LAPORAN PRAKTIKUM

GENETIKA REKOMBINAN

ACARA PRAKTIKUM KE : IV

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE

Nama : Muhammad Ilham Jasir

NIM : 24020118120028

Kelompok :4

Hari, tanggal : Kamis, 1 Oktober 2020

Asisten : Rizayu Winarsari

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

2020
 ACARA IV

ISOLASI DNA

I. TUJUAN
I.1. Mampu mengetahui teknik pemisahan asam nukleat dengan metode elektroforesis gel
agarose
I.2. Mampu mengetahui cara pembuatan gel agarose
I.3. Mampu mengetahui dan membaca hasil visualisasi elektroforesis gel agarose
II. TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Elektroforesis
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis
kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam
medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh
bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Molekul terlarut dalam medan
listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan
massa. Sebagai contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama,
molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode, jika arus
listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka
komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi. Kecepatan molekul yang
bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Oleh karena itu,
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam
nukleat) (Magdeldin, 2012).
Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau auto
radiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Dasar elektroforesis
adalah pembentukan suatu ke tidak homogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang
sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik
isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat
dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur
kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan (Aditia, 2014).
II.2. Gel Agarose
Gel Agarose digunakan untuk memisahkan (separation), dan purifikasi DNA. Makin
besar konsentrasi gel, maka makin kecil ukuran fragment DNA yang bisa dipisahkan.
Ada 2 komponen dasar untuk membuat Gel Agarose, yaitu agarose powder, dan buffer.
Kedua komponen ini harus dicampur dan dipanaskan terlebih dahulu agar homogen.
Elektroforesis gel agarose merupakan metode standar pemisahan dan pemurnian fragmen
DNA. Kelebihan dari gel ini lebih mudah, sederhana dan laju pemisahannya lebih cepat
membentuk fragmenfragmen dan tidak bersifat toksik. Hanya saja kelemahannya gel ini
memiliki sensitifitas tinggi dan mudah rusak sehingga memerlukan ketelitian dan kehati-
hatian pada proses pengerjaannya. (Harahap, 2018).
Gel agarosa dalam elektroforesis memiliki viskositas tinggi. Produk PCR juga dapat
di identifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.
Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel
tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat dan untai yang
besar diantara gel menunjukkan hasil positif (Yusuf, 2010).
II.3. Loading Buffer
Loading buffer atau loading dye dibuat dari 0.25% bromophenol blue dan 40% (w/v)
sukrosa dalam dH2O. Loading buffer diperlukan dalam elektroforesis gel agarosa
terutama saat proses running gel. Running gel dilakukan dengan mencampurkan DNA
hasil amplifikasi lewat proses PCR dengan loading buffer yang memiliki fungsi
membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses
elektroforesis telah berlangsung.DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung
gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Riyantini et al.,
2014).
Sampel DNA yang telah diamplifikasi dianalisis dengan melakukan elektroforesis
menggunakan gel agarosa. Gel agarose 1,4% dibuat dengan mencampurkan bubuk
agarose sebanyak 0,56 g dengan TBE 40 ml (Tris-Borate ETDA). Gel agarosa direndam
secara sub marine atau terendam seluruhnya dalam running buffer yaitu TBE. 10µl DNA
hasil PCR dan penanda berat molekul yang terdiri dari 5µl buffer pemuat (Loading
buffer) serta 3µl loading dye dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Voltase yang
digunakan untuk proses elektroforesis adalah 75 volt, dengan kuat arus 100 mA selama
90 menit (Riyantini et al., 2014).
III. METODE
3.1 Alat

3.1.1. Laptop

3.1.2. Alat tulis

3.1.3. Buku penuntun praktikum

3.1.4. Laporan sementara

3.1.5. Mesin elektroforesis

3.1.6. Sumber listrik

3.1.7. Sisir

3.1.8. Mikropipet dan tip

3.1.9. Gelas ukur

3.1.10. Labu erlenmeyer

3.1.11. UV transluminator

3.2 Bahan

3.2.1. Agarosa

3.2.2. Buffer elektroforesis (TAE/TBE/TPE)

3.2.3. Loading dye

3.2.4. Ethidium Bromide (EtBr)

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Penentuan Konsentrasi Agarosa

1. Fragmen DNA berukuran besar (10‐35 kb) digunakan agarose

dengan konsentrasi 0.6 – 0.8&, sedangkan fragmen DNA

berukuran lebih kecil yaitu 0.2 – 10 kb → agarose dengan

konsentrasi sekitar1– 1.5 %.

