Gel Electrophoresis Prinsip and Basic

Chapter 2

Disusun Oleh :

Nama : Rudi Hadimulyono

NPM : 5217001

PROGRAM ALIH JENJANG AHLI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

TAHUN AKADEMIK 2017/2018
 Gel Elektroforesis dan Aplikasinya

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik
dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik
dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,
misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah
muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan
ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris
bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Ḟ = qḖ

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah
medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen DNA

Gel elektoforesis

Jaringan gel bertekanan tinggi memiliki banyak sifat yang diinginkan untuk
elektroforesis. Memungkinkan untuk berbagai format eksperimental mekanis stabil
seperti elektroforesis Horizontal/ Vertikal pada gel lempengan atau elekroforesis pada
tabung atau kapiler

Jenis gel

Terdapat lima jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA
yaitu gel poliakrilamida, gel alkalin agarosa, gel agarosa, pati, dan cellulose acetat.
Gel poliakrilamida berfungsi untuk menganalisis hasil ekstensiprimer. Gel alkalin
agarosa berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. Gel
agarosa berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk
fraksi RNA pada ukuran standar, pati dan cellulose acetat digunakan untuk
memisahkan protein (Amersham biosciences 1999 : 6).

Pewarnaan gel

Salah satu aspek terpenting teknik elektroforesis adalah pewarnaan. Setelah

molekul sampel dipisahkan dalam matriks gel, perlu untuk memvisualisasikan posisi
mereka. Hal ini dicapai dengan pewarnaan dengan agen yang tepat untuk sampel.

Persiapan dan pelepasan sel agarosa

Peralatan dan perlengkapan yang diperlukan melakukan elektroforesis gel

agarose relatif sederhana dan meliputi :

 Ruang elektroforesis dan catu daya

 Baki casting gas tersedia dalam beberapa ukuran dan terdiri dari plastik UV
Transparan, ujung terbuka baki ditutup dangan pita sementara gel
dimasukkan,lalu dilepaskan sebelum elektroforesis

 Sample

 Peyangga elektroforesis biasanya Tri-asetat-EDTA (TAE) atau Tris-

borote=EDTA (TBE)

 Masukkan peyangga yang bersifat padat (misaln gliserol) sehingga

memungkinkan sampel “jatuh” kedalam sumur sampel, dan satu atau dua
pewarna pelacakan, yang bermigrasi kedalam gel dan memungkinkan
pemantauan visual sejauh mana elektroforesis berlangsung

 Pewarnaan molekul DNA mudah divisualisasikan dibawah lampu ultraviolet

bila diberi elektroda dengan adanyaetidium emired ekstrinsik bromida.
Sebagai alternatif, asam nukleat dapat diwarnai setelah pemisahan
elektroforesis dengan merendam gel dalam larutan etidium bromida. Ketika
diselingi menjadi DNA double strand, fluoresensi molekul ini meningkat
sangat. Hal ini juga memungkinkan untuk mendeteksi DNA dengan fluida
ekstrinsik !-anilino 8-naftalena sulfonat,

CATATAN : ethidium bromide adalah mutagen yang harus dikerjakan

menggunakan sarung tangan kimia, gunakan kaca mata saat mengamati DNA
pada Transilluminator untuk mencegah kerusakan mata dari sinar UV

Elektroforesis menggunakan gel poliakrilamida dilakukan pada medan

gerak vertikal. Pembuatan gel poliakrilamida lebih sulit daripada sel agarosa
karena gel poliakrilamida memiliki resolusi tinggi, membutuhkan biaya yang
mahal, preparasinya lama, laju pemisahan fragmen lebih lambat serta bersifat
toksik sehingga harus lebih hati-hati dalam penangananya. Namun demikian gel
poliakrilamida dapat menampung jumlah DNA yang lebih besar daripada gel
agarosa.

Gel poliakrilamida sering digunakan untuk uji kualitatif protein,

meskipun juga digunakan untuk uji kualitatif DNA. Resolusi dalam memisahkan
DNA lebih tinggi jika dibandingkan gel agarosa sehingga panjang molekul DNA
yang berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi. Elektroforesis gel
poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan ukuran 5-200 kDa, sedangkan
untuk pemisahan fragmen DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit
yaitu antara 5-500 bp.

Adapun gel poliakrilamid lebih murni serta dapat digunakan untuk

aplikasi lainnya. Namun demikian, laju pemisahan fragmen lebih lambat
dibandingkan menggunakan gel agarosa dan membutuhkan persentase
konsentrasi yang lebih banyak dan voltase yang digunakan lebih tinggi.

Gel polakrilamida dikenal penggunaan SDS pada separasi protein dengan

Poliacrylamid Gel Elektrophoresis (PAGE) kegunaan SDS adalah untuk
membuat bentuknya menjadi linier (tidak memiliki lagi struktur sekunder, tersier
atau quartener), gel poliakrilamida tidak padat melainkan mempunyai saluran
labirin pada bangunan serat/gel-nya, ketika kumpulan protein dengan ukuran
 berbeda bergerak (dari minus ke positif) maka protein dengan ukuran lebih kecil
akan lebih cepat.

Tahapan prosedur elektroforesis gel poliakrilamid

 Pembuatan poliakrilamid (buffer + akrilamid + bis-akrilamid + Ammonium

persulfat + TEMED)

 Pencetakan gel

 Running Elektroforesis

 Perwarnaan (staining) dengan Coomassie Blue atau persk (silver stining) atau
kombinasi keduanya

 Penampakan protein band Coomassie Blue berwarna biru, dan silver staining
berwarna coklat-hitam

REFLEKSI DIRI

setelah membaca jurnal buku ini, saya menjadi tahu manfaat elektroferesis gel dan
masing – masing kegunaanya.

Gel agarosa memiliki kelebihan diantaranya :

 Teknik yang digunakan sederhana

 Preparasi gel lebih cepat dilakukan karena pembuatan gel agarosa lebih mudah
dan bersifat non toksik

 Laju pemisahan lebih cepat sehingga fragmen DNA lebih cepat

 Dapat memisahkan campuran potongan DNA sesuai denga ukurannya.

Gel agarosa memiliki kekurangan yaitu :

 Lebih mudah rusak

 Bans yang dihasilkan dapat berkabut dan menyebar agak jauh. Bans adalah pita
yang dihasilkan dari proses elektroforesis.

 Bila voltase yang digunakan terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan
merusak bentuk pita DNA.
Kelebihan gel poliakrilamida
 Dapat menampung jumlah DNA yang lebih besar daripada gel agarosa.
 Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi jika dibandingkan gel agarosa .
 Kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu panjang
basa dalam 500 panjang basa.
 DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat
digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus.
Kekurangan gel poliakrilamida
 Pembuatannya lebih sulit dibandingkan gel agarosa karena biasanya digunakan
poliakrilamida dengan resolusi yang tinggi. Namun gel poliakrilamida mampu
menampung jumlah DNA yang lebih besar.
 Membutuhkan biaya yang lebih mahal
 Bersifat toksik : poliakrilamida adalah polimer yang terbentuk dari subunit
akrilamida, akrilamida dibutuhkan untuk digunakan dalam percobaan
laboratorium yang baik untuk menghindari terjadinya keracunan karena itu
berupa neurotoksin. Poliakrilamida tidak beracun, tetapi akrilamida
nonpolimerisasai dapat ditunjukkan dalam polimerisasi akrilamida. Oleh karena
itu direkomendasikan untuk menanganinya dengan suatu ketetapan.
 Laju pemisahan fragmen lebih lambat dibandingkan menggunakan gel agarosa
dan menggunaka voltase lebih tinggi.