KULIAH ANALISIS PANGAN

TEKNOLOGI INDUSTRI PANGAN UNPAD

2011

QUIZ
Sebutkan bagian-bagian utama instrumen

spektofotometer uv-vis beserta fungsinya!

PENGERTIAN
Elektroforesis: proses bergeraknya molekul

bermuatan pada suatu medan listrik.

Kecepatan molekul yang bergerak pada
medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk
dan ukuran.

elektroforesis dapat di gunakan untuk separasi

makromolekul (seperti protein dan asam
nukleat)

Jenis elektroforesis
Berdasarkan jenisnya, ada dua macam elektroforesis

yaitu:
1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul
atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh
larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang
mengandung partikel tersebut akan menyebabkan
terbentuknya batas di antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis
yang paling banyak digunakan, mempergunakan
media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat,
agarosa atau poliakrilamid.

Elektroforesis untuk makromolekul

memerlukan matriks penyangga untuk

mencegah terjadinya difusi karena timbulnya
panas dari arus listrik yang digunakan.
Matriks penyangga yang banyak dipakai: gel
poliakrilamid & agarosa
Prisip elektroforeses: Bila berada dalam suatu
medan listrik, molekul biologi yang bermuatan
positif akan bermigrasi keelektroda negative
dan sebaliknya.

Gambar prinsip
elektroforesis

Pergerakan partikel bermuatan dapat

dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait

dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang
diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F = gaya Lorentz
q = muatan yang dibawa oleh objek
E = medan listrik

ELEKTROFORESIS GEL
Banyak digunakan dalam biokimia & biologi

molekular
Prinsip bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik
Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk
tujuan analisis, namun dapat pula digunakan
sebagai teknik preparatif untuk memurnikan
molekul sebelum digunakan dalam metode
lain seperti spektrometri massa.

Gel yang digunakan biasanya polimer crosslinked yang

porositasnya dapat diatur.

Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran
kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang
digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat
dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan
zat pengikat silang (cross-linker, misal
tetrametiletilendiamin / TEMED), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda.
Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar, gel
yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput
laut) yang sudah dimurnikan.

CARA KERJA
Sampel molekul ditempatkan ke dalam lubang

inlet (well) pada gel yang ditempatkan di dalam

larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya.
Molekul sampel akan bergerak di dalam matriks
gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan
muatannya.
Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah
menuju elektroda positif, disebabkan oleh
muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat
yang dimilikinya.

Setelah proses elektroforesis selesai,

dilakukan proses pewarnaan (staining) agar

molekul sampel yang telah terpisah dapat
dilihat.
Pewarna yg digunakan: etidium bromida,
perak, atau pewarna biru Coomassie
(Coomassie blue).

Gambar elektroforesis
gel

Gambar hasil
elektroforesis

Gambar prosedur
elektroforesis

Elektroforesis gel
poliakrilamid
(PAGE)

Gel poliakrilamid merupakan matrik yang paling

lazim didalam elektroforesis protein, walaupun
matrik lain seperti kanji dan agaros juga digunakan.
gel poliakrilamid memiliki keuntungan, yaitu:
1. Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi
sehingga panjang molekul DNA yang berbeda hanya
satu nukleotida dapat dideteksi.
2. Gel poliakrilamid dapat menampung jumlah DNA
yang labih besar daripada gel agarosa.
3. DNA yang diekstrak dari gel poliakrilamid bersifat
sangat murni dan dapat digunakan untuk analisis
lebih lanjut.

Matrik gel bisa dibuat didalam tabung kaca

atau keping (slab) diantara dua kepingan

kaca.
Protein dpt bermuatan positif atau negatif,
bergantung kepada pH larutan dan pI nya.
Suatu protein bermuatan negatif jika pH
larutan diatas pI nya, dan protein bermuatan
positif jika pH larutan dibawah pI nya.

Besarnya muatan dan tegangan listrik yang

diberikan akan menentukan berapa jauhnya

protein akan bergerak didalam suatu medan
elektrik.
Semakin tinggi tegangan dan semakin besar
muatan yang terdapat pada protein, maka
semakin besarlah pergerakan didalam medan
elektrik.
bentuk & ukuran molekul juga menentukan
jarak pergerakan didalam matrik gel.

