Anda di halaman 1dari 7

LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOL : Elektroforesis Gel Agarose

ACARA II : ELEKTROFORESIS
TUJUAN
1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.
2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.
DASAR TEORI
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu
makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan
ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam
percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara
rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai
cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan
prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada
medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh
medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan
massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif
(anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and
Cummings, 1994).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi
dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar
memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan
untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks
& Andersen, 1999).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati
suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu
campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA
dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida
dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis
yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar

(Davis dkk. 1994).


Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar
(lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari
200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan
berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung
pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan
arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA
itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam
padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan
bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat
bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa
memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan
pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda.
Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi
fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik
pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada
fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA
memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA
merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari
kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi
fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5
sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2
kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman,
2010).
1.
2.
3.
4.

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:


Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
(Birren and Lai, 1993).
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom
Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada
gel (Birren and Lai, 1993).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu
dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis
dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen
homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom,
DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik

atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan
tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme
atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi
di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam,
menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan
aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR,
mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan
jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994;
Fairbanks and Andersen, 1999).
Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi
atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien
karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa.
Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk
(ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit
diinterpretasikan (Tarigan, 2011).
PEMBAHASAN
Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan
mampu untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan
Protein), yaitu metode elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat
mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum ini.
Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan
dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA
yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui
suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose
tersebut (Yuwono, 2005).
Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis
horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam
elektroforesis yaitu:
1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan
tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung
partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan,
mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau
poliakrilamid

(Biosciences, 1999).
Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan
menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang
diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk
analisais DNA.
Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses
berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan
dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga
dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu,
dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki
kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel
ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).
Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%. Praktikan
tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten
praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara
mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan
di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan
dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan
sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL
yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan
kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam
ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running
buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan
pemanasan (Gardner dkk, 1991).
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki
fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama
proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru
(Magdeldin, 2012).
Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA
sebanyak 4l dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3l pada sumur/well yang telah
dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan
bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan
harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak
meluber ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung
gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA
yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi

pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut
merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya
jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki
delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993;
Martin, 1996).
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan
arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt
dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat
dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke
tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat
dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose
nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan
warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994).
Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose
hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini
berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel
Doc. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang
lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan
menggunakan Gel Doc.
Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil
elektroforesis. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu
UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret
hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat
bantuan software (Davis dkk, 1994).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1.

Ukuran Molekul DNA


Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan
yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.

Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar
untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih
rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.

Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan
dengan yang berbentuk bulat.

4.

Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas
muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan
yang rendah.

5.

Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.

Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul
DNA.

7.

Larutan buffer elektroforesis


Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA
(Wolfe, 1993).
Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak
menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah
migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini
kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di
isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit kesalahan dalam
penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses
elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak
mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan
faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai
DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu, dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan
sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu penyimpanan.
Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu
produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi
linier.

KESIMPULAN
1. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis
elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.
2. Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan
negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui
matriks membran gel agarose.
3. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat
didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan
tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan
kurva regresi linier.

4. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel

adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori
gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat
muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran
fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan
produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.
DAPUS
Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences : USA.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press,
Inc., San Diego.
Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular Biology,
vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed. Appleton &
Lange, Norwola.
Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing
Company, New York.
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed. John Wiley &
Sons Inc., New York.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing Co. :
Columbus, Ohio.
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in
agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).
Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek
: Bogor.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher :
Rijeka, Croatia.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.
Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide
Sorbent
Assay
(PCR-ELOSA)
untuk
Deteksi
Agen
Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company,
Belmont.