE
Memanaskan campuran bahan ke dalam
microwave selama 1 menit, setelah itu
diangkat dan dibiarkan beberapa saat hingga
tidak terlalu panas.
Gambar 4.3 Memasukkan ke
Dalam Microwave
Membuka plastic wrap agar gel agarose dan
menambahkan gel red 10 μl dan diaduk
hingga homogen.

Gambar 4.4 Membuka Plastic

Wrap

Mengubah posisi gel tray untuk mencetak gel

agarose

Gambar 4.5 Mengubah Posisi Gel

Tray
 Meletakkan sisir-sisir pada posisinya.

Gambar 4.6 Meletakkan

sisir-sisir
Menuangkan larutan gel agarose pada cetakan
yang sudah disiapkan dan menunggu hingga
memadat.

Gambar 4.7 Menuangkan Larutan

Gel Agarose
Mengangkat sisir-sisir setelah gel agarose
padat.

Gambar 4.8 Menangkat sisir-

sisir
Memasukkan sampel DNA ke dalam sumur
(tempat sampel) (Ket: marker: 2 μl, loading
dye: 2μl, sampel 4μl).

Gambar 4.9 Memasukkan

Sampel DNA
Mengatur voltase hingga 55V dan waktu 1
jam 10 menit.

Gambar 4.10 Mengatur Voltase

dan Waktu

4.2 Pembahasan
Praktikum materi II “Elektroforesis” ini menggunakan agarosa karena
agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif
murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan
polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa
akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian
plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh
bahwa laju migrasi elektroforesis gel agarosa menunjukkan pergerakan ke arah
positif. Hal ini sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa teknik
elektroforesis pada dasarnya berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung
bermuatan negatif pada pH netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH
agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan memberikan daya listrik di kedua kutub
maka DNA akan bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektroforesis gel
agarosa. Agarosa merupakan gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam
pemisahan tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo
basa. Agarosa terbuat dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan,
setelah dingin akan membentuk gelatin yang padat (Ripani, 2010).
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan
listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut
tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada
bentuk molekulnya. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama
tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya
muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan
molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan
molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai (Sumitro et al.,
1996).
Macam elektroforesis antara lain yaitu elektroforesis kertas dan
elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari
kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas
zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai
fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel
dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan
biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel
berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media
(Fatchiyah, 2006).
Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan molekul
bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik.
Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis
gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih
besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis
poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis
poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing)
(Sumitro, 1996).
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur
yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus
listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak
ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan
massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk
DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding
yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA
berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan
etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga
pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa
diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar (Sambbrook,
1989).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran
molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui
ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan
etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di
dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet
(Fatchiyah, 2006).
Buffer TAE dan TBE termasuk kedalam electrophoresis buffer. Keduanya
digunakan sebagai larutan penyangga dalam gel agarose elektroforesis. Perbedaan
keduanya adalah ada di komposisi. TAE singkatan dari Tris acetate EDTA,
mengandung komposisi : Tris: 48.4 g/L, Glacial acetic acid: 11.42 mL/L dan 0.5 M
EDTA: 20 mL/L pH: 8,0. Sedangkan TBE singkatan dari Tris Boric acid EDTA,
mengandung komposisi : Tris : 105 g/L, Boric acid : 55 g/L dan EDTA-disodium
salt : 9.3 g/L pH: 8,0. Pada umumnya yang lebih sering digunakan adalah buffer
TBE dengan alasan buffer TBE lebih dapat menjaga integritas sampel DNA dan
buffer TBE lebih tepat untuk menganalisis ukuran molekul DNA.
Elektroforesis gel agarosa dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi dan
mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinis dan
pewarnaan laboratoris dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat sensitif
dan tidak memerlukan radioisotop atau ultrasentrifugasi. Selanjutnya, untuk
mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarosa
digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti
intercalating agent etidium bromide (EtBr). Setelah elektroforesis, gel diwarnai
dengan EtBr selama kurang lebih 30 menit (Gautom, 1997). Hanya sedikit DNA
dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-
transilluminator (Sambrook et al, 1989).
Menurut Atang (2007) hubungan antara berat molekul DNA dengan
kerapatan agarosa terhadap laju migrasi adalah agarosa gel akan membentuk
kerangka-kerangka atau lubang-lubang yang kompleks untuk di lewati molekul
DNA menuju elektroda positif. Makin kecil molekul DNA semakin cepat laju
migrasinya, sebaliknya makin besar molekul DNA maka semakin lambat laju
migrasinya. Komposisi gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat
dipisahkan. Jika sumuran gel agarosa menyentuh dasar baki tempat pembuatan gel
agarosa maka DNA tidak dapat melakukan migrasi.
DNA gel elektroforesis adalah teknik biologis eksperimental penting dan
sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari
pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen ini
tersebar di media poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik diterapkan.
Masing-masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan berat molekul,
menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel (Der
Lee, 2011).
 V. KESIMPULAN

Berdasarkan kegiatan praktikum Biologi Molekuler materi Isolasi DNA

dapat disimpulkan sebagai berikut:
1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
2. Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampel
DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik
molekulnya.
3. Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan molekul
bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan
listrik.
 DAFTAR PUSTAKA

Atang. 2007. Pengenalan Agarose Gel Electrophoresis. Universitas Negeri

Lampung, Bandar Lampung.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide Academic
Press, Inc., San Diego.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga
: Jakarta.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.
Der Lee et al., 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using
Image Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering,
2011, 4, 523-528
Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan
Seluler Departemen Biologi Universitas Brawijaya. Malang
Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life.
Brooks/Cole Publishing Company, New York.
Gautom, Romesh K. 1997. Rapid Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocol for
Typing of Escherichia coli O157:H7 and Other Gram-Negative Organisms
in 1 Day. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 35, No. 11: 2977–2980
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing
Co. : Columbus, Ohio.
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA
fragment analysis in agarose gel electrophoresis.Tropical Biomedicine
27(2): 351-354 (2010).
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech
Publisher: Rijeka, Croatia.
Ripani, M.. 2010. Diagnostik Molekuler. Teknologi Laboratorium Kesehatan
(TLK) di Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996.
KursusTeknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi
FMIPAUniversitas Brawijaya. Malang.