3.3.2 Pembuatan Gel Agarosa

 1. Tentukan konsentrasi agarose yang diinginkan, misal dilakukan

pada gel agarose 1% dengan cara menimbang 0,3 g agarose

dan dimasukkan ke dalam 30 ml buffer TAE.

2. Agarose dilarutkan dengan menggunakan microwave oven

selama 1 menit

3. Setelah agarose larut, tambahkan ethidium bromide dengan

konsentrasi 5μl/100 ml sebanyak 1,5 μl. EtBr dicampur dengan

gel panas hingga merata.

4. Biarkan gel agak dingin (50‐60°C). Sambil menunggu, siapkan

cetakan elektroforesis dan pasang sisir pada elektroforesis.

5. Gel kemudian dituang dalam cetakan (gel tray) yang dipasang

sisir (comb) untuk mencetak sumuran (well)

6. Biarkan Gel hingga memadat selama kurang lebih 30 menit

7. Lepaskan sisir pelan‐pelan dan gel siap digunakan.

3.3.3 Running Gel

1. Setelah gel memadat diambil sisirnya, lalu dimasukkan ke

dalam tangki elektroforesis yang berisi buffer 0.5 X TAE

2. Sampel DNA yang akan dielektroforesis dicampur dengan 1x

konsentrasi loading buffer

3. Sampel yang telah ditambah loading buffer dimasukkan dalam

sumuran pada gel agarose

4. Tangki elektroforesis dihubungkan dengan power supply

kemudian

hidupkan dengan voltage konstan

5. Setelah migrasi DNA berjalan cukup jauh, matikan power supply

IV. HASIL PENGAMATAN

4.1 Studi Kasus 1

Secara umum kualitas DNA yang baik dapat dilihat dari hasil running
elektroforesisnya yaitu dimana DNA nya terlihat jelas atau tebal dan tidak ada smear.
Jika dilihat kembali dari studi kasus disitu terlihat gambar A terlihat DNA nya lebih tebal
dibandingkan dengan yang B. Tetapi A ada smear yang jelas, sedangkan untuk yang B
DNA nya terlihat jelas tapi sedikit tipis dan cenderung tidak ada smear. Oleh karena itu,
yang lebih baik kualitasnya yaitu gambar B.
Kuantitasnya, pita DNA yang tebal dan mengumpul (tidak menyebar)
menunjukkan konsentrasi yang tinggi dan DNA total yang diekstrak dalam kondisi utuh.
Sedangkan, pita DNA yang terlihat menyebar menunjukkan adanya ikatan antar molekul
DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi berlangsung. Oleh karena itu, pada gambar
A kuantitas (konsentrasi) DNA nya lebih tinggi dibandingkan pada gambar B karena
pada gambar A lebih terlihat tebal dibandingkan dengan gambar B.
4.2 Studi Kasus 2