ELEKTROFORESIS DNA &

PROTEIN

Elektroforesis merupakan teknik yang umum

digunakan untuk analisis DNA dan protein.

Melalui teknik ini dapat ditentukan:
1. Berat molekul suatu bahan
2. Banyaknya jenis protein pada suatu sampel
3. Adanya pemalsuan bahan atau
kerusakan/kontaminasi bahan
4. Adanya antibodi terhadap virus atau bakteri
pathogen tertentu
5. Titik isoelektrik protein

Laju migrasi DNA pada

elektroforesis dipengaruhi oleh
1. Arus listrikfaktor:
beberapa

Semakin besar arus listrik yang digunakan, laju

migrasi akan semakin cepat. Akan tetapi jika arus
yang digunakan besar, akan menimbulkan panas
yang dapat menyebabkan gel meleleh.
2. Konsentrasi gel
Konsentrasi agarosa yang digunakan menentukan
besarnya pori-pori gel yang akan memisahkan
DNA. Untuk mendapatkan resolusi yang tinggi
digunakan konsentrasi agarosa yang lebih tinggi.
Konsentrasi agarosa biasanya antara 1%-3%.

3. Ukuran molekul

Molekul yang berukuran lebih kecil akan lebih

mudah melalui pori-pori gel sehingga laju
migrasinya lebih cepat.
4. Bentuk molekul
DNA dapat memiliki beberapa kemungkinan
bentuk, yaitu supercoil (SC), sirkular (S), linear
(L). Laju migrasi masing-masing dari yang
paling cepat adalah SC > L > S. Untuk SC dan S,
laju migrasinya lebih ditentukan oleh bentuk
molekul daripada ukurannya.

5. ssDNA (single stranded DNA) lebih cepat

migrasinya dibandingkan dengan dsDNA

(double stranded DNA) yang berukuran sama.
6. Arah medan listrik
Jika arah medan listrik diubah, molekul yang
besar akan membutuhkan waktu yang lebih
lama untuk reorientasi. Elektroforesis dengan
mengubah arah medan listrik secara periodik
dikenal dengan Pulsed Field Gel
Electrophoresis (PFGE).

7. Adanya Ethidium Bromida di dalam gel

Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat

kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar
15%.
8. Komposisi Larutan Bufer
Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan,
maka aliran listrik akan sangat minimal dan
migrasi DNA sangat lambat, sedangkan larutan
bufer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan
panas sehingga aliran listrik akan menjadi
sangat maksimal.

Peralatan & prosedur

elektroforesis DNA / Protein

terdiri dari 2 komponen utama: power supply

sebagai sumber arus listrik dan tangki

elektroforesis.

Untuk menghantarkan listrik, gel diletakkan

dalam suatu bufer (TAE/TBE). Bufer yang sama

digunakan untuk membuat gel.
Untuk pewarnaan digunakan Ethidium Bromida,
suatu zat pewarna yang dapat
menyisip/interkalasi di antara basa DNA pada
dua utas DNA yang berlainan. Ethidium Bromida
(EtBr) akan berpendar di bawah paparan sinar
UV. Pewarna ini dapat ditambahkan pada gel dan
bufer sehingga tidak perlu melakukan staining
sesudah proses elektroforesis.

Untuk memasukkan sampel pada sumur-sumur yang

ada di gel, sampel harus dicampur dengan loading

bufer yang biasanya mengandung pemberat dan
satu/lebih zat warna.
Gliserol/sukrosa berfungsi sebagai pemberat sehingga
sampel dapat tenggelam ke dasar gel dan tidak
melayang keluar.
Zat warna yang digunakan biasanya adalah
bromophenol blue dan/atau xylene cyanol. Fungsinya
adalah untuk menandai kemajuan proses
elektroforesis dan menentukan kapan harus
menghentikan proses.

Untuk penanda ukuran molekul, digunakan potongan-

potongan DNA yang telah diketahui ukurannya.

Untuk menentukan ukuran fragmen DNA pada sampel
dibandingkan mobilitasnya relatif terhadap fragmen
penanda.
Penanda yang paling banyak digunakan adalah DNA
bacteriofag lambda yang dipotong dengan enzim
restriksi HindIII.
Selanjutnya dibuat kurva standar antara log ukuran
fragmen dengan mobilitasnya. Kurva ini dapat
digunakan untuk menentukan ukuran fragmen DNA
pada sampel.