Berdasarkan tabel pengamatan terdapat nilai konsentrasi tertinggi pada sampel 1

(K1K) yaitu 1.870 dan nilai absorbansi tertinggi pada sampel 4 (P2K) yaitu 1.671. Hal ini
menunjukan dari keempat sampel, bahwa kuantitas DNA terbaik jatuh kepada sampel ke
4 dengan rasio seniai 1,671 dan kualitas DNA terbaik jatuh kepada sampel 1 dengan
konsentrasi tertinggi 1,870.
Hal ini dikarenakan pada sampel 1 terlihat pita tebal yang tegas dengan smear
yang sedikit dibawahnya. Nilai A260 K1K yaitu 0,748 dan nilai A280 yaitu 0,506 yang
mana nilai A260 ini akan mempengaruhi nilai konsentrasi DNA sedangkan nilai A280
merupakan nilai yang menandakan kontaminan.
V. PEMBAHASAN
Praktikum Genetika Rekombinan acara IV yang berjudul “Elektroforesis Gel Agarose”
dilaksanakan pada hari Kamis, 1 Oktober 2020 secara daring melalui Microsoft Teams.
Tujuan dari praktikum ini adalah mampu mengetahui teknik pemisahan asam nukleat dengan
metode elektroforesis gel agarose, mampu mengetahui cara pembuatan gel agarose dan
mampu mengetahu dan membaca hasil visualisasi elektroforesis gel agarose. Alat yang
digunakan yaitu laptop atau handphone, buku panduan praktikum, alat tulis.
Prinsip elektroforesis gel agarose adalah pemisahan dan pemurnian fragmen DNA dengan
menggunakan medan listrik. Hal ini sesuai dengan pendapat Pratami (2016) bahwa prinsip
elektroforesis yaitu pemisahan molekul dalam suatu campuran dengan menggunakan medan
listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak dengan kecepatan yang ditentukan oleh
rasio muatan dan massa. Prinsip elektroforesis gel agarose yaitu pemisahan dan pemurnian
fragmen DNA. Hukum Coulomb menjadi prinsip dasar metode pemisahan elektroforesis yaitu
gaya pada salah satu titik muatan berbanding lurus dengan besar muatannya. Medan listrik
merupakan efek yang dihasilkan oleh muatan listrik seperti elektron, ion atau proton, dalam
ruangan yang ada disekitarnya.
Berdasarkan studi kasus nomor satu, hasil DNA sampel gambar A lebih menunjukan
kuantitas yang lebih baik. Hal ini dikarenakan pada gambar sampel A terlihat pita DNA yang
lebih tebal. Pita DNA yang tebal menunjukkan tingginya konsentrasi yang didapat, walaupun
pada gambar sampel A terdapat smear. Hasil pada gambar A dapat terjadi smear pada pita-
pita sampel dikarenakan kemurnian DNA yang masih kurang, karena masih terdapatnya
protein atau RNA sehingga pita DNA tidak terlihat jernih. Menurut Iqbal (2016), hasil isolasi
DNA menggunakan Kit Wizard Genomic DNA Purification mampu menghasilkan DNA
genom yang tebal atau berukuran besar, serta pita DNA genom yang terbentuk sangat jelas.
Meskipun pita DNA genom terbentuk dengan baik tetapi masih terdapat smear yang terlihat
diatas dan dibawah pita DNA genom. Konsentrasi DNA yang optimal pada buah jeruk secara
sederhana dengan cara buah jeruk diblender. Kemudian ditambahkan garam, air mineral dan
detergen dalam wadah. Lalu dihomogenkan sampai tercamur rata beserta sampel buah.
Kemudian dilakukan penyaringan menggunakan saringan the. Hasil saringan dipindahkan ke
tabung kaca serta ditambahkan alcohol 70% secara perlahan. Ditunggu beberapa menit sampai
terbentuk 2 lapisan berbeda. Bagian lapisan atas berupa benang putih Kit Wizard Genomic
DNA Purification memiliki nilai konsentrasi paling tinggi dibanding dengan metode lainnya.
Nilai konsentrasi DNA yang tinggi ini dihasilkan karena proses isolasi menggunakan Kit
Wizard Genomic DNA Purification melibatkan tahapan pemurnian dan pencucian DNA.
Sedangkan, untuk kualitas sampel DNA yang memiliki kualitas baik adalah pada gambar B.
Hal ini dikarenakan hasil pada gambar B tidak terlihat smear, pita DNA yang terlihat pada
gambar B juga jelas, tetapi pita DNA yang didapat memang tipis. Menurut Iqbal (2016), hasil
isolasi DNA dengan menggunakan metode isolasi DNA thermal lysis menghasilkan jumlah
DNA genom yang relatif sedikit. Elektroforesis DNA genom thermal lysis menunjukkan hasil
pita genom tipis dan terlihat samar-samar. Hal ini karena penggunaan PBS (Phospat Buffer
Saline) dan kombinasi inkubasi suhu tinggi dapat mengisolasi DNA virus.
Berdasarkan studi kasus nomor dua, kualitas DNA terbaik terdapat pada sampel 1,
dimana pada sampel 1 terlihat pita DNA yang tebal dan terdapat sedikit smear dibawahnya
dengan nilai A260 yaitu 0.748 dan nilai A280 yaitu 0.506. Ketebalan ini menentukan nilai
konsentrasi nya. Semakin tinggi nilai konsentrasinya maka akan semakin tebal pita DNA.
Selain itu, nilai konsentrasinya paling tinggi yaitu 1,870 mikrogram/mikroliter. Kuantitas
DNA terbaik terdapat pada sampel 4, karena pada sampel tersebut tidak terlihat smear. Smear
menentukan nilai kemurnian suatu DNA yang diisolasi. Semakin tinggi nilai kemurnian maka
semakin bagus kualitasnya. Selain itu, nilai rasio absorbansinya yaitu 1,671 paling mendekati
1,8. Hal ini sesuai dengan pendapat Fatchiyah (2011) bahwa pita ganda DNA dapat menyerap
cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya
pada 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan cahaya UV, sehingga kemurnian DNA dapat
diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280
(Å260/Å280) dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. M. Iqbal et al. (2016)
menjelaskan bahwa nilai A260 ini akan mempengaruhi nilai konsentrasi DNA sedangkan nilai
A280 merupakan nilai yang menandakan kontaminan. Pita DNA yang menunjukkan adanya
smear disebabkan karena masih terdapatnya kontaminan seperti protein atau terbawanya sisa
larutan pada proses isolsi. Hal tersebut sesuai dengan Mulyani et al. (2011) bahwa smear
tersebut merupakan sisa dari larutan-larutan yang masih terbawa selama proses isolasi atau
juga dapat berupa DNA yang terdegredasi pada proses isolasi.
VI. KESIMPULAN

6.1 Teknik pemisahan asam yaitu berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel
bermuatan yang akan bergerak ke arah elektroda yang memiliki muatan berlawanan di
bawah pengaruh medan listrik.

6.2 Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer yang dibantu dengan
pemanasan, gel agarosa yang cair dituang ke atas. Sebelum gel agarose mendingin dan
memadat, pada ujung gel tersebut dibuat lubang-lubang dengan menggunakan lembaran
Perspex tipis yang dibentuk menyerupai sisir yang ditancapkan pada salah satu ujung gel
agarosa yang masih cair, sehingga saat waktu gel memadat dan sisirnya diambil terbentuk
lubang-lubang kecil yang berfungsi untuk memasukan sampel molekul DNA.

6.3 Berdasaran hasil pengamatan, studi kasus 1 didapatkan hasil bahwa kuantitas DNA yang
terbaik yaitu pada gambar A karena terlihat dari pita DNA yang tebal dengan konsentrasi
yang tinggi. Kuantitas DNA yang terbaik yaitu gambar B karena hasil pita DNA yang tipis
namun terlihat jelas dan tidak ada smear. Studi kasus 2 didapatkan kuantitas DNA yang
terbaik yaitu pada sampel 1 karena memiliki nilai konsentrasi tertinggi sebesar 1,870 μg/μl
diantara sampel lain.sedangkan kuantitas DNA yang terbaik yaitu pada sampel 4 karena
memiliki nilai kemurnian tertinggi, yaitu 1,671.
 DAFTAR PUSTAKA

Aditia, L. 2014. Laporan Praktikum Elektroforesis DNA. UIN Alauddin Makassar, Makassar.

Fatchiyah, 2011. Pelatihan analisis fingerprinting DNA tanaman dengan metode RAPD. Modul.
Laboratorium sentral ilmu hayati Universitas Brawijaya, Malang.

Harahap, Muhammad Ridwan. E;ektroforesis : Analisis Elektronika Terhadap Biokmia

Genetika. Jurnal Ilmu Pendidikan Teknik Elektro. Vol.2 No.1 hal 21-26.

Iqbal, M., Buwono, I.D. and Kurniawati, N., 2016. Analisis Perbandingan Metode Isolasi DNA
Untuk Deteksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) Pada Udang Vaname (Litopenaeus
vannamei). Jurnal Perikanan Kelautan, 7(1): hal 54-65.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electroforesis-Principles and Basics. In Tech Publicher, Rijeka.

Mulyani, Y., A. Purwanto., I. Nurruhwati. 2011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA
untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV) Pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjadjaran. Jurnal Akuatika, 2(1): hal 1-16.

Pratami, L. 2016. Uji Palsmid Bradyrhizobium japanicum Terhadap Lima Jenis Pestisida
Sistemik. Skripsi. Universitas Muhammadiyah Malang.

Riyantini, I., Yuniar, M., dan Mochamad, U.K.A. 2014. Hubungan Filogenetik Molekuler
Beberapa Jenis Mangrove di Pulau Penjarangan, Ujung Kulon, Provinsi Banten. Jurnal
Akuatika, 5(1): 63-70.

Yusuf. 2010. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR). Jurnal Saintek Vol 5, No 6.

 HALAMAN PENGESAHAN

Lumajang,1 Oktober 2020

Mengetahui

Asisten Praktikan

Rizayu Winarsari Muhammad Ilham Jasir

24020117130088 24020118120028